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Methodenartikel

Schichtmikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern zur biaxialen mechanischen Charakterisierung und mikrostrukturellen Quantifizierung

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DOI:

10.3791/63522

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10. Februar 2022

 ,  ,  , 
1Biomechanics and Biomaterials Design Laboratory (BBDL), School of Aerospace and Mechanical Engineering, The University of Oklahoma, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (IBEST), The University of Oklahoma

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die biaxiale mechanische Charakterisierung, die polarisierte Lokalfrequenzbereichs-Imaging-basierte Kollagenquantifizierung und die Mikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern. Die bereitgestellte Methode erläutert, wie die Prospektschichten zum ganzheitlichen Verhalten der Broschüre beitragen.

Zusammenfassung

Die Trikuspidalklappe (TV) reguliert den unidirektionalen Fluss von sauerstofffreiem Blut vom rechten Vorhof zum rechten Ventrikel. Der Fernseher besteht aus drei Flugblättern mit jeweils einzigartigem mechanischem Verhalten. Diese Variationen zwischen den drei TV-Flugblättern können besser verstanden werden, indem ihre vier anatomischen Schichten untersucht werden, nämlich die Atrialis (Atrialis (A), Spongiosa (S), Fibrosa (F) und Ventricularis (V). Während diese Schichten in allen drei TV-Flugblättern vorhanden sind, gibt es Unterschiede in ihren Dicken und mikrostrukturellen Bestandteilen, die ihr jeweiliges mechanisches Verhalten weiter beeinflussen.

Dieses Protokoll umfasst vier Schritte zur Erläuterung der schichtspezifischen Unterschiede: (i) Charakterisierung des mechanischen und kollagenfaserarchitektonischen Verhaltens des intakten TV-Merkblatts, (ii) Trennung der zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) des TV-Broschüres, (iii) Durchführung der gleichen Charakterisierungen für die zusammengesetzten Schichten und (iv) Durchführung von Post-hoc-Schichten histologische Beurteilung. Dieses experimentelle Framework ermöglicht auf einzigartige Weise den direkten Vergleich des intakten TV-Gewebes mit jeder seiner zusammengesetzten Schichten. Dadurch können mit diesem Protokoll detaillierte Informationen über die Mikrostruktur und biomechanische Funktion der TV-Prospekte gesammelt werden. Solche Informationen können möglicherweise verwendet werden, um TV-Computermodelle zu entwickeln, die Leitlinien für die klinische Behandlung von TV-Erkrankungen liefern sollen.

Einleitung

Der Fernseher befindet sich zwischen dem rechten Vorhof und dem rechten Ventrikel des Herzens. Während des gesamten Herzzyklus reguliert der Fernseher den unidirektionalen Blutfluss durch zyklisches Öffnen und Schließen des TV Anterior Leaflet (TVAL), des TV posterior Leaflet (TVPL) und des TV septal leaflet (TVSL). Diese Blättchen sind komplex und haben vier verschiedene anatomische Schichten - die Atrialis (A), die Spongiosa (S), die Fibrosa (F) und die Ventricularis (V) - mit einzigartigen mikrostrukturellen Bestandteilen. Die Elastinfasern in der Atrialis und im Ventrikelbereich tragen dazu bei, das Gewebe nach mechanischer Belastung wieder in seine unverformte Geometrie zu versetzen1. Im Gegensatz dazu enthält die Fibrose ein dichtes Netzwerk von wellenförmigen Kollagenfasern, die zur Tragfähigkeit der Blättchenbeitragen 2. Die Spongiosa, die hauptsächlich aus Glykosaminoglykanen besteht, wurde hypothetisch angenommen, dass sie während der Herzklappenfunktion3 das Scheren zwischen den Blattschichten ermöglicht. Während alle drei Blatttypen die gleichen anatomischen Schichten haben, gibt es Variationen in den Dicken der Schichten und den Verhältnissen der Bestandteile, die Auswirkungen auf das spezifische mechanische Verhalten von Flugblättern haben.

Forscher haben die Eigenschaften der TV-Flugblätter mit planaren mechanischen Charakterisierungen, histomorphologischen Bewertungen und optischen Charakterisierungen der Kollagenfaserarchitektur untersucht. Zum Beispiel versuchen planare biaxiale mechanische Charakterisierungen, die physiologische Belastung nachzuahmen, indem sie senkrechte Verschiebungen auf das Gewebe anwenden und die damit verbundenen Kräfte aufzeichnen. Die daraus resultierenden Kraftverschiebungs- (oder Spannungsdehnungs-) Beobachtungen haben gezeigt, dass alle drei TV-Flugblätter nichtlineares, richtungsspezifisches mechanisches Verhalten mit offensichtlicheren blattspezifischen Reaktionen in der radialen Geweberichtung 4,5,6 aufweisen. Es wird angenommen, dass diese blattspezifischen Verhaltensweisen auf Unterschiede in den mikrostrukturellen Eigenschaften zurückzuführen sind, die mit histologischen Standardtechniken beobachtet wurden 6,7. Darüber hinaus zielen die Bildgebung der zweiten harmonischen Generation 6, die Kleinwinkellichtstreuung8 und die polarisierte räumliche Frequenzbereichsabbildung 7 (pSFDI) darauf ab, diese mikrostrukturellen Eigenschaften zu verstehen und haben blattspezifische Unterschiede in der Kollagenfaserorientierung undder Fasercrimp gezeigt, die Auswirkungen auf das beobachtete mechanische Verhalten auf Gewebeebene haben. Diese Studien haben unser Verständnis der Gewebemikrostruktur und ihrer Rolle im Verhalten auf Gewebeebene erheblich verbessert. Bei der experimentellen Verbindung der Gewebemechanik und der zugrunde liegenden Mikrostruktur bleibt jedoch noch viel zu tun.

