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Methodenartikel

Durchführung der In-vivo- und Ex-vivo-Impedanz-Myographie bei Nagetieren

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DOI:

10.3791/63513

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8. Juni 2022

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1Department of Neurology, Harvard Medical School - Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Accelerating NeuroVentures, 3Charley's Fund

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie die elektrische Impedanzmyographie in vivo (unter Verwendung von Oberflächen- und Nadelelektrodenarrays) und ex vivo (unter Verwendung einer dielektrischen Zelle) am Musculus gastrocnemius von Nagetieren durchgeführt wird. Es wird die Technik sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten demonstrieren und die verfügbaren Modifikationen (z. B. fettleibige Tiere, Welpen) detailliert beschreiben.

Zusammenfassung

Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) ist eine praktische Technik, die in präklinischen und klinischen Studien verwendet werden kann, um die Gesundheit und Krankheit des Muskelgewebes zu beurteilen. EIM wird erhalten, indem ein richtungsfokussierter elektrischer Strom niedriger Intensität an einen Muskel von Interesse über einen Frequenzbereich (d. h. von 1 kHz bis 10 MHz) angelegt und die resultierenden Spannungen aufgezeichnet werden. Aus diesen werden mehrere Standardimpedanzkomponenten, einschließlich Reaktanz, Widerstand und Phase, erhalten. Bei Ex-vivo-Messungen an ausgeschnittenen Muskeln können auch die inhärenten passiven elektrischen Eigenschaften des Gewebes, nämlich die Leitfähigkeit und die relative Dielektrizitätskonstante, berechnet werden. EIM wurde ausgiebig bei Tieren und Menschen eingesetzt, um Muskelveränderungen bei einer Vielzahl von Krankheiten zu diagnostizieren und zu verfolgen, in Bezug auf einfache Nichtgebrauchsatrophie oder als Maßnahme der therapeutischen Intervention. Klinisch bietet EIM das Potenzial, das Fortschreiten der Krankheit im Laufe der Zeit zu verfolgen und die Wirkung therapeutischer Interventionen zu bewerten, wodurch die Möglichkeit besteht, die Dauer klinischer Studien zu verkürzen und die Anforderungen an die Stichprobengröße zu reduzieren. Da EIM sowohl in lebenden Tiermodellen als auch beim Menschen nichtinvasiv oder minimalinvasiv durchgeführt werden kann, bietet es das Potenzial, als neuartiges translationales Werkzeug zu dienen, das sowohl die präklinische als auch die klinische Entwicklung ermöglicht. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-EIM-Messungen an Mäusen und Ratten, einschließlich Ansätzen zur Anpassung der Techniken an bestimmte Bedingungen, z. B. zur Anwendung bei Welpen oder fettleibigen Tieren.

Einleitung

Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) bietet eine leistungsstarke Methode zur Beurteilung des Muskelzustands, die möglicherweise die Diagnose neuromuskulärer Erkrankungen, die Verfolgung des Krankheitsverlaufs und die Beurteilung des Ansprechens auf Therapie 1,2,3 ermöglicht. Es kann analog auf Tierkrankheitsmodelle und Menschen angewendet werden, was eine relativ nahtlose Übertragung von präklinischen zu klinischen Studien ermöglicht. EIM-Messungen werden leicht mit vier linear angeordneten Elektroden durchgeführt, wobei die beiden äußeren einen schmerzlosen, schwachen elektrischen Strom über einen Frequenzbereich (im Allgemeinen zwischen 1 kHz und etwa 2 MHz) und die beiden inneren die resultierenden Spannungen aufzeichnen1. Aus diesen Spannungen können die Impedanzeigenschaften des Gewebes gewonnen werden, einschließlich des Widerstands (R), ein Maß dafür, wie schwierig es ist, Strom durch das Gewebe zu fließen, und die Reaktanz (X) oder "Aufladbarkeit" des Gewebes, ein Maß für die Fähigkeit des Gewebes, Ladung zu speichern (Kapazität). Aus der Reaktanz und dem Widerstand wird der Phasenwinkel (θ) über die folgende Gleichung berechnet: figure-introduction-1, was ein einzelnes summatives Impedanzmaß ergibt. Solche Messungen können mit jedem Multifrequenz-Bioimpedanzgerät durchgeführt werden. Da Myofasern im Wesentlichen lange Zylinder sind, ist Muskelgewebe auch stark anisotrop, wobei der Strom leichter entlang der Fasern fließt als über sie 4,5. Daher wird EIM oft in zwei Richtungen durchgeführt: mit dem Array, das entlang der Fasern so platziert ist, dass der Strom parallel zu ihnen fließt, und durch den Muskel, so dass der Strom senkrecht zu ihnen fließt. Zusätzlich können bei Ex-vivo-Messungen, bei denen ein bekanntes Gewebevolumen in einer Impedanzmesszelle gemessen wird, die inhärenten elektrischen Eigenschaften des Muskels (d. h. Leitfähigkeit und relative Permittivität) abgeleitet werden6.

