Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

4.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/63509

⸱

11. Februar 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Zusammenfassung

Zebrafische weisen ein bemerkenswertes lebenslanges Wachstum und regenerative Fähigkeiten auf. Zum Beispiel unterstützen spezialisierte Stammzellnischen, die während der Embryogenese etabliert wurden, das kontinuierliche Wachstum des gesamten visuellen Systems, sowohl im Auge als auch im Gehirn. Koordiniertes Wachstum zwischen der Netzhaut und dem optischen Tectum gewährleistet eine genaue retinotopische Kartierung, wenn neue Neuronen in den Augen und im Gehirn hinzugefügt werden. Um zu untersuchen, ob retinale Axone entscheidende Informationen für die Regulierung des Verhaltens von tektalen Stamm- und Vorläuferzellen wie Überleben, Proliferation und / oder Differenzierung liefern, ist es notwendig, innervierte und denervierte tektale Lappen innerhalb desselben Tieres und zwischen Tieren vergleichen zu können.

Die chirurgische Entfernung eines Auges aus lebenden Larvenzebrafischen mit anschließender Beobachtung des optischen Tectums erreicht dieses Ziel. Das begleitende Video zeigt, wie man Larven betäubt, Wolframnadeln elektrolytisch schärft und damit ein Auge entfernt. Als nächstes wird gezeigt, wie man Gehirne aus festsitzenden Zebrafischlarven seziert. Schließlich bietet das Video einen Überblick über das Protokoll für die Immunhistochemie und eine Demonstration, wie gefärbte Embryonen in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt für die Mikroskopie gemountet werden können.

Einleitung

Ziel dieser Methode ist es zu untersuchen, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums, des visuellen Verarbeitungszentrums im Zebrafischgehirn, beeinflusst. Durch Entfernen eines Auges und anschließenden Vergleich der beiden Seiten des optischen Tektums können tektale Veränderungen innerhalb derselben Probe beobachtet und normalisiert werden, was einen Vergleich zwischen mehreren Proben ermöglicht. Moderne molekulare Ansätze in Kombination mit dieser Technik werden Einblicke in die Mechanismen liefern, die dem Wachstum und der Entwicklung des visuellen Systems sowie der axonalen Degeneration und Regeneration zugrunde liegen.

Sensorische Systeme - visuelle, auditive und somatosensorische - sammeln Informationen von externen Organen und leiten diese Informationen an das zentrale Nervensystem weiter, wodurch "Karten" der äußeren Welt im Mittelhirn erzeugtwerden 1,2. Das Sehen ist die dominierende sensorische Modalität für fast alle Wirbeltiere, einschließlich vieler Fische. Die Netzhaut, das Nervengewebe im Auge, sammelt Informationen mit einem neuronalen Schaltkreis, der hauptsächlich aus Photorezeptoren, bipolaren Zellen und retinalen Ganglienzellen (RGCs), den Projektionsneuronen der Netzhaut, besteht. RGCs haben lange Axone, die ihren Weg über die innere Oberfläche der Netzhaut zum Sehnervenkopf finden, wo sie faszikulieren und gemeinsam durch das Gehirn wandern und schließlich im visuellen Verarbeitungszentrum im dorsalen Mittelhirn enden. Diese Struktur wird bei Fischen und anderen Nicht-Säugetierwirbeltieren als optisches Tectum bezeichnet und ist homolog zum Colliculus superior bei Säugetieren3.

Das optische Tectum ist eine bilateral symmetrische Mehrschichtstruktur im dorsalen Mittelhirn. Bei Zebrafischen und den meisten anderen Fischen erhält jeder Lappen des optischen Tektums visuelleEingaben ausschließlich vom kontralateralen Auge, so dass der linke Sehnerv im rechten Tektallappen und der rechte Sehnerv im linken Tektallappen 4 endet (Abbildung 1). Wie sein Gegenstück bei Säugetieren, der Colliculus superior, integriert das optische Tectum visuelle Informationen mit anderen sensorischen Eingaben, einschließlich Vorsprechen und Somatosensation, und steuert Verschiebungen der visuellen Aufmerksamkeit und Augenbewegungen wie Sakkaden 1,5,6. Im Gegensatz zum Colliculus superior des Säugetiers erzeugt das optische Tectum jedoch kontinuierlich neue Neuronen und Glia aus einer spezialisierten Stammzellnische in der Nähe der medialen und kaudalen Ränder der tektalen Lappen, der sogenannten tektalen Proliferationszone7. Die Aufrechterhaltung proliferativer Vorläufer im optischen Tectum und anderen Regionen des zentralen Nervensystems trägt zum Teil zu der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit bei, die in Zebrafisch8 dokumentiert ist.