Vor kurzem führte dieses Labor mechanische Charakterisierungen der TV-Flugblattschichten durch, die in zwei Verbundschichten (A / S und F / V) unter Verwendung einer Mikrodissektionstechnikgetrennt waren 9. Diese früheren Arbeiten hoben Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften der Schichten hervor und halfen, einen Einblick zu geben, wie die geschichtete Mikrostruktur zum mechanischen Verhalten des Gewebes beiträgt. Obwohl diese Untersuchung unser Verständnis der Mikrostruktur des TV-Flugblatts verbesserte, hatte die Technik mehrere Einschränkungen. Erstens wurden die Eigenschaften der Kompositschichten nicht direkt mit dem intakten Gewebe verglichen, was zu einem Mangel an vollständigem Verständnis der Mechanik-Mikrostruktur-Beziehung führte. Zweitens wurde die Kollagenfaserarchitektur der Verbundschichten nicht untersucht. Drittens wurden nur die Schichten des TVAL untersucht, da Schwierigkeiten beim Sammeln der zusammengesetzten Schichten aus den beiden anderen TV-Flugblättern bestanden. Die hierin beschriebene Methode bietet einen ganzheitlichen Charakterisierungsrahmen, der diese Einschränkungen überwindet und vollständige Charakterisierungen der TV-Broschüren und ihrer zusammengesetzten Schichten liefert.

Dieses Papier beschreibt die Mikrodissektionstechnik, die die drei TV-Flugblätter in ihre zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) für biaxiale mechanische und mikrostrukturelle Charakterisierungen 10,11,12 trennt. Dieses iterative Protokoll umfasst (i) biaxiale mechanische Tests und pSFDI-Charakterisierung der intakten Broschüre, (ii) eine neuartige und reproduzierbare Mikrodissektionstechnik zur zuverlässigen Gewinnung der zusammengesetzten TV-Schichten und (iii) biaxiale mechanische Tests und pSFDI-Charakterisierung der zusammengesetzten TV-Schichten. Das Gewebe wurde einer biaxialen Zugbelastung mit verschiedenen Kraftverhältnissen für mechanische Tests ausgesetzt. Dann wurde pSFDI verwendet, um die Kollagenfaserorientierung und -ausrichtung bei verschiedenen belasteten Konfigurationen zu bestimmen. pSFDI bewahrt die native Kollagenfaserarchitektur, ermöglicht eine lastabhängige Analyse und umgeht die typische Notwendigkeit, Gewebe für die Kollagenfaserarchitekturanalyse zu fixieren oder zu löschen, z. B. bei der Bildgebung der zweiten harmonischen Generation oder der Kleinwinkel-Lichtstreuung. Schließlich wurden die Gewebe mit Hilfe von Standard-Histologie-Techniken vorbereitet, um die Gewebemikrostruktur zu visualisieren. Dieser iterative und ganzheitliche Rahmen ermöglicht den direkten Vergleich der mechanischen und mikrostrukturellen Eigenschaften der TV-Broschüre mit ihren zusammengesetzten Schichten.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Oklahoma genehmigt. Tierisches Gewebe wurde von einem USDA-zugelassenen Schlachthof erworben.