Der Begriff "neuromuskuläre Erkrankungen" definiert ein breites Spektrum von primären und sekundären Erkrankungen, die zu strukturellen Muskelveränderungen und Funktionsstörungen führen. Dazu gehören amyotrophe Lateralsklerose und verschiedene Formen der Muskeldystrophie sowie einfachere Veränderungen im Zusammenhang mit dem Altern (z. B. Sarkopenie), Nichtgebrauchsatrophie (z. B. aufgrund längerer Bettruhe oder Schwerelosigkeit) oder sogar Verletzungen7. Während die Ursachen zahlreich sind und vom Motoneuron, Nerven, neuromuskulären Verbindungen oder dem Muskel selbst ausgehen können, kann EIM verwendet werden, um frühe Veränderungen im Muskel aufgrund vieler dieser Prozesse zu erkennen und das Fortschreiten oder Ansprechen auf die Therapie zu verfolgen. Bei Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) wurde beispielsweise gezeigt, dass EIM das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf Kortikosteroide erkennt8. Jüngste Arbeiten haben auch gezeigt, dass EIM empfindlich auf unterschiedliche Nichtnutzungszustände reagiert, einschließlich der fraktionierten Schwerkraft9, wie sie auf dem Mond oder Mars auftreten würde, und der Auswirkungen des Alterns10,11. Schließlich wird es durch die Anwendung von prädiktiven und maschinellen Lernalgorithmen auf den Datensatz, der mit jeder Messung erhalten wird (multifrequenz- und richtungsabhängige Daten), möglich, histologische Aspekte des Gewebes abzuleiten, einschließlich Myofasergröße 12,13, entzündliche Veränderungen und Ödeme14 sowie Bindegewebe und Fettgehalt 15,16.

Mehrere andere nichtinvasive oder minimalinvasive Methoden werden auch verwendet, um die Muskelgesundheit bei Menschen und Tieren zu bewerten, einschließlich der Nadelelektromyographie17 und bildgebender Verfahren wie Magnetresonanztomographie, Computertomographie und Ultraschall18,19. EIM zeigt jedoch deutliche Vorteile im Vergleich zu diesen Technologien. Zum Beispiel erfasst die Elektromyographie nur die aktiven elektrischen Eigenschaften der Myofasermembranen und nicht die passiven Eigenschaften und kann daher keine echte Beurteilung der Muskelzusammensetzung oder -struktur liefern. In gewisser Hinsicht sind bildgebende Verfahren enger mit EIM verwandt, da auch sie Aufschluss über die Struktur und Zusammensetzung von Gewebe geben. Aber in gewissem Sinne liefern sie zu viele Daten, die eine detaillierte Bildsegmentierung und Expertenanalyse erfordern, anstatt nur einen quantitativen Output zu liefern. Darüber hinaus werden bildgebende Verfahren aufgrund ihrer Komplexität auch stark von den Besonderheiten der verwendeten Hard- und Software beeinflusst, was im Idealfall die Verwendung identischer Systeme erfordert, damit Datensätze verglichen werden können. Im Gegensatz dazu bedeutet die Tatsache, dass EIM viel einfacher ist, dass es weniger von diesen technischen Problemen betroffen ist und keine Form von Bildverarbeitung oder Expertenanalyse erfordert.

