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Immunology and Infection

Thérapie photodynamique médiée par rose Bengal pour inhiber Candida albicans

Published: March 24, 2022 doi: 10.3791/63558
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 5, 3,6, 7, 7, 3, 3,8,9
1Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 5Department of Dermatology, Fu Jen Catholic University Hospital, Fu Jen Catholic University, 6Institute of Clinical Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7School of Medicine, National Cheng Kung University, 8Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 9Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

L’incidence croissante de Candida albicans résistant aux médicaments est un grave problème de santé dans le monde entier. La thérapie photodynamique antimicrobienne (TDA) peut offrir une stratégie pour lutter contre les infections fongiques résistantes aux médicaments. Le présent protocole décrit l’efficacité de l’aPDT médiée par rose bengal sur une souche multirésistante de C. albicans in vitro.

Abstract

L’infection invasive à Candida albicans est une infection fongique opportuniste importante chez l’homme, car c’est l’un des colonisateurs les plus courants de l’intestin, de la bouche, du vagin et de la peau. Malgré la disponibilité de médicaments antifongiques, le taux de mortalité de la candidose invasive reste d’environ 50%. Malheureusement, l’incidence de C. albicans pharmacorésistant augmente à l’échelle mondiale. La thérapie photodynamique antimicrobienne (TDA) peut offrir un traitement alternatif ou adjuvant pour inhiber la formation de biofilm de C. albicans et surmonter la résistance aux médicaments. L’aPDT médiée par le bengale rose (RB) a montré une destruction cellulaire efficace des bactéries et de C. albicans. Dans cette étude, l’efficacité de RB-aPDT sur C. albicans multirésistant est décrite. Une source lumineuse à diode électroluminescente verte (DEL) faite maison est conçue pour s’aligner avec le centre d’un puits d’une plaque de 96 puits. Les levures ont été incubées dans les puits avec différentes concentrations de RB et éclairées par des fluences variables de lumière verte. Les effets de destruction ont été analysés par la méthode de dilution des plaques. Avec une combinaison optimale de lumière et de RB, une inhibition de croissance de 3 log a été obtenue. Il a été conclu que RB-aPDT pourrait potentiellement inhiber C. albicans résistant aux médicaments.

Introduction

C. albicans colonise les voies gastro-intestinales et génito-urinaires des individus en bonne santé et peut être détecté comme un microbiote normal chez environ 50% des individus1. Si un déséquilibre est créé entre l’hôte et l’agent pathogène, C. albicans est capable d’envahir et de causer des maladies. L’infection peut aller d’infections locales des muqueuses à une défaillance de plusieurs organes2. Dans une étude de surveillance multicentrique aux États-Unis, environ la moitié des isolats de patients atteints de candidose invasive entre 2009 et 2017 sont C. albicans3. La candidémie peut être associée à des taux élevés de morbidité, de mortalité, de séjour prolongé à l’hôpital4. Les Centers of Disease Control and Prevention des États-Unis ont rapporté qu’environ 7% de tous les échantillons de sang de Candida testés sont résistants au médicament antifongique fluconazole5. L’émergence d’espèces de Candida résistantes aux médicaments soulève la préoccupation de développer un traitement alternatif ou adjuvant aux agents antimycotiques.

La thérapie photodynamique antimicrobienne (APDT) consiste à activer un photosensibilisateur (PS) spécifique avec de la lumière à la longueur d’onde d’absorption maximale du PS6. Après excitation, le PS excité transfère son énergie ou ses électrons aux molécules d’oxygène voisines et retourne à l’état fondamental. Au cours de ce processus, des espèces réactives de l’oxygène et de l’oxygène singulet se forment et causent des dommages cellulaires. l’aPDT est largement utilisé pour tuer les micro-organismes depuis les années 19907. L’un des avantages de l’aPDT est que plusieurs organites sont endommagés dans une cellule par l’oxygène singulet et / ou les espèces réactives de l’oxygène (ROS) pendant l’irradiation; ainsi, la résistance à l’aPDT n’a pas été trouvée jusqu’à aujourd’hui. De plus, une étude récente a rapporté que les bactéries qui ont survécu après une TPD sont devenues plus sensibles aux antibiotiques8.