1. Biaxiale mechanische Charakterisierung

  1. Gewebepräparation
    1. Holen Sie sich eine TV-Broschüre aus dem Gefrierschrank, Rasierklingen, einen chirurgischen Stift, eine Pinzette, eine Pipette mit deionisiertem (DI) Wasser und eine Schneidematte. Tauen Sie die TV-Broschüre mit 2-3 Tropfen DI-Wasser bei Raumtemperatur auf.
      HINWEIS: DI-Wasser wird anstelle von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verwendet, um PBS-induzierte Schwierigkeiten bei der Schichtmikrodissektion zu vermeiden.
    2. Legen Sie die Probe flach auf die Schneidematte, wobei die Ventricularis-Schicht (d. h. die Oberfläche mit den Chordae-Einsätzen) nach oben zeigt. Positionieren Sie die Probe so, dass die radiale Richtung mit der Y-Richtung und die Umfangsrichtung mit der X-Richtung übereinstimmt.
      HINWEIS: Die Umfangsrichtung orientiert sich am Umfang des Ventils.
    3. Untersuchen Sie die Chordae-Einfügestellen des Gewebes. Bestimmen Sie eine Fläche, idealerweise ~ 12 x 12 mm, mit der geringsten Anzahl großer Chordae-Einfügungen, während Sie extrem dünne (d. h. transparente) Bereiche vermeiden (Abbildung 1).
    4. Drehen Sie die Probe um, so dass die Vorhofoberfläche (dh die Oberfläche ohne Chordae-Einfügungen) nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Umfangs- und Radialflugblattrichtungen an der X- bzw. Y-Achse ausgerichtet bleiben.
    5. Schneiden Sie eine quadratische 12 x 12 mm große Probe aus dem Gewebe der Packungsbeilage, die die in Schritt 1.1.3 identifizierten großen Chordaeinsätze oder dünnen Bereiche vermeidet. Entfernen Sie die beschnittenen Teile des Blattgewebes mit der Pinzette und legen Sie sie in einen Abfallbehälter.
      1. Wenn es nicht möglich ist, große Chorda-Insertionen vollständig zu vermeiden, schneiden Sie die Gewebe so, dass sie sich entlang des Randes der quadratischen Probe befinden. Das Vermeiden von Chordae-Insertionen ist wichtig, da es hilft, Probleme für die spätere Mikrodissektion zu vermeiden.
    6. Verwenden Sie einen chirurgischen Stift, um einen kleinen Punkt in der oberen rechten Ecke zu platzieren, um die Ausrichtung der Probe zu verfolgen. Lassen Sie die Tinte ca. 30 s trocknen.
    7. Drehen Sie die Probe mit der ventrikulären Oberfläche (d. h. der Oberfläche mit Akkordeinsätzen) nach oben. Schneiden Sie die Akkordansätze auf der Rückseite des Gewebes ab, indem Sie die Chordae von der Packungsbeilage aus dehnen und mit einer Rasierklinge in der Nähe ihrer Einfügestelle schneiden. Drehen Sie die Probe erneut um, so dass die Vorhofoberfläche (d. h. die glatte Oberfläche) nach oben zeigt.
  2. Dickenmessung
    1. Rufen Sie einen berührungslosen Laser-Wegsensor auf. Nullen Sie den Wegsensor auf einem flachen Abschnitt der Schneidmatte in der Nähe des beschnittenen Gewebes.
      ACHTUNG: Strahlen Sie den Laser nicht direkt in die Augen.
    2. Positionieren Sie den Laser über dem zentralen Bereich der Probe. Entfernen Sie die unter der Oberfläche des Prospekts eingeschlossene Luft, da dies zu Messfehlern führen kann. Um eingeschlossene Luft freizusetzen, verwenden Sie entweder eine Pinzette, um die Blase an den Rand des Gewebes zu drücken, oder heben Sie eine Ecke des Gewebes an.
    3. Notieren Sie sich die Dicke, die auf dem Display des Wegsensors angezeigt wird. Wiederholen Sie zwei weitere Messungen an anderen Stellen der Probe.
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche Packungsblattdicke anhand der drei im vorherigen Schritt aufgezeichneten Messungen. Verwenden Sie diesen Wert beim Erstellen der biaxialen mechanischen Charakterisierungsprotokolle.
  3. Biaxialer Testeraufbau und Gewebemontage
    1. Bereiten Sie ein DI-Wasserbad bei 37 °C gemäß den Richtlinien des Testsystems vor, um die Temperatur unter in vivo physiologischen Bedingungen sicherzustellen.
    2. Holen Sie die Pinzette, die Gewebeprobe, das Montagematerial, ein fein gespitztes Werkzeug, flüssigen Cyanacrylatkleber und schwarz lackierte Glasperlen (Durchmesser: 300-500 μm).
      HINWEIS: Das Montagematerial umfasst die Zinken, die Montagebrücke und den Montagegummi.
    3. Montieren Sie die Gewebeprobe im Testsystem. Stellen Sie sicher, dass die Umfangsrichtung des Gewebes mit der X-Richtung übereinstimmt, die durch den zuvor in Schritt 1.1.6 platzierten Punkt unterstützt werden kann.
      HINWEIS: Die hier verwendeten Zinken sollten gleichmäßig über die gesamte Gewebekantenlänge verteilt sein. Die effektive Kantenlänge wird für das intakte Gewebe auf 10 mm und für die Verbundschichten auf >3,3 mm festgelegt.
  4. Platzierung von Fiducial-Markern
    1. Identifizieren Sie den zentralen quadratischen Bereich eines Drittels des montierten Gewebes. Verwenden Sie die ungefähren Ecken dieses Bereichs für die Platzierung der Fiducial-Markierung.
    2. Legen Sie Glasperlen in ein offenes Wiegeboot und erstellen Sie einen kleinen Pool mit flüssigem Cyanacrylatkleber in einem separaten Wiegeboot. Beschichten Sie die Oberseite des feinbestückten Werkzeugs mit einer kleinen Menge Kleber. Tupfen Sie überschüssigen Kleber auf die Seite des Wiegeboots.
    3. Erstellen Sie eine Ecke des zentralen quadratischen Arrays von einem Drittel, indem Sie die mit Leim beschichtete Spitze vorsichtig auf das Gewebe drücken. Nehmen Sie mit einer Pinzette eine Glasperle und legen Sie sie vorsichtig auf den Klebepunkt. Verwenden Sie die Kamera des biaxialen Prüfgeräts, um Hilfe bei der Platzierung der Perle zu erhalten.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 und 1.4.3 für drei weitere Perlen, bis das quadratische Array abgeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass die Perlen sicher befestigt sind und ihre jeweiligen Klebepunkte sich nicht berühren oder zusammenkleben. Trocknen Sie den Kleber, bevor Sie das Gewebe in das Wasserbad senken.
      1. Wenn die Perlen zusammengeklebt sind, warten Sie, bis der Kleber getrocknet ist, und verwenden Sie dann die Pinzette, um die Perle oder den Kleber vorsichtig zu greifen und vom Gewebe zu ziehen.
        HINWEIS: Der Kleber und die Perle(n) sollten sich lösen, damit die Perlenplatzierung erneut versucht werden kann.
  5. Vorkonditionierung