Das folgende Protokoll zeigt, wie In-vivo-EIM bei Ratten und Mäusen durchgeführt wird, wobei sowohl nichtinvasive (Oberflächenarray) als auch minimalinvasive (subdermale Nadelarray) Techniken sowie ex vivo EIM an frisch herausgeschnittenen Muskeln angewendet werden.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Beth Israel Deaconess Medical Center unter den Protokollnummern (031-2019; 025-2019) genehmigt. Tragen Sie geeignete PSA-Ausrüstung für den Umgang mit Tieren und halten Sie sich an die IACUC-Richtlinien für alle Tierarbeiten.

1. In-vivo-Oberflächen-EIM

  1. Legen Sie das Tier in eine Anästhesiebox, um eine Anästhesie einzuleiten.
    ANMERKUNG: Für Ratten wurden 1,5%-3,5% Isofluran und 2 O2L·min-1 und für Mäuse 2% Isofluran und 1O2L·min-1 verwendet.
  2. Nach vollständiger Betäubung, wie durch das Ausbleiben der Reaktion nach dem Einklemmen des Fußes des Tieres angezeigt, legen Sie die Maus in Bauchlage auf die Bank und verwenden Sie den Nasenkegel, um die Anästhesie mit 1,5% Isofluran und einem Sauerstofffluss von 1 L·min-1 aufrechtzuerhalten.
  3. Platzieren Sie das zu analysierende Bein des Tieres in einem 45°-Winkel mit dem Hüftgelenk (Knie gestreckt) und sichern Sie den Fuß mit medizinischem Klebeband.
  4. Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um das Fell zu trimmen, das den Musculus gastrocnemius überlagert.
  5. Tragen Sie eine dicke Schicht Enthaarungscreme auf die Haut des Tieres auf und lassen Sie es 1 Minute einwirken. Verwenden Sie dann salzhaltige Gaze, um das Enthaarungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, bis das gesamte Fell, das den Musculus gastrocnemius überlagert, entfernt ist.
    HINWEIS: Legen Sie ein mit Kochsalzlösung getränktes Mullkissen über die Haut, wenn keine Messungen durchgeführt werden, um eine Austrocknung der Haut zu verhindern.
  6. Schließen Sie das Oberflächenarray (Abbildung 1) an das EIM-Gerät an, und lassen Sie die Elektroden auf einem in Kochsalzlösung getränkten Stück Gaze ruhen.
  7. Platzieren Sie die Oberflächenanordnung direkt auf der Haut über dem Musculus gastrocnemius, längs orientiert zu den Muskelfasern.
  8. Nach der Überprüfung des entsprechenden Kontakts, der durch alle grün erscheinenden Balken in der Software angezeigt wird, die die Stabilität der Widerstands-, Reaktanz- und Phasenwerte von 50 kHz anzeigen, erfassen Sie die EIM-Messungen.
    HINWEIS: Kurven sollten in Echtzeit überprüft werden, um eine ordnungsgemäße Datenerfassung zu gewährleisten.
  9. Drehen Sie die Oberflächenanordnung um 90° und positionieren Sie sie auf der Haut über dem Gastrocnemius neu, um die Quermaße zu erhalten (prüfen Sie auf grüne Balken, die die Stabilität anzeigen).
  10. Wiederholen Sie die Schritte 1.7, 1.8 und 1.9, um insgesamt vier Messungen pro Muskel zu erhalten: zwei Längs- und zwei Quermessungen.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Enthaarungsmittel nicht mehr als einmal (d. h. bis zu drei Anwendungen in derselben Instanz) alle zwei Wochen, um übermäßige Hautreizungen und Verletzungen zu vermeiden. Es ist wichtig, die Messungen innerhalb von etwa 5-10 Minuten nach dem Entfernen der Enthaarungscreme durchzuführen, da die Entwicklung von lokalisierten Hautödemen, die durch das Enthaarungsmittel induziert werden, die gesammelten Impedanzdaten beeinflussen kann. Die Erholung des Tieres erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Isofluran-Anästhesie und das Verfahren erfordert keine analgetische Behandlung.