Frühere Arbeiten, die das Gehirn von blinden oder einäugigen Fischen untersuchten, ergaben, dass die Größe des optischen Tektums direkt proportional zur Menge der retinalen Innervation ist, die sie erhält 9,10,11. Bei erwachsenen Höhlenfischen, deren Augen in der frühen Embryogenese degenerieren, ist das optische Tectum merklich kleiner als bei eng verwandten, gesichteten Oberflächenfischen9. Die Degeneration der Höhlenfischaugen kann blockiert werden, indem die endogene Linse während der Embryogenese durch eine Linse von einem Oberflächenfisch ersetzt wird. Wenn diese einäugigen Höhlenfische bis ins Erwachsenenalter aufgezogen werden, enthält der innervierte Tektallappen etwa 10% mehr Zellen als der nicht innervierte Tektallappen9. In ähnlicher Weise war bei Larvenkillifischen, die mit chemischen Behandlungen inkubiert wurden, um Augen unterschiedlicher Größe innerhalb desselben Individuums zu erzeugen, die Seite des Tektums mit mehr Innervation größer und enthielt mehr Neuronen10. Beweise aus Experimenten zur Quetschung des Sehnervs an erwachsenen Goldfischen deuten darauf hin, dass die Innervation die Proliferation fördert, wobei die Proliferation der tektalen Zellen abnimmt, wenn die Innervation gestört ist11.

Mehrere neuere Berichte, die diese klassischen Studien bestätigen und erweitern, liefern Daten, die darauf hindeuten, dass die Proliferation als Reaktion auf Innervation zumindest teilweise durch den BDNF-TrkB-Signalweg12,13 moduliert wird. Es bleiben viele offene Fragen zum Wachstum und zur Entwicklung des optischen Tektums, einschließlich der Frage, wie ein sich entwickelndes sensorisches System mit Verletzungen und Axondegeneration fertig wird, welche zellulären und molekularen Signale es ermöglichen, dass der Netzhauteintrag das Wachstum des optischen Tektums reguliert, wann diese Mechanismen aktiv werden und ob die innervationsbedingte Proliferation und Differenzierung es der Netzhaut und ihrem Zielgewebe ermöglicht, Wachstumsraten zu koordinieren und eine genaue retinotopische Kartierung zu gewährleisten. Darüber hinaus gibt es viel größere Fragen zur aktivitätsabhängigen Entwicklung, die durch die Befragung des visuellen Systems des Zebrafisches mit chirurgischen Ansätzen wie dem unten beschriebenen beantwortet werden können.

Um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die neuronale Aktivität, insbesondere durch visuellen Input, das Überleben und die Proliferation von Zellen verändert, vergleicht der beschriebene Ansatz direkt innervierte und denervierte tektale Lappen (Abbildung 1) innerhalb einzelner Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Dokumentation der RGC-Axondegeneration im optischen Tectum und die Bestätigung, dass die Anzahl der mitotischen Zellen mit der Innervation korreliert.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Skizzen von Zebrafischlarven vor und nach einseitiger Augenentfernung . (A) Zeichnung von 5 dpf-Larven unter einem Seziermikroskop. Jede Larve ist in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt eingebettet und seitlich ausgerichtet, bevor eine Wolframnadel mit einer scharfen, hakenförmigen Spitze verwendet wird, um das nach oben gerichtete Auge (in diesem Beispiel linkes Auge) herauszuholen. (B) Zeichnung der dorsalen Ansicht einer 9 dpf Larve, die aus der in A dargestellten Operation resultiert. Nur drei hochschematisierte RGC-Axone aus dem rechten Auge sind defaszikulierend und verbinden sich mit Neuronen im linken tektalen Lappen. Abkürzungen: dpf = Tage nach der Befruchtung; dps = Tage nach der Operation; RGC = retinale Ganglienzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Methoden in diesem Papier wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und der Genehmigung der Institutional Animal Care and Use Committees des Reed College und des University College London durchgeführt. Weitere Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Zebrafischstämmen finden Sie in der Materialtabelle .