    1. Erstellen Sie ein kraftgesteuertes Vorkonditionierungsprotokoll, bei dem das Gewebe mit Kantenlänge und -dicke sechs Wiederholungen der äquibiaxialen Belastung bis zu einer Spitzenmembranspannung T Peak von 40 N/m mit einer Vorspannung von 3% × T Peak10 und Dehnungs- und Erholungszeiten von jeweils 30 s erfährt.
      1. Erstellen Sie ein beliebiges Testverzeichnis, in dem die Daten für zukünftige Berechnungen vorübergehend gespeichert werden. Stellen Sie die Laderate auf 4,42 N/m ein.
      2. Erstellen Sie einen neuen Testparametersatz mit dem Namen Preconditioning0. Legen Sie die Steuermodi X-Achse und Y-Achse auf Erzwingen und Einstellen der Steuerungsfunktionen auf Step fest. Definieren Sie die Lastgröße als die Kraft, die dem T-Peak zugeordnet ist, d. h. fpeak = Tpeak · L. Definieren Sie die Vorspanngröße nur für die erste Wiederholung als 3% des f-Peaks und definieren Sie sowohl die Dehnungsdauer als auch die Erholungsdauer als 30 s. Definieren Sie die Anzahl der Wiederholungen als 10.
        HINWEIS: Der berechnete Peak erster Piola-Kirchhoff-Stress, d.h. P-Peak = T-Peak/t, kann bei dünnerem Gewebe 200 kPa überschreiten, was während des Tests zu Geweberissen führen kann. In diesen Szenarien wurde die maximale Membranspannung auf eine maximale erste Piola-Kirchhoff-Spannung von 200 kPa eingestellt.
    2. Führen Sie das Vorkonditionierungsprotokoll aus. Zeichnen Sie nach der Vorkonditionierung die aktuellen X- und Y-Abmessungen der Probe für die Verwendung in den biaxialen Prüfprotokollen auf.
  6. Erstellung und Ausführung von biaxialen Prüfprotokollen
    1. Bestimmen Sie die Zeit, die erforderlich ist, um die äquibiaxiale Spitzenkonfiguration aus der nachgelagerten Konfiguration mit der gewünschten Verdrängungsrate zu erreichen. Berechnen Sie unter Berücksichtigung einer konstanten Verdrängungsrate die Ladezeiten für die verbleibenden Ladeverhältnisse (d. h. T XX:T YY = 1:0,5 und T XX:TYY = 0,5:1).
    2. Ziehen Sie die Linearantriebe manuell an, um die Zielkräfte für ein bestimmtes Ladeverhältnis anzupassen. Wiederholen Sie diesen Vorgang und notieren Sie die Prospektabmessungen für alle Ladeverhältnisse.
    3. Bereiten Sie ein verdrängungskontrolliertes Testprotokoll vor, das das Gewebe innerhalb der in Schritt 1.6.1 festgelegten Zeiten biaxial von der nachkonditionierten Konfiguration zu den in Schritt 1.6.2 aufgezeichneten Konfigurationen (d. h. T XX:T YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1) verschiebt. Stellen Sie sicher, dass jedes Protokoll über drei Be- / Entladezyklen verfügt, um das mechanische Verhalten zu wiederholen.
      1. Erstellen Sie ein Testverzeichnis, in dem die Daten für zukünftige Berechnungen gespeichert werden. Stellen Sie sicher, dass der Verzeichnisname mit dem aktuellen Exemplar übereinstimmt.
      2. Erstellen Sie einen neuen Testparametersatz mit dem Namen 1:1, legen Sie die Steuermodi X-Achse und Y-Achse auf Verschiebung fest und legen Sie die Steuerungsfunktionen auf Ramp fest. Definieren Sie die Dehnungsgröße als die in Schritt 1.6.1 aufgezeichnete Konfiguration. Definieren Sie die Vorspanngröße als 3 % des f-Peaks für nur die erste Wiederholung und definieren Sie sowohl die Dehnungsdauer als auch die Erholungsdauer als die in Schritt 1.6.1 aufgezeichnete Zeit. Definieren Sie die Anzahl der Wiederholungen als 3.
      3. Wiederholen Sie Schritt 1.6.3.2 für die verbleibenden Ladeverhältnisse (d. h. T XX:T YY = 1:0,5 und T XX:TYY = 0,5:1), außer die Vorspanngröße als nicht angewendet zu definieren. Stellen Sie sicher, dass die Dehnungsgröße, die Dehnungsdauer und die Wiederherstellungsdauer mit den in Schritt 1.6.2 aufgezeichneten übereinstimmen.
        HINWEIS: Für Spannungs- und Dehnungsanalysen werden nur Daten aus dem letzten (dritten) Zyklus verwendet.
    4. Führen Sie die verdrängungsgesteuerten Protokolle aus. Nach Abschluss der biaxialen Tests bringen Sie das Gewebe in seine nachgelagerten Abmessungen zurück.
      HINWEIS: Der Test sollte sofort abgebrochen werden, wenn das Gewebe zu reißen beginnt.
  7. Weitere Charakterisierungen
    1. Lassen Sie das Gewebe in DI-Wasser eingetaucht und am biaxialen Testsystem montiert. Führen Sie die pSFDI-Bildgebung wie in den Schritten 2.1-2.3 beschrieben durch.
    2. Demontieren Sie das Gewebe. Wenn es sich um ein intaktes Gewebe handelt, fahren Sie mit der in den Schritten 3.1-3.7 beschriebenen Mikrodissektion fort. Wenn nicht, sammeln Sie die Histologie nach Schritt 3.7.
      HINWEIS: Das DI-Wasserbad kann noch am selben Tag für nachträgliche Charakterisierungen verwendet werden.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 1.2-1.7 mit den nach der Mikrodissektion erworbenen A/S- und F/V-Schichten (Schritte 3.1-3.6).
      HINWEIS: Die Wiederholung des Testprotokolls für die Schichten ermöglicht einen direkten Vergleich des intakten Gewebes mit seinen eigenen Schichten.
  8. Biaxiale Prüfdaten-Nachbearbeitungsverfahren
    1. Führen Sie eine digitale Bildkorrelation der aufgenommenen biaxialen Testbilder durch, um die zeitabhängigen Markerpositionen zu bestimmen. Berechnen Sie die treuhänderischen Markerverschiebungen über Eq (1). 5
      figure-protocol-1 (1)
      Hierbei sind x i(t), x i und d i(t) der zeitabhängige Ort, der anfängliche (Referenz-) Ort und die Verschiebung von Marker i.
    2. Berechnen Sie den Verformungsgradienten F, indem Sie die fiducialen Marker als bilineares finites Element mit vier Knoten betrachten, wie in Eq (2)5 gezeigt.
      figure-protocol-2 (2)
      Dabei sind B Xi und BYi die Ableitungen der Formfunktionen für Knoten i in X- bzw. Y-Richtung und u i(t) und v i(t) die Komponenten von d i(t): d i(t) = [u i(t), vi(t)]T.
    3. Berechnen Sie die angelegte erste Piola-Kirchhoff-Spannung P unter Verwendung der aufgezeichneten Kräfte, wie in Eq (3)5
      figure-protocol-3 (3)
      P XX und PYY sind die X- und Y-Komponenten von P; L und t sind die Gewebekantenlänge und -dicke; f X und f Y sind die Kräfte, die in X- und Y-Richtung aufgezeichnet werden.
    4. Bestimmen Sie bei Bedarf andere Dehnungs- und Spannungsmessungen,13 die richtige Cauchy-Green-Deformation C = F T/F, die Green-Lagrange-Dehnung E = (C - I)/2, die Cauchy-Spannung σ = J-1 PF T und die zweite Piola-Kirchhoff-Spannung S = F-1P.
      HINWEIS: Hierin ist I ein Identitätstensor zweiter Ordnung, und J = det(F) ist der Jacobianer des Deformationsgradienten F.