Les sources lumineuses utilisées dans l’aPDT comprennent les lasers, les lampes halogènes métalliques avec filtres, la lumière proche infrarouge et les diodes électroluminescentes (LED)9,10,11,12. Le laser fournit une puissance lumineuse élevée, généralement supérieure à 0,5 W / cm2, qui permet de délivrer une dose de lumière élevée en très peu de temps. Il a été largement utilisé dans les cas où un temps de traitement plus long est gênant, comme l’aPDT pour les infections buccales. L’inconvénient d’un laser est que sa taille d’éclairage est petite, allant de quelques centaines de micromètres à 10 mm avec un diffuseur. De plus, l’équipement laser est coûteux et nécessite une formation spécifique pour fonctionner. D’autre part, la zone d’irradiation d’une lampe halogène métallique avec filtres est relativement plus grande13. Cependant, la lampe est trop lourde et chère. Les sources de lumière LED sont devenues courantes de l’aPDT dans le domaine dermatologique car elles sont petites et moins chères. La zone d’irradiation peut être relativement grande avec une disposition en réseau de l’ampoule LED. L’ensemble du visage peut être éclairé en même temps9. Néanmoins, la plupart, sinon la totalité, des sources lumineuses LED disponibles aujourd’hui sont conçues pour un usage clinique. Il peut ne pas convenir à des expériences en laboratoire car il occupe de l’espace et coûte cher. Nous avons développé un réseau de LED peu coûteux qui est très petit et peut être coupé et assemblé à partir d’une bande LED. Les LED peuvent être montées dans différents arrangements pour différentes conceptions expérimentales. Différentes conditions d’aPDT peuvent être complétées dans une plaque de 96 puits ou même une plaque de 384 puits en une seule expérience.

Rose bengal (RB) est un colorant coloré largement utilisé pour améliorer la visualisation des dommages cornéens dans les yeux humains14. L’aPDT médiée par RB a montré des effets meurtriers sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli et C. albicans avec une efficacité à peu près comparable à celle du bleu de toluidine O15. Cette étude démontre une méthode pour valider l’effet de RB-aPDT sur C. albicans multirésistant.

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Protocol

1. Préparation du système aPDT

  1. Coupez quatre diodes électroluminescentes vertes (DEL) dans une bande de DEL (voir tableau des matériaux) et alignez-les avec quatre puits d’une plaque de 96 puits (Figure 1).
    REMARQUE: Les LED ont été disposées en une matrice 4 x 3. L’arrière de la LED a été collé à un dissipateur de chaleur pour disperser la chaleur pendant l’irradiation.
  2. Mesurez le taux de fluence11 de la LED à 540 nm avec un capteur de puissance lumineuse (voir Tableau des matériaux). Reportez-vous à la figure supplémentaire 1 pour vous assurer que le taux de fluence de la LED est compris entre 510 et 560 nm.
  3. Placez un ventilateur électrique à côté de la plaque pendant l’irradiation pour maintenir la température constante (25 ± 1 °C)11. Voir la figure supplémentaire 2 pour s’assurer que la température constante du milieu est maintenue pendant l’irradiation.

2. Culture de la forme de levure de C. albicans

REMARQUE: Un C. albicans multirésistant (BCRC 21538 / ATCC 10231), résistant à la plupart des antifongiques, y compris le fluconazole, est utilisé pour les expériences16.

  1. Déterminer la sensibilité aux médicaments antimycotiques à l’aide d’une méthode de diffusion sur disque à la suite du rapport17 publié précédemment.
  2. Cultiver C. albicans sous forme de levure, d’hyphes et de pseudohyphes en fonction des environnements micro-écologiques18.
    REMARQUE: Les formes hyphes et pseudohyphes sont difficiles pour un calcul précis. La forme de levure peut être calculée avec précision au microscope ou avec cytométrie en flux. La température pendant la croissance cellulaire détermine sa morphologie. À température ambiante (25 °C), presque toutes les cellules sont sous forme de levure. Une courte incubation de 4 h de C. albicans à 30 °C n’a pas affecté la morphologie de sa levure.