1. Bereiten Sie Materialien und Werkzeuge vor

  1. Machen Sie Lösungen.
    1. Machen Sie Embryo-Medium (E314), indem Sie einen 60-fachen Stamm verdünnen (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-Dihydrat und 20 mMMgCl 2-Hexahydrat in entionisiertem Wasser, autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert). Fügen Sie 160 ml 60x E3 zu 10 L deionisiertem Wasser hinzu. Bei Raumtemperatur lagern.
    2. Machen Sie 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) in E3. Lösen Sie 1 g LMP-Agarose in 100 ml E3 auf, indem Sie in der Mikrowelle für 1-2 min bei hoher Leistung sieden. Aliquot geschmolzene Agarose in 1,7 ml Mikrofugenröhrchen und lagern bei 4 ° C. Kochen Sie in einem Wasserbad und halten Sie es in einem 40 ° C-Wärmeblock, wenn es zum Einbetten bereit ist.
    3. Stellen Sie Marc's Modified Ringers (MMR15) isotonische Lösung her, indem Sie einen 10-fachen Stamm verdünnen (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl2-Dihydrat, 50 mM HEPES, pH-Wert auf 7,5 mit 10 M NaOH eingestellt, dann autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert). Fügen Sie 10 ml 10x MMR zu 90 ml entionisiertem Wasser hinzu.
  2. Gießen Sie die Sylgard-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers ein, damit sie mehrere Tage einwirken und trocknenkönnen 16.
  3. Wolframnadeln elektrolytisch schärfen (Protokoll modifiziert von 17).
    1. Bereiten Sie zunächst eine 10% (w/v) KOH-Lösung vor, indem Sie 200 ml deionisiertes Wasser in ein Glas mit breitem Mund und Schraubdeckel geben. Langsam 20 g KOH-Pellets einrühren.
      HINWEIS: Diese ätzende Lösung ist sehr exotherm. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz und rühren Sie die Lösung in der Kapuze um.
    2. Schneiden Sie einen 2-3 cm langen Wolframdraht ab und stecken Sie ihn in den Nadelhalter.
    3. Schließen Sie die Kathoden- und Anodendrähte an die Stromversorgung an. Befestigen Sie die Krokodilklemme am Ende des Kathodendrahtes an einer teilweise begradigten Büroklammer und setzen Sie die Büroklammer in die KOH-Lösung ein und befestigen Sie sie an der Seite des Glases.
    4. Als nächstes befestigen Sie den Krokodilklemme des Anodendrahtes am Hals des Nadelhalters. Schalten Sie die Stromversorgung ein (auf ~ 20 V) und tauchen Sie den Wolframdraht in die KOH-Lösung, wobei Sie den Draht in einem Winkel aus der Lösung ziehen, um den Draht elektrolytisch in eine feine Spitze zu schärfen.
      HINWEIS: Blasen werden aus der Büroklammer kommen, während die Reaktion fortschreitet.
    5. Überprüfen Sie die Nadelspitze unter dem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass sie scharf genug ist.
    6. Spülen Sie die Nadel mit entionisiertem Wasser ab, um alle KOH-Rückstände zu entfernen. Machen Sie mehrere Nadeln im Voraus und bewahren Sie sie bis zu den Larvenoperationen und -dissektionen auf.
  4. Erstellen Sie gekammerte Objektträger für die Abbildung von Zebrafischproben mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop.
    1. Erhalten Sie Glasmikroskopobjektträger und zweiteiliges Epoxidharz (siehe Materialtabelle). Mischen Sie das Epoxidharz gemäß den Anweisungen auf der Verpackung und malen Sie dicke Ringe oder Rechtecke auf die Glasobjektträger. Lassen Sie die Objektträger vor Gebrauch mindestens 24 Stunden in der Haube aushärten und trocknen.

2. Embryonenentnahme und -aufzucht

  1. Paaren Sie erwachsene männliche und weibliche Fische der gewünschten Genotypen in Zuchtboxen am späten Nachmittag / frühen Abend. Am nächsten Morgen, nachdem sie gelaicht haben, sammeln Sie neu befruchtete Eier mit einem Maschensieb und geben Sie sie in 100 mm Petrischalen auf E3.
  2. Inkubieren Sie die Embryonen bei ~27,5 °C mit einem 14 h hellen/10 h dunklen Zyklus bis zum Tag der Operation. Wechseln Sie die E3 täglich oder nach Bedarf.
  3. Füttern Sie die Larven einmal täglich mit einer Pipette voller geernteter Rädertiere, beginnend entweder 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) oder einen Tag nach der Operation. Nachdem die Larven mehrere Stunden zu fressen haben, wechseln Sie den E3, um alle verbleibenden Rädertierchen und Abfallprodukte zu entfernen.
    HINWEIS: Füttern Sie keine Larven am Tag der Operation.

3. Bereiten Sie Larven auf die Operation vor

  1. Verwenden Sie am Tag der Operation eine breit gebohrte Pasteur-Pipette aus Glas, um 10-15 Larven auf eine 35 mm große Petrischale zu übertragen, die mit frischem E3 gefüllt ist.
  2. Betäuben Sie die Larven, indem Sie 3-5 Tropfen 0,4% w/v Tricainlösung (0,4 g Tricain gelöst in 210 mM Tris, pH 9; gegebenenfalls auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt18) in die Schale geben, um eine Endkonzentration von ~ 0,0015% w/v Tricain zu erhalten. Suchen Sie nach mangelnder Reaktion auf Berührungen, um festzustellen, ob die Larven ausreichend betäubt sind. Wenn sie nach ~ 3 Minuten immer noch auf Berührungen reagieren, fügen Sie 2-3 weitere Tropfen von 0,4% w / v Tricainlösung hinzu und bewerten Sie sie erneut.
    HINWEIS: In diesem Entwicklungsstadium ist es möglich, den Blutfluss und die Herzfrequenz zusätzlich zur Motilität unter dem Seziermikroskop zu überwachen.
  3. Immobilisieren Sie die betäubten Zebrafischlarven, indem Sie sie in 1% LMP-Agarose einbetten, die in E3 gelöst ist.
    1. Legen Sie zunächst den Deckel einer 35 mm Petrischale mit dem Gesicht nach oben unter das Seziermikroskop. Als nächstes nehmen Sie eine Larve in eine schmale Pasteur-Pipette aus Glas mit nur einer kleinen Menge E3.
    2. Dann aspirieren ~200 μL geschmolzene, warme (~40 °C) 1% LMP Agarose in die Pipette mit der Larve. Zum Schluss die Larve und Agarose auf den umgedrehten Petrischalendeckel spritzen.
    3. Verwenden Sie eine stumpfe Wolframnadel, um die Larve schnell, aber sanft so zu manövrieren, dass sie seitlich ist, mit einem Auge nach oben. Warten Sie, bis die Agarose aushärtet (~ 5 min).
      HINWEIS: Wenn die Agarose verhärtet, während die Larve nicht lateral ist, befreien Sie sie von der Agarose (wie in Schritt 5 beschrieben) und geben Sie sie mit E3 und Tricain in die Schale zurück.