2. Polarisierte räumliche Frequenzbereichsabbildung

  1. Systemvorbereitung
    HINWEIS: Auf Wunsch können die fiducialen Marker vor den folgenden Schritten aus dem Gewebe entfernt werden.
    1. Zentrieren Sie die pSFDI-Vorrichtung über der Probe (Abbildung 2). Schalten Sie den Projektor ein und beleuchten Sie die Probe mit 490 nm (Cyan) Licht.
    2. Öffnen Sie die Kamerasoftware und überprüfen Sie das Sichtfeld der Kamera. Stellen Sie sicher, dass die Probe im Rahmen zentriert ist und vollständig im Sichtfeld enthalten ist.
    3. Wenn es sich bei der montierten Probe um ein intaktes Flugblatt handelt, passen Sie die Helligkeit des DLP-Projektors (Digital Light Processing) an, um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig und ohne Blendung auf der Gewebeoberfläche beleuchtet wird. Passen Sie die Helligkeit nicht an, wenn es sich bei der Probe um eine der zusammengesetzten Ebenen handelt.
    4. Drehen Sie den Polarisator über seinen gesamten Bewegungsbereich, um mögliche Blendungen oder Schmutz auf der Polarisatorlinse zu erkennen. Reinigen Sie die Polarisationslinse bei Bedarf sorgfältig mit einem Mikrofasertuch.
  2. Datensammlung
    HINWEIS: Die folgende Datenerfassung kann mithilfe von Software wie LabVIEW oder Python automatisiert werden.
    1. Bewegen Sie den Polarisator in seine Ausgangsposition – idealerweise ausgerichtet auf eine der biaxialen Prüfachsen. Nehmen Sie ein Graustufenbild auf und speichern Sie es auf dem Computer mit der Polarisatorposition (d. h. 0°).
    2. Drehen Sie den Polarisator um 5° und nehmen Sie ein weiteres Graustufenbild auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 37 Bilder zu erhalten, die von 0° bis 180° mit einem 5°-Schritt reichen.
      HINWEIS: Die Bilder der ersten pSFDI-Bildgebungssequenz können vorläufig analysiert werden, um die gewünschte optische Reaktion des Gewebes sicherzustellen. Anweisungen hierzu finden Sie in Schritt 2.3.
    3. Wiederholen Sie die pSFDI-Bildgebungssequenz für andere gewünschte Gewebekonfigurationen, z. B. die Spitzenkonfigurationen der Belastungsprotokolle, die für biaxiale mechanische Tests in Betracht gezogen werden.
  3. pSFDI-Datennachbearbeitungsverfahren
    HINWEIS: Die folgende Methode enthält Schritte für die MATLAB-Programmsprache. Stattdessen kann jedoch jede bevorzugte Sprache (z. B. Python, C ++) verwendet werden.
    1. Verwenden Sie die MATLAB imread()-Funktion, um Arrays zu erstellen, die die pixelweisen Intensitäten der 37 aufgenommenen Bilder enthalten. Ordnen Sie diese der Einfachheit halber als n × m × 37 dreidimensionales Array an, wobei n und m die Anzahl der Pixel entlang der beiden Achsen sind.
    2. Definieren Sie die interessierende Geweberegion (ROI) mit der benutzerdefinierten Funktion grabit().
    3. Passen Sie die Intensitäts- und Polarisationswinkeldaten für jedes ROI-Pixel mithilfe einer 3-Term-Fourierreihe an, wie in Eq (4):
      figure-protocol-4 (4)
      Hierbei ist I(θ) die pixelweise Intensität als Funktion des Polarisationswinkels, und bi sind die Fourier-Konstanten. Verwenden Sie die standardmäßige lineare Regression der kleinsten Quadrate, um bi zu bestimmen.
    4. Bestimmen Sie die pixelweise Faserorientierung als Polarisationswinkel, der dem Maximalwert von I(θ) zugeordnet ist. Berechnen Sie den Grad der optischen Anisotropie (DOA) über Eq (5).
      figure-protocol-5 (5)
    5. Verwenden Sie plot() und histogram(), um die erfasste Faserorientierung und die DOA-Werte zu visualisieren. Speichern Sie die verarbeiteten Ergebnisse für die spätere Verwendung.