3. APDT sur C. albicans planctonique

  1. Isolez une seule colonie de C. albicans à partir d’une plaque de gélose avec une boucle stérile et ajoutez-la à un milieu de 3 mL d’extrait de levure peptone dextrose (YPD) (voir tableau des matériaux) dans un tube en verre stérilisé.
    1. Incuber le tube à 25 ± 1 °C pendant la nuit (14-16 h) dans un incubateur avec une vitesse de rotation de 155 tr/min pour dilater C. albicans et maintenir le champignon sous forme de levure pour une quantification précise.
  2. Diluer la culture pendant la nuit avec un milieu à une valeur OD600 d’environ 0,5 à 30 ° C et tourner à une vitesse de 155 tr / min pendant 4 h pour obtenir une phase de croissance logarithmique de C. albicans.
  3. Diluer à nouveau la culture en phase logarithmique avec un milieu YPD frais jusqu’à une valeur OD600 de 0,65 (environ 1 x 10 7 unités formantdes colonies, UFC/mL). Confirmer la concentration finale par méthode de dilution en série sur une plaque degélose 8.
  4. Préparez une solution mère (4%) de Rose bengal (RB) en dissolvant la poudre dans 1x PBS. Filtrez-le et stérilisez-le avec un filtre de 0,22 μm et conservez-le à 4 °C dans l’obscurité. La concentration finale de RB en état de marche est de 0,2%.
  5. Ajouter 111 μL de RB à 2 % à 1 mL de C. albicans en phase log logarithmique dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et co-culture à différents points temporels (0, 15 et 30 min) à température ambiante pour comprendre l’absorption de RB dans les cellules (Figure 2).
  6. Laver la co-culture trois fois avec 1 mL de 1x PBS avec centrifugation à 16 100 x g pendant 2,5 min à température ambiante.
    REMARQUE: aPDT contient quatre conditions différentes: contrôle absolu (pas d’exposition à la lumière, pas de RB), contrôle de l’obscurité (pas de lumière mais incube avec RB), contrôle de la lumière (expose à la lumière sans RB), aPDT (expose à la lumière en présence de RB).
  7. Remettre en suspension les C. albicans dans 1 mL de 1x PBS et les répartir dans trois puits différents dans une plaque de 96 puits pour chaque condition. Alignez les puits avec le réseau de LED après le lavage.
  8. Dans les groupes exposés à la lumière, allumez le ventilateur électrique et la lumière.
    REMARQUE: Une fluence différente (J / cm2) peut être obtenue en exposant les puits à des périodes de temps variables. Par exemple, une exposition à la lumière de 16,7 min s’élève à 10 J/cm2 avec une ampoule LED de 10 mW/cm2 .
  9. Après irradiation, ajouter 20 μL de la solution de co-culture d’un puits à un tube centrifuge de 1,5 mL contenant 180 μL de 1x PBS pour préparer une dilution 10x. En outre, diluer dix fois, puis en suivant la même méthode.
  10. Déposer trois gouttes de 20 μL de chaque dilution en série sur un quadrant d’une plaque de gélose YPD pour obtenir des colonies dénombrables sur la plaque. Calculer l’UFC/mL en multipliant les colonies par les facteurs de dilution3.

4. Analyse statistique

  1. Analyser les données recueillies à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et de statistiques (voir Tableau des matériaux).
  2. Représenter les données en moyenne ± erreur-type de la moyenne. Effectuer une analyse ANOVA bidirectionnelle de la variance8 pour évaluer les différences significatives entre les différentes conditions d’essai.
  3. Effectuez les tests de comparaison multiples de Tukey pour les comparaisons par paires8. Pour chaque traitement différent, effectuez au moins trois expériences indépendantes. Considérez la valeur de p < 0,05 statistiquement significative.

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Representative Results

La figure 1 montre le système aPDT utilisé dans la présente étude. Étant donné que les températures élevées peuvent provoquer une mort cellulaire importante, le réseau de LED est refroidi par un ventilateur électrique et un dissipateur de chaleur est utilisé pendant l’irradiation pour maintenir une température constante à 25 ± 1 ° C. L’effet de chaleur peut être écarté. Avoir une distribution uniforme de la lumière est également un facteur déterminant important pour une APDT réussie; par conséquent, il est essentiel d’aligner l’ampoule LED sur le puits avec précision pendant l’éclairage. En raison de la luminosité de la LED, les lunettes de soleil doivent être équipées avant d’allumer la lumière.