4. Augenentfernung

  1. Sobald die Agarose gesetzt ist und die Larve seitlich positioniert ist, verwenden Sie die Spitze einer sehr feinen, elektrolytisch geschärften Wolframnadel, um die Haut um das Auge herum zu durchbohren und dem Rand der Augenhöhle zu folgen.
  2. Als nächstes schieben Sie den Rand der Nadel (nicht die Spitze) unter dem Auge von der zeitlich-ventralen Seite des Auges. Verwenden Sie kontrollierten Druck, um das Auge aus der Augenhöhle zu lösen.
  3. Verwenden Sie eine sehr feine chirurgische Pinzette, um das Auge zu entfernen, indem Sie den Sehnerv kneifen und das Auge von medial nach lateral drücken. Alternativ drücken Sie das Auge einfach dorsal und anterior mit der Seite der Nadel, schneiden Sie schließlich durch den Sehnerv und lassen Sie das Auge los.
    HINWEIS: Wenn andere Gewebe als das Auge während der Operation versehentlich gestochen werden, töten Sie die Larve schnell und human durch schnelle Enthauptung.

5. Nachsorge bis zum experimentellen Endpunkt

  1. Nach erfolgreicher Augenentfernung die Agarose mit MMR-Lösung abdecken.
  2. Befreien Sie jede Larve von der Agarose, indem Sie vorsichtig eine Wolframnadel um ihren Kopf und dann um ihren Körper streichen, während Sie den Petrischalendeckel mit einer Pinzette stabilisieren.
  3. Übertragen Sie die einäugigen Larven in eine 35-mm-Petrischale, die MMR enthält, ergänzt mit einer 1:100-Verdünnung eines Penicillin/Streptomycin-Cocktails. Inkubieren Sie die Embryonen bei ~27,5 °C mit einem 14 h hellen/10 h dunklen Zyklus.
    HINWEIS: Diese isotonische Lösung von MMR, die mit Antibiotika ergänzt wird, unterstützt zunächst die Heilung und das Überleben der Larven. Jede Schale kann bis zu 15 sich erholende Larven aufnehmen.
  4. Am nächsten Tag kehren Sie die Larven zur E3 zurück. Beginnend am Nachmittag nach der Operation füttern Sie Larven (~ 6 dpf und älter) einmal täglich mit einer Pipette voller geernteter Rädertierchen. Nachdem die Larven mehrere Stunden zu fressen hatten, wechseln Sie den E3, um alle verbleibenden Rädertierchen und Abfallprodukte zu entfernen.

6. Fixieren von Larven

  1. Sobald die Larven das gewünschte Entwicklungsstadium für die Analyse erreicht haben, betäuben Sie sie mit einer tödlichen Dosis Tricain (~ 0,4% Endkonzentration), bis ihre Herzen stehen geblieben sind.
  2. Pipette bis zu 30 Larven pro 1,5 ml Mikrofugenröhrchen. Entfernen Sie überschüssiges E3 und fügen Sie dann 0,5-1 ml Fixierlösung (4% Paraformaldehyd (PFA) und 4% Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) hinzu, um das Gewebe zu fixieren. Inkubieren Sie die Larven über Nacht bei 4 °C.
  3. Waschen Sie die Larven am nächsten Tag mit PBS, indem Sie das Fixiermittel entfernen und die Larven 3-4 Mal mit PBS spülen. Lagern Sie die Larven bis zu 7 Tage vor der Dissektion bei 4 ° C.