3. Mikrodissektion von Trikuspidalklappen-Falten-Verbundschichten

  1. Gewebebefestigung auf Wachsbrett
    1. Sammeln Sie die erforderlichen Materialien: Wachsbrett, DI-Wasser, Pipette, Skalpell, Mikroschere, dünne Pinzette, gebogene Pinzette, dicke Pinzette und Stifte.
      HINWEIS: Verwenden Sie nur eine Pinzette ohne Zähne oder Griffe, da eine Pinzette dieses Typs bei der Dissektion sehr leicht das dünne Gewebe der A / S-Schicht reißen kann.
    2. Demontieren Sie das Gewebe vom biaxialen Tester und messen Sie seine Dicke mit dem in Schritt 1.2 beschriebenen Laser-Wegsensor. Legen Sie das Gewebe auf das Wachsbrett.
    3. Untersuchen Sie die ventrikuläre Seite des Gewebes auf große Chordae-Insertionen. Beachten Sie die Position dieser Einfügungen, um sie während der Dissektion zu vermeiden (Ergänzende Abbildung S1). Machen Sie ein Foto als Referenz.
    4. Verteilen Sie das Gewebe flach auf dem Wachsbrett mit dem Vorhof nach oben. Befestigen Sie das Gewebe mit den Stiften auf der Platte:
      1. Platzieren Sie in jeder Ecke des Gewebes einen Stift, der vom Gewebe abgewinkelt ist (zur besseren Betrachtung) und das Gewebe leicht straff zieht (Abbildung 3A). Tun Sie dies im oder gegen den Uhrzeigersinn. Stellen Sie sicher, dass sich die Stifte außerhalb der Löcher befinden, die durch die Zinken erzeugt werden, wenn Sie das Gewebe montieren.
      2. Passen Sie die Stiftplatzierung leicht an, um sicherzustellen, dass das Gewebe straff und in einer quadratischen Konfiguration ist (Abbildung 3B), so dass das Gewebe flach liegt und sich während der Mikrodissektion der Schicht nicht verschiebt.
      3. Platzieren Sie bei Bedarf während der Dissektion Stifte entlang der Seite des Gewebes, um das Gewebe mehr zu dehnen. Denken Sie beim Platzieren und Angeln zusätzlicher Stifte daran, dass diese während der Dissektion umgangen werden müssen.
      4. Entfernen Sie die Glasperlenmarkierungen.
        HINWEIS: Der folgende Schritt ist optional. Das hinzugefügte DI-Wasser hilft, die Hydratation des Gewebes aufrechtzuerhalten und verhindert, dass das Gewebe während der gesamten Mikrodissektion an sich selbst haftet.
      5. Legen Sie mit einer Pipette DI-Wasser auf die Oberfläche des Gewebes, so dass es das Gewebe vollständig und blasenartig bedeckt. Füllen Sie das DI-Wasser während der gesamten Dissektion nach Bedarf auf.
  2. Machen Sie die erste Ecke.
    1. Wählen Sie eine Ecke des gepinnten Exemplars aus, um mit der Sezierung zu beginnen. Vermeiden Sie große Chordae-Insertionen und extrem dünne Bereiche.
    2. Machen Sie einen Schnitt in der A / S-Schicht, indem Sie das Skalpell leicht über die Gewebeoberfläche entlang der Montagelöcher aus mechanischen Tests ziehen (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass der Schnitt mindestens 5 mm lang ist und die Kanten des Schnitts beginnen, auseinander zu ziehen, wodurch die darunter liegende F / V-Schicht sichtbar wird.
    3. Verwenden Sie die dünne Pinzette (ohne scharfe Spitze), um den Schnitt fest entlang zu reiben und die Kanten des Schnitts auseinander zu ziehen (Ergänzende Abbildung S2).
      1. Wenn der Schnitt in der A / S-Schicht nicht beginnt, sich auseinander zu ziehen, zeichnen Sie den gleichen Schnitt mit dem Skalpell erneut leicht durch, bis er dies zu tun beginnt. Achten Sie darauf, nicht zu tief in das Gewebe zu schneiden (über die A / S-Kompositschicht hinaus), da dies die saubere Trennung der Schichten erschwert.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.2.3, um einen zweiten Schnitt senkrecht zum ersten Schnitt vorzunehmen (Abbildung 3D). Stellen Sie sicher, dass die beiden Schnitte miteinander verbunden sind und eine Ecke bilden.
      1. Wenn die beiden Schnitte nicht miteinander verbunden sind, führen Sie die dünne Pinzette unter den kleinen Gewebebereich, der die beiden Schnitte trennt (Ergänzende Abbildung S3). Verwenden Sie dann vorsichtig die Schere, um das Gewebe zu schneiden.
  3. Schälen Sie das Gewebe von der Ecke.
    1. Reiben Sie die Schnitte mit der dünnen Pinzette entlang, bis sich das Gewebe von der F / V-Schicht zu lösen beginnt. Sobald ein kleines Stück Gewebe getrennt ist, greifen Sie es mit der Pinzette und ziehen Sie es vorsichtig an, um die zusammengesetzten Schichten weiter zu trennen.
      HINWEIS: Legen Sie die Spitze der dünnen Pinzette beim Greifen immer über den Rand des Gewebes hinaus. Andernfalls könnten sie versehentlich ein Loch in die A / S-Verbundschicht stechen.
    2. Schälen Sie das Gewebe weiter und reiben Sie die Naht ein, bis sie das Ende der beiden Schnitte für die Ecke erreicht. Wechseln Sie während dieses Vorgangs zu einer größeren Pinzette, um das Gewebe für den Peeling-Prozess zu greifen, um ein unerwünschtes Reißen und Reißen der A / S-Verbundschicht zu verhindern.
      1. Wenn die erste versuchte Ecke größere Probleme mit der Trennung hat, versuchen Sie es mit einer anderen Ecke als Ausgangspunkt (gehen Sie zurück zu Schritt 3.2).
  4. Verlängern Sie die Schnitte, schälen Sie das Gewebe und machen Sie eine zweite Ecke.
    1. Verlängern Sie die beiden Schnitte für die erste Ecke, indem Sie die Skalpellspitze am unteren Rand jedes Schnitts platzieren und leicht entlang der Gewebeoberfläche ziehen (Abbildung 4A). Stellen Sie sicher, dass alle Verlängerungsschnitte mindestens 5 mm groß sind und die Schnittverlängerungen mit den ursprünglichen Schnitten verbunden sind und weiterhin den Zinken- oder Nahtlöchern folgen.
