Highly-Multiplexed Tissue Imaging mit Raman-Farbstoffen

Summary

Die elektronische präresonanzstimulierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen ist eine neue Plattform für die hochgradig gemultiplexte Epitop-basierte Proteinbildgebung. Hier stellen wir einen praktischen Leitfaden vor, der die Antikörpervorbereitung, die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage und die EPR-SRS-Gewebebildgebung umfasst.

Abstract

Die Visualisierung einer Vielzahl spezifischer Biomarker in Geweben spielt eine wichtige Rolle bei der Erforschung der komplizierten Organisationen komplexer biologischer Systeme. Daher werden stark gemultiplexte Bildgebungstechnologien zunehmend geschätzt. Hier beschreiben wir eine aufstrebende Plattform der hochgemultiplexten Schwingungsbildgebung spezifischer Proteine mit vergleichbarer Empfindlichkeit gegenüber Standard-Immunfluoreszenz über elektronische präresonanzregenerierte Raman-Streuung (epr-SRS) Bildgebung von regenbogenartigen Raman-Farbstoffen. Diese Methode umgeht die Grenze der spektral auflösbaren Kanäle in der konventionellen Immunfluoreszenz und bietet einen optischen One-Shot-Ansatz, um mehrere Marker in Geweben mit subzellulärer Auflösung abzufragen. Es ist im Allgemeinen kompatibel mit Standard-Gewebepräparaten, einschließlich paraformaldehydfixiertem Gewebe, gefrorenem Gewebe und formalinfixiertem paraffineingebettetem (FFPE) menschlichem Gewebe. Wir gehen davon aus, dass diese Plattform ein umfassenderes Bild der Proteininteraktionen biologischer Proben liefern wird, insbesondere für dickes intaktes Gewebe. Dieses Protokoll bietet den Workflow von der Antikörpervorbereitung über die Gewebeprobenfärbung, die SRS-Mikroskopmontage bis hin zur EPR-SRS-Gewebebildgebung.

Introduction

Komplexe Gewebesysteme bestehen aus unterschiedlichen zellulären Subpopulationen, deren räumliche Standorte und Interaktionsnetzwerke mit ihren Funktionen und Funktionsstörungen tief verflochten sind ^1,2. Um die Gewebearchitektur aufzudecken und ihre Komplexität zu hinterfragen, ist die Kenntnis der räumlichen Positionen von Proteinen bei Einzelzellauflösung unerlässlich. Daher wurden stark gemultiplexte Protein-Bildgebungstechnologien zunehmend geschätzt und könnten zu einem Eckpfeiler für die Untersuchung der Gewebebiologie ^{werden 3,4,5}<....

Protocol

Das Protokoll wurde in Übereinstimmung mit dem Tierversuchsprotokoll (AC-AABD1552) durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Columbia University genehmigt wurde.

1. Herstellung von Raman-Farbstoff-konjugierten Antikörpern

1. Bereiten Sie den Konjugationspuffer als ~0,1 M_NaHCO 3 im PBS-Puffer, pH = 8,3, bei 4 °C lagern.
2. N-Hydroxysuccinimidy (NHS) Ester-funktionäre MARS-Sondenlösung (Supplementary Material) als 3 mM in wasserfreiem DMSO herstellen. Die Synthese von MARS-Sonden kann auf frühere Berichte^13,17,18

Results

Abbildung 3 zeigt Beispielbilder von epr-SRS in verschiedenen Proben, einschließlich fixierter Zellen (Abbildung 3A), paraformaldehyd (PFA)-fixiertem Mausgewebe (Abbildung 3B) und formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) menschlichen Proben (Abbildung 3C). Die räumliche Auflösung der SRS-Mikroskopie ist beugungsbegrenzt, die typische laterale Auflösung beträgt ~ 300 nm und die axiale Auflösung bet.......