7. Sezieren von Larven, um Gehirne zu enthüllen (angepasst von 15)

  1. Suspendieren Sie die fixierten Larven in PBS-Tröpfchen auf einer Sylgard-Platte unter einem Seziermikroskop. Sichern Sie sie seitlich, indem Sie zwei Wolframstifte (typischerweise alte Wolframnadeln, die weniger als 2 cm groß sind) durch das Notochord legen, wobei ein Stift direkt nach dem pigmentierten Bereich die Aorta-Gona-Mesonephros-Region (AGM) bedeckt und ein weiterer in Linie mit dem Ende der Dotterverlängerung.
    HINWEIS: Positionieren Sie die Wolframstifte in so wenigen Versuchen wie möglich, da das Gewebe mit jeder Punktion brüchiger wird.
  2. Verwenden Sie eine sehr scharfe Wolframnadel und eine nadelscharfe Pinzette, um das Gehirn freizulegen, indem Sie in dieser Reihenfolge die Augen, das Ohr, den Kiefer, den Verdauungstrakt und die dorsale Schädelhaut entfernen.
    1. Entfernen Sie zunächst das Auge mit einer Technik, die der chirurgischen Augenentfernung in Schritt 4 ähnelt. Lösen Sie dann die Larve und drehen Sie sie auf die gegenüberliegende Seite, damit das andere Auge zugänglich ist und wiederholen Sie sie. Alternativ stechen Sie die Nadel durch den Kiefer auf die andere Seite und entfernen Sie das Auge, ohne es zu lösen.
      HINWEIS: Augen können an dieser Stelle gesammelt werden, wenn eine Analyse dieses Gewebes gewünscht ist (ähnlich wie bei 19).
    2. Als nächstes verwenden Sie die Wolframnadel, um von der Schläfen- zur Bauchseite des Ohres zu kratzen. In der gleichen Aktion / Bewegung bringen Sie die Nadel posterior zum Kiefer und ziehen Sie vorsichtig vorne, bis das Ohr und der Kiefer entfernt sind.
    3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchorgane und das verbleibende Eigelb herauszuziehen.
    4. Machen Sie schließlich einen flachen Schnitt in der dorsalen Schädelhaut in der Nähe der Verbindung zwischen Hinterhirn und Rückenmark. Heben Sie die Haut mit der Pinzette an und ziehen Sie sie anterior und um das Telencephalon herum. Wenn sich dies als zu schwierig erweist, beginnen Sie mit dem ersten Schnitt im Hinterhirn und ziehen Sie die Haut zuerst seitlich und dann ventral und anterior, wobei Sie sehr darauf achten, die Seitenränder des Tektums nicht zu zerkratzen.
      HINWEIS: Da das Mittelhirn das Studienobjekt ist, kann das Hinterhirn geschnitten werden; Ein tiefer Schnitt kann jedoch zur Enthauptung führen.
    5. Entfernen Sie das restliche Gewebe mit einer Pinzette. Lösen Sie die Larve und übertragen Sie sie in einem 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen auf PBS.
      HINWEIS: Lassen Sie den Schwanz am Gehirn befestigt, um die Sichtbarkeit bei der Durchführung von Wholemount-Protokollen zu verbessern.

8. Dehydrierung und Speicherung des Gehirns

  1. Entfernen Sie PBS aus dem Gehirn und fügen Sie 1 ml PBS hinzu, das 0,1% TritonX-100 (PBST) enthält. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Entfernen Sie den PBST und ersetzen Sie ihn durch eine 50:50 Methanol:PBST-Lösung. 5-10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Waschen Sie das Gehirn zweimal mit 100% Methanol (MeOH) für jeweils 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  4. Lagern Sie das Gehirn in 100% MeOH bei -20 °C für mindestens 16 Stunden, bevor Sie Immunhistochemie oder andere Wholemount-Verfahren durchführen.
    HINWEIS: Gehirne können in MeOH für bis zu 2 Jahre bei -20 °C gelagert werden.

9. Immunhistochemie

HINWEIS: Etablierte Protokolle für viele nützliche Wholemount-Techniken in Zebrafischen finden Sie auf ZFIN20. Dieses Manuskript enthält Beispiele für den Vergleich von einäugigen und zweiäugigen Larven, die immungefärbt waren, mit Antikörpern, die entweder das rot fluoreszierende Protein (RFP) erkennen, das in Sehnervaxonen in der Tg [atoh7: RFP] -Linie exprimiert wird (Abbildung 2), oder phosphoryliertes Histon H3 (PH3), das mitotische Zellen hervorhebt (Abbildung 3). Ein Standard-Immunhistochemie-Protokoll für Embryonen und Larven im ganzen Gebirge ist unten zusammengefasst.

  1. Rehydrieren Sie zuerst die Larvengehirne mit einer abgestuften Reihe von MeOH: PBST-Waschungen bei Raumtemperatur, indem Sie die Proben in 50: 50 MeOH: PBST für 5 Minuten inkubieren, dann in 30: 70 MeOH: PBST für 5 min und enden mit 3 Waschungen von PBST.
  2. Um das Gehirn zu durchdringen, inkubieren Sie sie in PBST, ergänzt mit Proteinase K (PK) in einer Endkonzentration von 20 μg/ml PK für 30 min bei 37 °C. Aliquots von 10 mg/ml PK bei -20 °C lagern und vor Gebrauch auftauen.
  3. Entfernen Sie die PK-Lösung und waschen Sie das verbleibende Enzym weg, indem Sie das Gehirn 3 Mal über 15 Minuten mit PBST spülen.
  4. Fixieren Sie die permeabilisierten Gehirne, indem Sie sie in 4% PFA für 20 Minuten bei 25 ° C (oder Raumtemperatur) inkubieren. Entfernen Sie dann PFA und waschen Sie alle verbleibenden Fixiermittel weg, indem Sie das Gehirn 3 Mal über 15 Minuten mit PBST spülen.
  5. Ersetzen Sie die letzte PBST-Spülung durch frisch hergestellten Immunblocking-Puffer (IB) (10% normales Ziegenserum und 1% DMSO in PBST) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für mindestens 1 h.
  6. Verdünnen Sie primäre Antikörper in IB-Puffer in der entsprechenden Konzentration (z. B. 1:500 für RFP und 1:300 für PH3-Antikörper).
  7. Entfernen Sie den IB-Puffer aus dem Gehirn und ersetzen Sie ihn durch die primäre Antikörperverdünnung. Über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Schaukeln inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche sicher auf ihren Seiten ruhen.
  8. Entfernen Sie am nächsten Morgen die primäre Antikörperlösung mit einer Mikropipette, spülen Sie sie ein paar Mal in PBST ab und waschen Sie dann die Gehirne in PBST bei Raumtemperatur für 4 x 30 min.
    HINWEIS: Primäre Antikörperverdünnungen können einmal innerhalb von ~ 7 Tagen wiederverwendet werden, wenn sie bei 4 ° C gelagert werden.
  9. Spülen Sie das Gehirn in IB-Puffer, während Sie sekundäre Antikörper in der entsprechenden Konzentration in IB-Puffer verdünnen (z. B. 1:500 für Alexa-Fluor 568 Anti-Kaninchen).
  10. Entfernen Sie den IB-Puffer und ersetzen Sie ihn durch die sekundäre Antikörperverdünnung. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler mit sanftem Schaukeln der auf ihren Seiten ruhenden Röhren.
  11. Am nächsten Morgen die sekundäre Antikörperlösung entfernen, mit PBST abspülen und dann das Gehirn in PBST bei Raumtemperatur für 4 x 30 min waschen.
  12. Gegen Färbung mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder ToPro3 (1:5.000 in PBST bei 4 °C über Nacht).
  13. Am nächsten Morgen übertragen Sie die Larvengehirne in PBS und fahren Sie mit den unten aufgeführten Montage- und Bildgebungsschritten fort.