      HINWEIS: Wenn der Verlängerungsschnitt zu tief ist, muss das bevorstehende Peeling genau überwacht werden, um sicherzustellen, dass Abschnitte der Fibrose nicht mit der A / S-Verbundschicht getrennt werden (Abbildung 5A).
    2. Verlängern Sie die Schnitte weiter und schälen Sie die obere A/S-Verbundschicht zurück, während Sie die Naht reiben, bis eine Seite fertig ist. Beachten Sie, dass das Gewebe entlang eines Schnitts vollständig getrennt wird; Stellen Sie sicher, dass die Naht zwischen den A/S- und F/V-Verbundschichten gerade ist (Abbildung 4B).
    3. Wiederholen Sie die Anweisungen in Schritt 3.2 und Schritt 3.3, um eine zweite Ecke senkrecht zum Ende der vollständig abgeschälten Seite zu erstellen (Abbildung 4C).
  5. Trennen Sie die A/S-Ebene vollständig.
    1. Verlängern Sie die verbleibenden Schnitte, während Sie große Chordae-Einfügungen vermeiden. Setzen Sie die Trennung der A/S- und F/V-Schichten fort, indem Sie die für die erste Ecke verwendeten Reib- und Zugtechniken anwenden. Notieren Sie sich mehrere Überlegungen oder Probleme, die während dieses Prozesses auftreten können:
      1. Schließen Sie die Chorda-Insertionen nur dann aus dem A/S-Trennbereich aus (Abbildung 5B), wenn dieser Ausschluss eine A/S-Probe zulässt, die groß genug für experimentelle Charakterisierungen ist (>3,3 mm).
      2. Wenn das Gewebe reißt oder sich ein Loch bildet, hören Sie sofort auf, das Gewebe zu trennen. Um zu verhindern, dass sich eine Pinzette verfängt, legen Sie die Schere in ein sich bildendes Loch und schneiden Sie das Gewebe von der Mitte weg. Wenn sich der Defekt entlang der Trennnaht bildet, beginnen Sie mit der Trennung des Gewebes entlang einer anderen Kante, um ein weiteres Reißen zu verhindern (Abbildung 5C).
      3. Suchen Sie nach Verbindungen zwischen den Schichten, die beim Trennen des Gewebes auftreten können, und verhindern Sie eine weitere Trennung des Gewebes ohne ein hohes Risiko des Reißens (Abbildung 5D). Beachten Sie, dass dies dünne, aber starke Stränge sind, die sorgfältig mit einer Schere geschnitten werden müssen. Vermeiden Sie es, ein Loch in der A / S-Schicht zu erzeugen oder nach unten in die F / V-Schicht zu schneiden, da dies zu einer ungleichmäßigen Trennung führen würde.
      4. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis die größtmögliche Probe der A/S-Schicht getrennt wurde. Markieren Sie die Ausrichtung der Probe mit dem Operationsstift (Abbildung 6A).
  6. Beenden Sie die Sezierung.
    1. Verwenden Sie die Schere, um entlang der Trennnaht für den verbleibenden Geweberand zu schneiden (Abbildung 6B). Stellen Sie sicher, dass dieser Schnitt so nah wie möglich an der Trennnaht liegt.
    2. Legen Sie die abgetrennte A/S-Verbundschicht flach auf die Schneidmatte. Verwenden Sie bei Bedarf das Skalpell, um die Kanten des Gewebes zu begradigen und eine quadratische Gewebeform zu schaffen, die für biaxiale mechanische Tests geeignet ist. Legen Sie die A / S-Schicht in DI-Wasser, bis sie zum Testen bereit ist.
    3. Markieren Sie die Ausrichtung der F/V-Schicht, die auf der Wachsplatte verbleibt. Schneiden Sie das größtmögliche Quadrat aus dem Bereich aus, in dem die A/S-Schicht entfernt wurde (Abbildung 6C), und legen Sie sie dann in DI-Wasser.
  7. Histologie
    1. Entfernen Sie zwei Gewebestreifen - ausgerichtet auf die umlaufende und radiale Richtung - für die Verwendung in der Histologie. Verwenden Sie verschiedene Protokolle für die intakten und die zusammengesetzten Schichten (d. h. A / S und F / V).
      1. Für die intakte Schicht nehmen Sie die Proben aus dem Gewebe, das an der Wachsplatte befestigt bleibt. Verwenden Sie das Gewebe außerhalb der Zinken- / Nahtlöcher, da dieser Teil des Gewebes nicht seziert wurde und das intakte Blättchen darstellt.
      2. Für die A/S- und F/V-Verbundschichten sollten Histologieproben erst nach vollständiger Prüfung und Bildgebung gesammelt werden. Demontieren Sie die Probe aus dem biaxialen Testsystem, legen Sie das Gewebe flach auf eine Schneidematte und schneiden Sie die umlaufenden und radialen Streifen mit einer Rasierklinge aus.
    2. Legen Sie die ausgeschnittenen Streifen in Gewebekassetten und tauchen Sie die Kassetten in 10% Formalin.
    3. Verwerfen Sie das restliche Gewebe. Reinigen Sie die Sezierwerkzeuge mit Reinigungsmasse (siehe Materialtabelle).
    4. Nach 24-48 h Fixierung die Kassetten in Ethanol überführen, wo sie bis zur histologischen Verarbeitung und Färbung auf unbestimmte Zeit gelagert werden können.
      HINWEIS: Diese histologische Analyse kann bestätigen, dass die Mikrodissektion erfolgreich ist. ACHTUNG: 10% Formalin verursacht Hautreizungen und schwere Augenschäden. Es kann auch eine allergische Reaktion oder Krebs durch Inhalation verursachen. Tragen Sie bei der Handhabung eine geeignete persönliche Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrillen und einen Laborkittel und verwenden Sie sie nur in gut belüfteten Räumen, z. B. in einem Abzug. Stellen Sie bei Nichtgebrauch sicher, dass der Vorratsbehälter fest verschlossen ist.