Discussion

Hier stellen wir das Immuno-eprSRS-Protokoll vor, das allgemein auf gängige Gewebetypen anwendbar ist, einschließlich frisch konservierter Mausgewebe, menschlicher FFPE-Gewebe und gefrorener Mausgewebe. Immuno-eprSRS wurde für ein Panel von Epitopen in Zellen und Geweben validiert, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Diese One-Shot-Plattform eignet sich besonders für Anwendungen, bei denen zyklische Strategien nicht gut funktionieren. Zum Beispiel ist die zyklische Fluoreszenz für dickes Gewebe anspruchsvoll, d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyd, EM Grade	Elektronenmikroskopie Sciences	15710
α-Tubulin	Abcam	ab18251	Primärantikörper
α-Tubulin	BioLegend	625902	Primärantikörper
β-III-Tubulin	BioLegend	657402	Primärantikörper
β-III-Tubulin	Abcam	ab41489	Primäre Antikörper
β-Tubulin	Abcam	ab131205	Primäre Antikörper
Agarose, niedrige Gellling-Temperatur	Sigma Aldrich	A9414	Für die Einbettung des Gehirns
Anti-a-Tubulin-Antikörper, hergestellt in Kaninchen (α-Tubulin)	Abcam	ab52866	Primäre Antikörper
Anti-Calbindin-Antikörper, hergestellt in der Maus (Calbindin)	Abcam	ab82812	Primäre Antikörper
Anti-GABA B-Rezeptor R2  Antikörper aus Meerschweinchen (GABA B-Rezeptor R2)	Millipore Sigma	AB2255	Primäre Antikörper
Anti-GFAP-Antikörper aus Ziege (GFAP)	Thermo Scientific	PA5-18598	Primärantikörper
Anti-Glucagon  Antikörper aus der Maus (Glucagon)	Santa Cruz Biotechnologie	sc-514592	Primäre Antikörper
Anti-Insulin-Antikörper aus Meerschweinchen (Insulin)	DAKO	IR00261-2	Primäre Antikörper
aus der Ratte (MBP)	Abcam	ab7349	Primäre Antikörper
Aus Kaninchen hergestellter Anti-NeuN-Antikörper (NeuN)	Thermo Scientific	PA5-78639	Primäre Antikörper
Anti-Pankreas-Polypeptid (PP)-Antikörper, hergestellt in Ziege – Pankreas-Polypeptid (PP)	Sigma Aldrich	SAB2500747	Primäre Antikörper
Anti-Pdx1-Antikörper aus Kaninchen (Pdx1)	Milipore	06-1379	Primäre Antikörper
Anti-Somatostatin-Antikörper aus Ratte (Somatostatin)	Abcam	ab30788	Primäre Antikörper
Anti-Vimentin-Antikörper aus Hühnerfleisch ( Vimentin)	Abcam	ab24525	Primärantikörper
Bandpassfilter	KR Electronics	KR2724	8 MHz
BNC 50 Ohm Terminator	Mini Circuits	STRM-50
BNC Kabel	Thorlabs	2249-C	Koaxialkabel, BNC Stecker / Stecker
Breitband dielektrischer Spiegel	Thorlabs	BB1-E03	750 - 1100 nm
C57BL/6J Mäuse	Jackson Laboratory	000664
Zentrifuge
Kondensator	Olympus		Ölimmersion, 1,4 N.A.
Cytokeratin 18	Abcam	ab7797	Primäre Antikörper
Cytokeratin 18	Abcam	ab24561	Primäre Antikörper
DC-Netzteil	TopWard	6302D	Bias-Spannung beträgt 64 V
Dichroitische Halterung	Thorlabs	KM100CL	Kinematische Halterung für bis zu 1,3" (33 mm) hohe rechteckige Optik, Linkshänder
Esel Anti-Chicken IgY (H+L)	Jackson ImmunoResearch	703-005-155	Sekundärantikörper für die MARS-Konjugation
Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-005-147	Sekundärantikörper für die MARS-Konjugation
Donkey Anti-Guinea PigG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-005-148	Sekundärantikörper für die MARS-Konjugation
Donkey anti-MigG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-005-151	Sekundärantikörper für die MARS-Konjugation
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-005-152	Sekundärantikörper für die MARS-Konjugation
Donkey anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-005-153	Sekundärantikörper für die MARS-Konjugation
Donkey anti-Sheep IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	713-005-147	Sekundär Antikörper für die MARS-Konjugation
DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EpCAM	Abcam	ab71916	Primäre Antikörper
