Schichtmikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern zur biaxialen mechanischen Charakterisierung und mikrostrukturellen Quantifizierung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die biaxiale mechanische Charakterisierung, die polarisierte Lokalfrequenzbereichs-Imaging-basierte Kollagenquantifizierung und die Mikrodissektion von Trikuspidalklappenblättern. Die bereitgestellte Methode erläutert, wie die Prospektschichten zum ganzheitlichen Verhalten der Broschüre beitragen.

Zusammenfassung

Die Trikuspidalklappe (TV) reguliert den unidirektionalen Fluss von sauerstofffreiem Blut vom rechten Vorhof zum rechten Ventrikel. Der Fernseher besteht aus drei Flugblättern mit jeweils einzigartigem mechanischem Verhalten. Diese Variationen zwischen den drei TV-Flugblättern können besser verstanden werden, indem ihre vier anatomischen Schichten untersucht werden, nämlich die Atrialis (Atrialis (A), Spongiosa (S), Fibrosa (F) und Ventricularis (V). Während diese Schichten in allen drei TV-Flugblättern vorhanden sind, gibt es Unterschiede in ihren Dicken und mikrostrukturellen Bestandteilen, die ihr jeweiliges mechanisches Verhalten weiter beeinflussen.

Dieses Protokoll umfasst vier Schritte zur Erläuterung der schichtspezifischen Unterschiede: (i) Charakterisierung des mechanischen und kollagenfaserarchitektonischen Verhaltens des intakten TV-Merkblatts, (ii) Trennung der zusammengesetzten Schichten (A / S und F / V) des TV-Broschüres, (iii) Durchführung der gleichen Charakterisierungen für die zusammengesetzten Schichten und (iv) Durchführung von Post-hoc-Schichten histologische Beurteilung. Dieses experimentelle Framework ermöglicht auf einzigartige Weise den direkten Vergleich des intakten TV-Gewebes mit jeder seiner zusammengesetzten Schichten. Dadurch können mit diesem Protokoll detaillierte Informationen über die Mikrostruktur und biomechanische Funktion der TV-Prospekte gesammelt werden. Solche Informationen können möglicherweise verwendet werden, um TV-Computermodelle zu entwickeln, die Leitlinien für die klinische Behandlung von TV-Erkrankungen liefern sollen.

Einleitung

Der Fernseher befindet sich zwischen dem rechten Vorhof und dem rechten Ventrikel des Herzens. Während des gesamten Herzzyklus reguliert der Fernseher den unidirektionalen Blutfluss durch zyklisches Öffnen und Schließen des TV Anterior Leaflet (TVAL), des TV posterior Leaflet (TVPL) und des TV septal leaflet (TVSL). Diese Blättchen sind komplex und haben vier verschiedene anatomische Schichten - die Atrialis (A), die Spongiosa (S), die Fibrosa (F) und die Ventricularis (V) - mit einzigartigen mikrostrukturellen Bestandteilen. Die Elastinfasern in der Atrialis und im Ventrikelbereich tragen dazu bei, das Gewebe nach mechanischer Belastung wieder in seine unverformte Ge....

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Oklahoma genehmigt. Tierisches Gewebe wurde von einem USDA-zugelassenen Schlachthof erworben.

1. Biaxiale mechanische Charakterisierung

1. Gewebepräparation
   1. Holen Sie sich eine TV-Broschüre aus dem Gefrierschrank, Rasierklingen, einen chirurgischen Stift, eine Pinzette, eine Pipette mit deionisiertem (DI) Wasser und eine Schneidematte. Tauen Sie die TV-Broschüre mit 2-3 Tropfen DI-Wasser bei Raumtemperatur auf.
      HINWEIS: DI-Wasser wird anstelle von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verwendet, ....

Ergebnisse

Die Mikrodissektion ergibt A/S- und F/V-Proben mit relativ gleichmäßigen Dicken, die an einem (kommerziellen) biaxialen Prüfgerät montiert werden können. Eine histologische Analyse des intakten Blättchens und der beiden sezierten Schichten wird überprüfen, ob das Gewebe entlang der Grenze zwischen Sppongiosa und Fibrosa korrekt getrennt wurde (Abbildung 7). Zusätzlich können die histologischen Mikroaufnahmen verwendet werden, um die Dicken der Gewebeschichten und die Massenanteile mit der Im.......

Diskussion

Zu den kritischen Schritten für das Protokoll gehören: (i) die Schichtmikrodissektion, (ii) die Gewebemontage, (iii) die treuhänderische Markerplatzierung und (iv) der pSFDI-Aufbau. Eine geeignete Schichtmikrodissektion ist der wichtigste und schwierigste Aspekt des hierin beschriebenen Verfahrens. Bevor eine Untersuchung mit dieser Technik eingeleitet wird, sollten die Dissektoren langfristige Praxis mit der Mikrodissektionstechnik und allen drei TV-Broschüren haben. Der Dissektor sollte sicherstellen, dass die Verbunds.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10% Formalinlösung, neutral gepuffert	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Reinigungsmittel	Alconox		Reinigungsmasse
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1,5 N Wägezelle Kapazität
Schneidematte	Dahle	B0027RS8DU
deionisiertes Wasser	N/A
Werkzeug mit feiner Spitze	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Pinzette - Gebogene	wissenschaftliche Laborartikel	16122
Pinzetten - Dicke	wissenschaftliche Laborartikel	161001078
Pinzetten - dünne	wissenschaftliche Laborartikel	16127
LabJoy	CellScale Biomaterialien Test	Version 10.66
Laserverschiebung Sensor	Keyence	IL-030
Flüssiges Cyanacrylat-Kleber	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Mikroschere	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarisiertes Bildgebungsgerät im Ortsfrequenzbereich	N/A		Hergestellt im eigenen Haus mit einem digitalen Lichtprojektor, einem linearen Polarisator, einer rotierenden Polarisatorhalterung und einer Kamera mit ladungsgekoppeltem Gerät. Weitere Informationen finden Sie in doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699).
Skalpell	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Einschneidige Industrie-Rasierklingen (Chirurgischer Kohlenstoffstahl)	VWR International	H3515541105024
Chirurgischer Stift	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Im eigenen Haus unter Verwendung von Modellierwachs und Backblech hergestellt
Wiegen Boot	Pure Ponta	mdo-azoc-1030