10. Montage und Bildgebung

  1. Befestigen Sie einen gekammerten Schlitten in den Deckel einer 100 mm Petrischale mit Vakuumfett.
  2. Übertragen Sie die immungefärbten und verarbeiteten Larven auf eine Brunnenplatte oder einen Vertiefungsobjektträger, um sie mit einem Seziermikroskop zu betrachten.
  3. Montieren Sie die Larven auf dem gekammerten Objektträger in Säulen von 1% LMP-Agarose.
    1. Legen Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Glas eine Larve auf den Kammerschlitten und legen Sie so wenig PBS wie möglich ab. Mit der gleichen Pipette die Larve mit geschmolzener 1% LMP-Agarose (~40 °C) bedecken.
    2. Ziehen Sie mit einer stumpfen Wolframnadel oder Pinzette die Agarose in eine Säule und positionieren Sie die Larve dann so symmetrisch wie möglich, wobei die dorsale Oberfläche sichtbar ist.
    3. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Larven.
    4. Sobald die Agarose geliert ist, bedecken Sie sie mit ein paar Tropfen PBS und legen Sie sie dann auf die Bühne des konfokalen Mikroskops.
  4. Richten Sie die Objektivlinse mit der Probe aus, fokussieren Sie das Mikroskop mit Durchlicht und beleuchten Sie die Probe mit den entsprechenden Lasern.
    HINWEIS: In diesem Beispiel wurden 405 nm und 568 nm Wellenlängen verwendet, um DAPI bzw. RFP anzuregen.
  5. Stellen Sie die Verstärkung, den Versatz und die Laserleistung ein, indem Sie die Schieberegler auf ein geeignetes Niveau relativ zum Signal und zum verwendeten Detektor bewegen. Überprüfen Sie die Histogramme für jeden Kanal und klicken Sie auf die Schaltfläche Sättigungsanzeige über dem Bild, um die Belichtungsstärke zu messen, um sicherzustellen, dass keines der Pixel gesättigt ist und das Signal-Rausch-Verhältnis hoch ist. Ein Beispiel für optimale konfokale Bildgebungsparameter für die zelluläre und subzelluläre Auflösung innerhalb von Zebrafischen finden Sie unter 21.
  6. Legen Sie die oberen und unteren Grenzen des Stapels von z-Ebenen fest, indem Sie das Scrollrad der Maus verwenden, um die Ober- und Unterseite des Beispiels zu finden. Klicken Sie auf den oberen und unteren Grenzwert für die Bildaufnahme und lösen Sie dann die Z-Stack-Aufnahme aus, indem Sie auf die Schaltfläche Jetzt ausführen klicken.
    HINWEIS: Je nachdem, wie symmetrisch das Gehirn montiert ist, beträgt die Gesamt-Z-Tiefe für ein 9 dpf Larven-Zebrafischgehirn ~ 150-200 μm.
  7. Verarbeiten und kolorieren Sie die Bilder unter Berücksichtigung der farbblinden Barrierefreiheit (z. B. verwenden Sie Blau und Orange oder Magenta und Grün für zweifarbige Bilder). Richten Sie Nachschlagetabellen in der Software ein, die zum Erfassen der Bilder verwendet wird, oder in der Bildverarbeitungssoftware wie Photoshop von Adobe.
  8. In Photoshop werden Farbrohfotos als 8-Bit-TIFF-Format (Tagged Image File Format) gespeichert, indem (i) der Bildmodus in RGB konvertiert und (ii) auf die Option " Kurven" unter der Bild-| zugegriffen wird Passt Menüs an und verschiebt dann (iii) die entsprechenden farbigen Lichtausgaben auf 0 oder 255 Stufen, um die gewünschte Farbe zu erreichen. Um beispielsweise ein grünes Signal zu erhalten, wählen Sie den roten Kanal aus und schieben Sie seinen Ausgang auf 0. Wählen Sie dann den blauen Kanal aus und schieben Sie seine Ausgabe ebenfalls auf 0. Um ein Magenta-Signal zu erhalten, wählen Sie den grünen Kanal und schieben Sie seinen Ausgang auf 0. Lassen Sie die roten und blauen Kanäle so, wie sie sind.
    HINWEIS: Ähnliche Schritte können im kostenlosen Gnu Image Manipulation Program (GIMP) durchgeführt werden.
  9. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellen, die eine bestimmte Markierung anzeigen, manuell mit dem Zellenzähler-Plugin in ImageJ22, das im Menü "Plugins" unter " Analysieren" verfügbar ist. Beispiele für die Verwendung von ImageJ für die Zellenzählung finden Sie in vielen Tutorials, einschließlich 23.