C. albicans est coloré immédiatement avec RB tel que visualisé par fluorescence rouge sous microscopie fluorescente (0 min dans la figure 2). On peut voir que le RB pénètre dans les cellules en fonction du temps (Figure 2). L’étude a utilisé une incubation RB de 15 minutes au cours de laquelle, après 15 minutes, la plupart des cellules ont été colorées avec RB. Une concentration plus élevée de RB conduit à une fluorescence plus forte, produisant plus de radicaux libres pour tuer les champignons. Pourtant, il peut également causer une mort cellulaire importante dans les cellules normales; par conséquent, une concentration de RB de 0,2 % est couramment utilisée dans les cliniques. Ainsi, cette concentration exacte a été choisie dans cette étude.

La PDT implique l’activation de RB avec la lumière. Lorsque le RB activé revient à son état fondamental, il transfère l’énergie et les électrons à l’oxygène voisin pour générer des radicaux libres et de l’oxygène singulet, entraînant la mort cellulaire. La figure 3 ne montre aucune mort cellulaire en l’absence d’irradiation ou l’absence de RB. C. albicans a été inhibé d’une manière légèrement dose-dépendante après irradiation à la lumière verte en présence de 0,2 % rb (figure 3). L’exposition des champignons à la lumière verte avec 30 J/cm2 a entraîné une inhibition de 4 log (99,99%) de la croissance cellulaire.

Figure 1
Figure 1 : Système photodynamique. (A) Un réseau de LED vertes a été collé à un dissipateur thermique métallique pour disperser la chaleur pendant l’irradiation. Un ventilateur électrique a été placé à côté de la source lumineuse pour maintenir la température constante à 25 ± 1 ° C. (B) La lumière a été allumée. (C) Les puits d’une plaque de 96 puits étaient alignés avec le centre de la LED. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : L’étude dépendante du temps du Bengale rose entrant dans C. albicans. Images en champ clair (A-D) et en fluorescence (E-H) des C. albicans après 0-30 min co-cultivées avec 0,2% de Bengale rose (RB). (A) et (E) Contrôle sans co-culture RB. (B) et (F) Les cellules ont été immédiatement colorées avec 0,2% de RB. (C) et (G) Après 15 minutes de culture, la plupart des cellules ont montré une fluorescence rouge, indiquant RB à l’intérieur des cellules. (D) et (H) Une fluorescence plus forte du RB a été notée avec une incubation de 30 minutes. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Effets de la thérapie photodynamique antimicrobienne sur les C. albicans multirésistants. L’inhibition de la croissance des cellules dépend de la fluence de la lumière. L’exposition de C. albicans à une fluence de 10 J/cm2 a inhibé la croissance cellulaire de 1,5 log, de 2 logs avec 20 J/cm2 et de 4 logs avec 30 J/cm2 respectivement en présence de 0,2% de Rose bengal. -RB, sans incubation de Rose bengal ; +RB, co-cultivé avec Rose bengal pendant 15 min. Les données sont des moyens ± SEM de trois expériences distinctes réalisées en double. Les valeurs p sont indiquées dans la figure (tests de comparaison multiples de Tukey, ANOVA bidirectionnelle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Spectre de sortie LED. Le taux de fluence a été mesuré tous les 2 nm de 510 à 560 nm avec un capteur de puissance. Les données sont regroupées à partir de deux expériences indépendantes avec des mesures triples. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Température du milieu pendant l’irradiation. Un thermocouple a été inséré dans chaque puits d’une plaque de 96 puits remplie de bouillon de 100 μL pour mesurer la température. La température était constante à 25 ± 1 °C. Les données sont regroupées à partir d’expériences dupliquées avec des puits triples. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Des résultats encourageants des applications cliniques de rb-PDT pour la kératite fongique ont été rapportés récemment19. Le pic d’absorption de RB est de 450-650 nm. Il est essentiel de déterminer le taux de fluence de la source lumineuse pour une APDT réussie. Une fluence élevée (habituellement >100 J/cm2) est nécessaire pour traiter les cellules cancéreuses, tandis qu’une fluence plus faible devrait traiter les lésions infectées6. Une fluence élevée signifie un long temps d’exposition qui peut ne pas être pratique dans un cadre clinique. Pour le traitement de la kératite mycotique, un 5,4 J/cm2 est convenu dans la communauté ophtalmologique20. Une longue période d’incubation de RB est également gênante pour un patient de recevoir un traitement de DPT. Ainsi, un temps d’incubation de 15 minutes a été choisi pour d’autres expériences.