2. In-vivo-Nadelarray-EIM

  1. Betäuben Sie das Tier und bereiten Sie das Bein nach dem gleichen Verfahren vor wie in den Schritten 1.1-1.4 beschrieben. Es ist jedoch nicht notwendig, ein Enthaarungsmittel zu verwenden, wenn in vivo EIM mit einem Nadelarray durchgeführt wird.
  2. Schließen Sie das Nadelfeld (Abbildung 2A-F) an das EIM-Gerät an und lassen Sie es in einem Wiegeboot ruhen, das Kochsalzlösung enthält. Überprüfen Sie die Konnektivität und Signalstabilität (gekennzeichnet durch grüne Balken).
  3. Desinfizieren Sie Haut und Nadeln mit Alkohol. Platzieren Sie die Nadelanordnung in einer Längsposition im Vergleich zu den Myofasern und drücken Sie sie fest in die Haut, bis alle Nadeln die Haut und den darunter liegenden Muskel bis zum Kunststoffschutz auf dem Array durchdringen. Erfassen von Daten.
  4. Entfernen Sie das Array vorsichtig und führen Sie es in einem 90°-Winkel relativ zur ersten Messung in Querrichtung durch die Haut und wieder in den Muskel ein. Erfassen von Daten.
    HINWEIS: Bei Verwendung von Nadelarrays sollten Messungen nur einmal in jede Richtung durchgeführt werden, um den Einfluss der Nadelelektroden auf Haut und Muskelgewebe zu reduzieren. Wenn Blutungen auftreten, wischen Sie das Blut vorsichtig ab, bevor Sie die zweite Messung durchführen. Die Erholung des Tieres erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Isofluran-Anästhesie und das Verfahren erfordert keine analgetische Behandlung.