  10. Generieren Sie grafische Darstellungen von Daten in Statistiksoftware wie RStudio (siehe ergänzende Daten für . Rmd-Datei).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Um zu bestätigen, ob die Augenentfernung abgeschlossen war und um zu beurteilen, wie sich das optische Tectum verändert, wurden Operationen im Tg[atoh7:RFP]-Stamm durchgeführt, der alle RGCs mit einem membrangerichteten RFP und damit alle Axone markiert, die aus der Netzhaut ragen und den Sehnerv24 bilden. Obwohl die Verwendung dieser Belastung nicht unbedingt erforderlich ist, ermöglicht sie eine einfache Beobachtung und Visualisierung der Sehnerventermini im optischen Tectum neuropil. A...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebenen Techniken veranschaulichen einen von vielen Ansätzen zur Untersuchung der visuellen Systementwicklung von Wirbeltieren bei Zebrafischen. Andere Forscher haben Methoden veröffentlicht, um die embryonale Netzhaut zu sezieren und Genexpressionsanalysendurchzuführen 19 oder neuronale Aktivität im optischen Tectum30 zu visualisieren. Dieses Papier bietet einen Ansatz, um zu untersuchen, wie differentieller Netzhauteintrag das Zellverhalten im ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung dieser Arbeit wurde in erster Linie durch Startkapital vom Reed College an KLC, Helen Stafford Research Fellowship-Mittel an OLH und ein Reed College Science Research Fellowship an YK unterstützt. Dieses Projekt begann im Labor von Steve Wilson als Zusammenarbeit mit HR, die von einer Wellcome Trust Studentship (2009-2014) unterstützt wurde. Wir danken Máté Varga, Steve Wilson und anderen Mitgliedern des Wilson-Labors für die ersten Diskussionen über dieses Projekt, und wir danken insbesondere Florencia Cavodeassi und Kate Edwards, die als erste KLC beigebracht haben, wie man Embryonen in Agarose besteigt und Zebrafisch-Hirndissektionen durchführt. Wir danken auch Greta Glover und Jay Ewing für die Hilfe bei der Montage unseres Wolfram-Nadelschärfgeräts.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ausrüstung und Zubehör:
ZuchtboxenAquaneeringZHCT100
Dow Corning HochvakuumfettSigma oder gleichwertiger LieferantZ273554
Erlenmeyerkolben (125 mL)Zur Herstellung von Marc's Modified Ringers (MMR)
Feine Pinzette - Dumont #5Fine Science Tools (FST)11252-20
Glaspasteur-PipettenDWK Lifescience63A53 & 63A53WTZum Pipettieren von Embryonen und Larven.
Objektträger für die MikroskopieVWR oder gleichwertiger Lieferant48311-703Standard-Objektträger für Glasmikroskope können bei vielen verschiedenen Laborlieferanten bestellt werden.
Glaswaren, einschließlich Messflaschen und MesszylinderFür die Herstellung und Lagerung von Lösungen.
2-Komponenten-EpoxidharzACE Hardware oder anderer gleichwertiger Lieferant von Gorilla Glue oder gleichwertiger0,85 oz Spritze
https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793 Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)VWR oder gleichwertiger Lieferant22234-046
Vernickelter Stifthalter (17 cm Länge)Fine Science Tools (FST)26018-17Zum Halten von Wolframdraht beim Schärfen und Durchführen von Operationen/Dissektionen.
Teesieb aus Nylonnetz oder gleichwertigAli Express oder gleichwertigFür die Ernte von Zebrafischeiern nach dem Laichen; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
BüroklammerFür Wolframnadel-Schleifvorrichtung.
Petrischalen 100 mmFischer Scientific oder gleichwertiger Lieferant50-190-0267
Petrischalen 35 mmFischer Scientific oder gleichwertiger Lieferant08-757-100A
PipettenpumpeSP Bel-Art oder gleichwertigF37898-0000
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma909122Für Wolfram-Nadelschärfgerät. Stellen Sie eine 10%ige w/v-Lösung von KOH in der Haube her, indem Sie Pellets zu deionisiertem Wasser hinzufügen.
Stromversorgung (variable Spannung)Für Wolframnadelschärfgerät. Jedes Netzteil mit variabler Spannung funktioniert (auch eines, das für die Gelelektrophorese verwendet wird).
Sylgard 184 Elastomer KitDow Corning3097358
Wolframdraht (0,125 mm Durchmesser)World Precision Instruments (WPI)TGW0515Schärfen zum Entfernen von Augen und Sezieren von Larven.
Heizblock mit variabler Temperatur:Das Lab Depot oder ein gleichwertiger LieferantBSH1001 oder BSH1002Auf 40-42 Grad eingestellt; C vor Experimenten.
Weithalsglas mit Deckel (z. B. sauberes Marmeladen- oder Salsa-Glas)Für Wolframnadel-Schleifgerät.
Drähte mit KrokodilklemmleitungenFür Wolframnadel-Schleifvorrichtung.
Mikroskope:
PräpariermikroskopJeder Typ funktioniert, aber ein einstellbares Durchlicht auf einer verspiegelten Basis wird bevorzugt.
konfokales Laserscanning-Mikroskopmit hoher NA und einer 20-25-fachen Wassertauchobjektive zu verwenden.
Hier wird eine Mikroskopsteuerungs- und Bilderfassungssoftware (NIS-Elements von Nikon) verwendet, aber jedes konfokale Mikroskop funktioniert.
Reagenzien für Operationen und Dissektionen:
Calciumchlorid-DihydratSigmaC7902für Marc's Modified Ringers (MMR) und Embryomedium (E3).
HEPESSigmaH7006für Marc's Modified Ringer (MMR).
Niedriger SchmelzpunktAgarose Invitrogen16520-050Ergibt 1% in Embryomedium (E3) oder Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma1374248Für Embryomedium (E3).
MagnesiumsulfatSigmaM7506für Marc's Modified Ringer (MMR).
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210Verdünnen Sie 8 % (w/v) Stamm mit 2x konzentriertem PBS (verdünnt aus 10x PBS Stoff).
Penicillin/StreptomycinSigmaP4333-20MLverdünnt 1:100 in Marc's modifizierten Ringern.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) TablettenDiagnostisch BioSystemsDMR E404-0110x brühig in entionisiertem Wasser herstellen, autoklavieren und bei Raumtemperatur lagern. Auf die 1-fache Arbeitskonzentration verdünnen.
KaliumchloridSigmaP3911für Marc's Modified Ringers (MMR) und Embryomedium (E3).
NatriumchloridSigmaS9888für Marc's Modified Ringers (MMR) und Embryomedium (E3).
NatriumhydroxidSigmaS5881Machen Sie 10 M und verwenden Sie es, um den pH-Wert der MMR auf 7,4 einzustellen.
SaccharoseSigmaS9378
Tricain-SPentair100G #TRS1Rezept: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagenzien für die Immunhistochemie:
Alexafluor 568 getaggt Sekundärer Antikörper zum Nachweis von Kaninchen-IgGInvitrogenA-11011Verwendung bei 1:500 Verdünnung für Wholemount Immunhistochemie.
DAPI oder ToPro3Invitrogen1306 oder T3605Stellen Sie 1 mg/ml-Lösungen in DMSO auf, Verdünnung im Verhältnis 1:5.000 für die Gegenfärbung.
Dimethylsulfoxid (DMSO)SigmaD8418Ein Bestandteil des Immunblockpuffers.
Methanol (MeOH)Sigma34860Das Mischen von MeOH mit wässrigen Lösungen wie PBST ist exotherm. Stellen Sie die MeOH/PBST-Lösungen mindestens einige Stunden im Voraus her oder kühlen Sie sie vor der Verwendung auf Eis ab.
Normales ZiegenserumThermoFisher Scientific50-062ZEin Bestandteil des Immunblock-Puffers. Kann in Volumina von 1-10 ml aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.
Primärer Antikörper zum Nachweis von Phosphohiston: H3Millipore06-570Verwendung in einer Verdünnung von 1:300 für die Immunhistochemie des gesamten Virus.
Primärer Antikörper zum Nachweis des rot fluoreszierenden Proteins (RFP; zum Nachweis von dsRed-Derivaten)MBL InternationalPM005Verwendung in einer Verdünnung von 1:500 für die Immunhistochemie des gesamten Antigens.
Proteinase K (PK)SigmaP2308-10MG10 mg/ml Stammlösungen in PBS herstellen und bei 10 & Mikro verwenden; g/ml.
Triton X-100SigmaT8787Nützlich, um eine 20% (v/v) Stammlösung in PBS herzustellen.
Software für die Datenanalyse
ImageJ (Fiji)Freeware für die Bildanalyse; https://imagej.net/software/fiji/
RStudioFreeware für statistische Analysen und Datenvisualisierung; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop oder GIMPProprietäre Bildbearbeitungssoftware (Adobe Photoshop und Illustrator) werden häufig verwendet, um Figuren zu komponieren. Eine Freeware-Alternative ist Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. In dieser Studie wurden die Stämme AB, TU, Tg[atoh7:RFP] verwendet.Erhältlich bei der  Zebrafish International Resource Centers in den USA (https://zebrafish.org/home/guide.php) oder in Europa (https://www.ezrc.kit.edu/). Spezialisierte transgene Stämme, die noch nicht in einem der beiden Ressourcenzentren hinterlegt wurden, können nach der Veröffentlichung bei den einzelnen Laboren angefordert werden.
mit Antibiotika für die Inkubation nach der Operation.Es wird empfohlen, ein

Referenzen

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14(2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Optisches TectumNetzhautaxoneneuronale EntwicklungGehirndissektionImmunhistochemieLive Cell ImagingWallersche DegenerationStammzellnischen
Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.