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Ergebnisse

Die Mikrodissektion ergibt A/S- und F/V-Proben mit relativ gleichmäßigen Dicken, die an einem (kommerziellen) biaxialen Prüfgerät montiert werden können. Eine histologische Analyse des intakten Blättchens und der beiden sezierten Schichten wird überprüfen, ob das Gewebe entlang der Grenze zwischen Sppongiosa und Fibrosa korrekt getrennt wurde (Abbildung 7). Zusätzlich können die histologischen Mikroaufnahmen verwendet werden, um die Dicken der Gewebeschichten und die Massenanteile mit der Im...

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Diskussion

Zu den kritischen Schritten für das Protokoll gehören: (i) die Schichtmikrodissektion, (ii) die Gewebemontage, (iii) die treuhänderische Markerplatzierung und (iv) der pSFDI-Aufbau. Eine geeignete Schichtmikrodissektion ist der wichtigste und schwierigste Aspekt des hierin beschriebenen Verfahrens. Bevor eine Untersuchung mit dieser Technik eingeleitet wird, sollten die Dissektoren langfristige Praxis mit der Mikrodissektionstechnik und allen drei TV-Broschüren haben. Der Dissektor sollte sicherstellen, dass die Verbunds...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG27760143) und die Presbyterian Health Foundation unterstützt. KMC wurde zum Teil vom Undergraduate Research Opportunity Program der University of Oklahoma (OU) und dem Honors Research Apprenticeship Program unterstützt. DWL wurde zum Teil durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (GRF 2019254233) und das American Heart Association/Children's Heart Foundation Predoctoral Fellowship (Award #821298) unterstützt. All diese Unterstützung wird dankbar anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10% Formalinlösung, neutral gepuffertSigma-AldrichHT501128-4L
Alconox ReinigungsmittelAlconoxReinigungsmasse
BioTester - Biaxial TesterCellScale Biomaterials Testing1,5 N Wägezelle Kapazität
SchneidematteDahleB0027RS8DU
deionisiertes WasserN/A
Werkzeug mit feiner SpitzeHTI INSTRUMENTSNSPLS-12
Pinzette - Gebogenewissenschaftliche Laborartikel16122
Pinzetten - Dickewissenschaftliche Laborartikel161001078
Pinzetten - dünnewissenschaftliche Laborartikel16127
LabJoyCellScale Biomaterialien TestVersion 10.66
Laserverschiebung SensorKeyenceIL-030
Flüssiges Cyanacrylat-KleberLoctite2436365
MATLABMathWorksVersion 2020a
MikroschereHTI InstrumentsCAS55C
PipetteBelmaks360758081051Y4
Polarisiertes Bildgebungsgerät im OrtsfrequenzbereichN/AHergestellt im eigenen Haus mit einem digitalen Lichtprojektor, einem linearen Polarisator, einer rotierenden Polarisatorhalterung und einer Kamera mit ladungsgekoppeltem Gerät.
Weitere Informationen finden Sie in doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699).
SkalpellTHINKPRICETP-SCALPEL-3010
Einschneidige Industrie-Rasierklingen (Chirurgischer Kohlenstoffstahl)VWR InternationalH3515541105024
Chirurgischer StiftLabAiderLAB-Skin-6
T-PinsBusiness SourceBSN32351
Wax BoardN/AIm eigenen Haus unter Verwendung von Modellierwachs und Backblech hergestellt
Wiegen BootPure Pontamdo-azoc-1030

Referenzen

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Biaxiale mechanische PrüfungKollagenfaserarchitekturTrennung von Verbundschichtenhistologische AnalyseGewebeschichtdickemechanisches Verhaltenpolarisierte Bildgebung
Schichtmikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern zur biaxialen mechanischen Charakterisierung und mikrostrukturellen Quantifizierung
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