3. Ex-vivo-EIM

  1. Bereiten Sie die Ex-vivo-dielektrische Zelle vor (Abbildung 2G,H), geben Sie Kochsalzlösung in die Kammer und verbinden Sie die Zelle mit dem EIM-Gerät, um die Referenzwerte zu erhalten.
    HINWEIS: Die Phasen- und Reaktanzwerte der Kochsalzlösung sollten konstant bei oder nahe Null bleiben und die Widerstandswerte der Kochsalzlösung sollten bei etwa 100 ± 25 Ω über den Frequenzbereich von 1 kHz bis 1 MHz konstant bleiben.
  2. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den jeweiligen IACUC-Richtlinien.
  3. Schneiden Sie mit einer Schere die Haut in der Nähe der Achillessehne ab. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben, um die darunter liegenden Muskeln und Faszien freizulegen. Sezieren Sie vorsichtig den Bizeps femoris, der den Musculus gastrocnemius überlagert und den Ischiasnerv schneidet.
  4. Schneiden Sie die Achillessehne ab, um das distale Ende der Muskeln Gastrocnemius und Soleus zu befreien, und ziehen Sie die Sehne vorsichtig nach oben, während Sie mit einer Schere alle Anhänge entfernen. Sobald alle Aufsätze entfernt sind, schneiden Sie mit einer Schere das rostrale Ende des Soleusmuskels ab und entfernen Sie es.
  5. Verwenden Sie eine Schere, um die Köpfe des Musculus gastrocnemius um die Patella herum zu sezieren.
    HINWEIS: Nach der Entfernung des Musculus gastrocnemius ist es wichtig, sich an die ursprüngliche Ausrichtung der Myofasern zu erinnern.
  6. Legen Sie den Gastrocnemius-Muskel auf eine Zahnwachsschicht und schneiden Sie ihn mit einer Rasierklinge und einem Lineal, um einen 10 mm x 10 mm großen Abschnitt von der Mitte des Musculus gastrocnemius zu erhalten.
    HINWEIS: Die dielektrische Zellengröße kann angepasst werden. Für Ratten wurde eine 10 mm x 10 mm Zelle und für Mäuse eine 5 mm x 5 mm Zelle verwendet.
  7. Legen Sie den Gastrocnemius vorsichtig mit einer Pinzette in die dielektrischen Zellen und stellen Sie sicher, dass die Fasern längs ausgerichtet sind (d. H. Schwanz- und Rostralextremitäten sollten die Elektroden berühren). Stellen Sie sicher, dass der Muskel vollständig mit den Metallelektroden in Kontakt steht.
  8. Befestigen Sie den oberen Teil der dielektrischen Zelle und führen Sie zwei Monopolnadeln (26 G) in die beiden Löcher ein. Verbinden Sie die Drähte des EIM-Geräts mit der Ex-vivo-Zelle in der folgenden Reihenfolge: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, wobei I für die Stromelektroden und V für die Spannungselektroden steht). Erfassen Sie die Längsschnittmessung.
  9. Öffnen Sie die dielektrische Zelle und richten Sie den Muskel in Querrichtung neu aus, indem Sie ihn um 90° drehen. Befestigen Sie die Oberseite der dielektrischen Zelle wieder. Erfassen Sie die Quermessung.

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Ergebnisse

EIM kann unter vielen Bedingungen erhalten werden, einschließlich Oberflächen-in-vivo-Arrays (Abbildung 1), Nadel-in-vivo-Arrays (Abbildung 2A-F) und Ex-vivo-dielektrischen Zellen (Abbildung 2G, H).

EIM liefert eine nahezu augenblickliche Momentaufnahme des Muskelzustands basierend auf den gemessenen Impedanzwerten. Die Messunge...

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Diskussion

In diesem Artikel werden die grundlegenden Methoden zur Durchführung von EIM bei Nagetieren sowohl in vivo als auch ex vivo beschrieben. Um zuverlässige Messungen zu erhalten, ist es wichtig, eine Reihe von Schritten durchzuführen. Zuerst muss man den Muskel von Interesse richtig identifizieren, da jeder Muskel unterschiedliche Reaktionen auf Krankheiten, Behandlung und Pathologie hat. Man muss bedenken, dass die Daten, die über einen Muskel (z. B. Gastrocnemius) erfasst wurden, nicht die gleichen Infor...