Ethanol	Sigma Aldrich	443611
Fast-Speed-Look-in-Verstärker	Zurich Instruments	HF2LI	DC - 50 MHz
FFPE Niere Probe	USBiomax	HuFPT072
Fibrillarin	Abcam	ab5821	Primäre Antikörper
Giantin	Abcam	ab24586	Primäre Antikörper
Glucagon	Santa Cruz Biotechnology	sc-514592	Primäre Antikörper
H2B	Abcam	ab1790	Primäre Antikörper
HeLa	ATCC	ATCC CCL-2
High O.D. Bandpassfilter	Chroma Technologie	ET890/220m	Filtern des Stokes-Strahls und Übertragen des Pumpstrahls
Hydrophober Stift	Fisher Scientific	NC1384846
Insulin	ThermoFisher	701265	Primärantikörper
Integriertes SRS-Lasersystem	Angewandte Physik & Elektronik, Inc.	picoEMERALD	picoEMERALD bietet eine Ausgangsimpulsfolge bei 1.064 nm mit einer Pulsbreite von 6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz, die als Stokes-Strahl dient. Der frequenzverdoppelte Strahl bei 532 nm wird verwendet, um einen Pikosekunden-Optisch-Parametrischen Oszillator (OPO) synchron zu säen, um eine modengekoppelte Impulsfolge mit einer Pulsbreite von fünf~6 ps zu erzeugen (der Leerlaufstrahl des OPO wird mit einem interferometrischen Filter blockiert). Die Ausgangswellenlänge des OPO ist ab 720– 950 nm, der als Pumpstrahl dient. Die Intensität des 1.064-nm-Stokes-Strahls wird durch ein eingebautes EOM bei 8 MHz mit einer Modulationstiefe von mehr als 90 % sinusförmig moduliert. Der Pumpstrahl wird räumlich mit dem Stokes-Strahl überlappt, indem ein dichroitischer Spiegel im Inneren von picoEMERALD verwendet wird. Die zeitliche Überlappung zwischen Pump- und Stokes-Pulsfolge wird durch eine eingebaute Verzögerungsstufe erreicht und durch das SRS-Signal von reinem D2O am Mikroskop optimiert.
Inverses Laser-Scanning-Mikroskop	Olympus	FV1200MPE
Kinematische Spiegelhalterung	Thorlabs	POLARIS-K1-2AH	2 Low-Profile Hex Adjusters
Lektin aus Triticum vulgaris (Weizen)	Sigma Aldrich	L0636-5 mg
Siegroitischer Langpass-Strahlteiler	Semrock	Di02-R980-25x36	980 nm Laser BrightLine  Einkantiger laserflacher dichroitischer Strahlteiler
MAP2	BioLegend	801810	Primäre Antikörper
Mikroskopie-Bildgebungssoftware	Olympus	FluoView
NanoQuant Plate	Tecan		Für absorptionsbasierte, kleinvolumige Analysen in einem Plattenreader.
Normales Eselsserum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagenz (DAPI)	Thermo Scientific	R37606
Nunc 4-Well-Schalen	Fisher Scientific	12-566-300
Objektiv	Olympus	XLPlan N	x25, 1.05-NA, MP, Arbeitsabstand =  2&dünnsp; mm
Pinsel
Periskop-Baugruppe	Thorlabs	RS99	beinhaltet die obere und untere Einheit, Ø 1" Pfosten und Klemmgabel.
pH-Messgerät
Plattenleser	Tecan	Infinite 200 PRO	Ein einfach zu bedienender Multimode-Plattenleser. Absorptionsmessmöglichkeiten über einen Spektralbereich von 230– 1000 nm.
ProLong Gold Antifading-Reagenz	Thermo Scientific	P36930
PSD95	Invitrogen	51-6900	Primärantikörper
Sephadex G-25 Medium	GE Life Sciences	17-0033-01	Gelfiltrationsharz zum Entsalzen und Pufferaustausch
Abgeschirmte Box mit BNC-Anschlüssen	Pomona Electronics	2902	Aluminiumbox mit Abdeckung, BNC-Buchse/Buchse
Si-Fotodiode	Thorlabs	FDS1010	350– 1100 nm, 10 mm x 10 mm Aktive Fläche
Synapsin 2	ThermoFisher	OSS00073G	Primary antibodies
Tissue Path Superfrost Plus Gold	Slides Fisher Scientific	22-035813	Adhäsiver Objektträger zum Anziehen und chemischen Verbinden von frischen oder formalinfixierten Gewebeschnitten fest mit der Objektträgeroberfläche (Tiisue Bindling Glasobjektträger)
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Vibratome	Leica	VT1000
Vimentin	Abcam	ab8069	Primäre Antikörper
Xylole	Sigma Aldrich	214736