Certaines étapes sont essentielles à la réussite d’une expérience. Les plaques de gélose utilisées pour la culture fongique ont été séchées pendant 15 à 20 minutes dans une cabine d’écoulement lamellaire avec le ventilateur allumé pour réduire l’humidité à la surface. Une surface humide permettrait à l’écoulement des gouttelettes de champignons de se mélanger, empêchant la formation d’une seule colonie.

L’exécution de toutes les expériences dans la pénombre est essentielle pour empêcher RB de photoblanchiment. Le circuit électrique était dans une connexion parallèle de sorte que si une panne se produisait dans l’un des circuits, les appareils restants ne seraient pas affectés. S’il y a des résultats qui dépassent la portée des autres, le réseau peut être vérifié en premier pour s’assurer que toutes les ampoules LED fonctionnent correctement.

L’une des limites de l’utilisation d’une source de lumière LED est sa dépendance à la température. Dans une LED, la chaleur n’est pas produite par l’ampoule LED elle-même, mais générée à la jonction semi-conductrice dans l’appareil9. Étant donné que la surconversion des LED au-dessus de leur courant nominal évoque l’augmentation de la température de jonction, entraînant éventuellement une défaillance prématurée de l’ampoule, il est nécessaire d’équiper l’appareil d’un dissipateur thermique métallique pour fournir un refroidissement approprié de la jonction. Une autre limitation de la conception actuelle du réseau de LED est la zone restreinte éclairée par chaque ampoule LED, qui n’accueille qu’un seul puits d’une plaque de 96 puits. Si une plus grande surface d’éclairage est nécessaire, une disposition différente des ampoules LED avec des distances correspondantes appropriées au-dessus ou au-dessous de la plaque est nécessaire pour obtenir un éclairage uniforme.

Les avantages de cette conception d’étude sont la facilité et la configuration peu coûteuse du système photodynamique pour les expériences aPDT. Il peut être utilisé dans des expériences concernant les infections fongiques. Les virus et les bactéries peuvent également être testés dans le même système. La bande lumineuse LED peut être choisie à partir d’une couleur de lumière différente pour correspondre aux pics d’absorption de différents photosensibilisateurs, allant du spectre lumineux visible au spectre lumineux proche infrarouge. Ils peuvent être facilement achetés sur le marché. La bande peut être coupée et assemblée en différents réseaux pour s’aligner sur une plaque de 96 puits pour un essai à haut débit. L’utilisation d’une plaque de 96 puits permet différentes conditions de test en même temps pour économiser du temps et de l’espace en laboratoire.

En conclusion, le système établi dans cette étude est simple, facile et polyvalent pour examiner différents effets photodynamiques sur divers micro-organismes et cellules.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a reçu un financement du Centre de nanomédecine appliquée de l’Université nationale Cheng Kung du programme du Centre de recherche Featured Areas dans le cadre du projet Higher Education Sprout du ministère de l’Éducation (MOE) et du ministère des Sciences et de la Technologie de Taïwan [MOST 109-2327-B-006-005] à TW Wong. J.H. Hung reconnaît le financement de l’hôpital universitaire national Cheng Kung, Taïwan [NCKUH-11006018], et [MOST 110-2314-B-006-086-MY3].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745.x
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Falcon, USA #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Aluminum foil sunmei, Tainan, Taiwan
Aluminum heat sink Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan BK-T220-0051-01 Disperses heat from the LED array.
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R
Graph pad prism software GraphPad 8.0, San Diego, California, USA graphing and statistics software
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan 2835 Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63
Incubator Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R)
Light power meter Ophir, Jerusalem, Israel PD300-3W-V1-SENSOR,
Millex 0.22 μm filter Merck, NJ, USA SLGVR33RS
Multidrug-resistant Candida albicans Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan BCRC 21538/ATCC 10231 http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, MO, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

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References

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