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Offenlegungen

S. B. Rutkove ist an Myolex, Inc., einem Unternehmen, das Impedanzgeräte für klinische und Forschungszwecke entwickelt, und dem hier verwendeten mView-System beteiligt und fungiert als Berater und wissenschaftlicher Berater. Er ist auch Mitglied des Board of Directors des Unternehmens. Das Unternehmen hat auch eine Option zur Lizenzierung der patentierten Impedanztechnologie, deren Erfinder S. B. Rutkove genannt wird. Die anderen Autoren haben keine anderen relevanten Verbindungen oder finanzielle Beteiligung an einer Organisation oder Entität mit einem finanziellen Interesse an oder einem finanziellen Konflikt mit dem Gegenstand oder den Materialien, die im Manuskript besprochen werden, abgesehen von den offengelegten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Charley's Fund und NIH R01NS055099 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3D-DruckerFormlabs Inc.Form 2Desktop-3D-Drucker
3D-DruckerShenzhen Creality 3D Technology Co. LTDCreality Ender 3 V23D-Drucker
3M Micropore OP-BandFisher19-027761 und 19-061655Modelle 1530-0 und 1530-1
3M TRANSPORE OP-BandFisher18-999-380 und 18-999-381Modelle 1527-0 und 1527-1
Steckerleiste vertikal 10 POS 1 mm AbstandDigi-Key (Sullins-Verbindungslösung)S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)Abstandshalter aus Kunststoff, 1 mm Löcher für das Ratten-In-vivo-Array, dargestellt in Abbildung 2A
, Applikatoren mit WattespitzeFisher22-363-172
DentalwachsFisherNC9377103
EnthaarungsmittelNAIRNAHaarentfernerlotion mit weichmachendem Babyöl
Dumont #7b Pinzette, Fein Science ToolsNr. 11270-20Zum Sezieren verwendet, Stil: #7b, Spitzenform: gebogen, Spitzen: Standard, Spitzenabmessungen: 0,17 mm x 0,1 mm, Legierung/Material: Inox, Länge: 11 cm
Elektronischer digitaler MessschieberFisher14-648-17Wird verwendet, um die Abmessungen des Gastrocnemius-Muskels zu messen
Epoxid-Klebe-Doppelpatrone 4 min LebensdauerDevconSerie 14265, Modell 2217Klebstoff, der in dem in vivo gezeigten Ratten-In-vivo-Array verwendet
Ex-vivo-Zelle mit dielektrischer ImpedanzKundenspezifischedielektrischeNA-Zellen wurden im Labor in Rutkove 3D-gedruckt
Graefe ForcepsFine Science ToolsNr. 11051-10Wird zum Platzieren und Anpassen von Muskeln verwendet, Länge: 10 cm, Spitzenform: gebogen, Spitzen: gezahnt, Spitzenbreite: 0,8 mm, Abmessungen der Spitze: 0,8 mm x 0,7 mm, Legierung/Material
HaarschneiderAmazonNAWahl Profitier BravMini+
Impedanz TiergerätMyolexEIM1103mView-System - Untersuchungsgerät für die elektrische Impedanz Myographie für den Einsatz in der Tierforschung
In-vivo-NadelarraysCustomNAKundenspezifische Arrays mit 27 G subdermalen Nadeln von Ambu. Die Konstruktion wurde mit einem 3D-Drucker im Labor in Rutkove abgeschlossen
In-vivo-OberflächenarrayCustomNADas In-vivo-Oberflächenarray wurde im Labor in Rutkove gedruckt und zusammengebaut
IsofluranPatterson Veterinary Supplies07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)Pivetal - 250 mL Flasche
VliesgazeFisher22-028-5592 x 2 Zoll
Polystyrol Wiegen GeschirrFisherS67090AAbmessungen (L x B x H): 88,9 mm x 88,9 mm x 25,4 mm
RasierklingenFisher12-640Wird verwendet, um Muskeln auf das richtige Maß zu schneiden, Einschneidige Klingen aus Kohlenstoffstahl
Feine SchereFine Science ToolsNr. 91460-11Zum Sezieren verwendet, Spitzen: Scharf-scharf, Legierung/Material: Student Edelstahl, gezahnt: Nein, Spitzenform: Gerade, Schneide: 20 mm, Länge: 11,5 cm, Feature:
Subdermale Nadeln in Studentenqualität 27 G NeurolineAmbu745 12-50/24Nadeln, die in der Ratten-In-vivo-Anordnung verwendet werden, dargestellt in Abbildung 2A
Chirurgische Schere - SharpFine Science ToolsNr. 14002-13Zum Schneiden der Haut, Spitzen: Scharf-Scharf, Legierung/Material: Edelstahl, gezahnt: Nein, Spitzenform: Gerade, Schneide: 42 mm, Länge: 13 cm
TECA ELITE monopolare NadelelektrodenNatus902-DMG50-S0,46 mm Durchmesser (26 G). Blue Hub
Teknova 0,9% KochsalzlösungFisherS58151000 mL steril
, , , , , , wird Student

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