Summary
약물 내성 칸디다 알비 칸스의 발생률이 증가하는 것은 전 세계적으로 심각한 건강 문제입니다. 항균 광역학 요법 (aPDT)은 약물 내성 곰팡이 감염에 맞서 싸울 수있는 전략을 제공 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 시험관내에서 다약제 내성 C. 알비칸 균주에 대한 로즈벵골 매개 aPDT 효능을 기술한다.
Abstract
침습성 칸디다 알비칸스 감염은 장, 입, 질 및 피부의 가장 흔한 식민지 개척자 중 하나이기 때문에 인간에서 중요한 기회 주의적 곰팡이 감염입니다. 항진균제의 가용성에도 불구하고, 침습성 칸디다증의 사망률은 ~ 50 %로 남아 있습니다. 불행히도, 약물 내성 C. 알비칸의 발생률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 항미생물 광역학 요법 (aPDT)은 C. 알비칸 생물막 형성을 억제하고 약물 내성을 극복하기 위한 대안 또는 보조제 치료를 제공할 수 있다. 로즈벵골(RB)-매개 aPDT는 박테리아 및 C. 알비칸의 효과적인 세포 사멸을 보여주었다. 이 연구에서, 다제내성 C. 알비칸에 대한 RB-aPDT의 효능이 기재되어 있다. 수제 녹색 발광 다이오드(LED) 광원은 96웰 플레이트의 웰 중앙에 정렬되도록 설계되었습니다. 효모는 상이한 농도의 RB를 갖는 웰에서 배양되었고, 녹색 빛의 다양한 플루언스로 조명되었다. 사멸 효과를 플레이트 희석 방법에 의해 분석하였다. 빛과 RB의 최적 조합으로, 3-로그 성장 억제가 달성되었다. RB-aPDT가 잠재적으로 약물 내성 C. 알비칸을 억제 할 수 있다고 결론지었다.
Introduction
C. 알비칸은 건강한 개인의 위장관 및 비뇨 생식기에서 식민지화되며 개인의 약 50 %에서 정상적인 미생물로 검출 될 수 있습니다1. 숙주와 병원체 사이에 불균형이 생기면 C. albicans 는 침입하여 질병을 일으킬 수 있습니다. 감염은 국소 점막 감염에서 다발성 장기 부전까지 다양 할 수 있습니다2. 미국의 다중 센터 감시 연구에서 2009 년과 2017 년 사이에 침습성 칸디다증 환자로부터 격리 된 환자의 약 절반이 C. albicans3입니다. 칸디다혈증은 높은 이환율, 사망률, 장기간 입원4와 연관될 수 있다. 미국 질병 통제 예방 센터 (US Centers of Disease Control and Prevention)는 검사 된 모든 칸디다 혈액 샘플의 약 7 %가 항진균제 인 플루코나졸5에 내성이 있다고보고했습니다. 약물 내성 칸디다 종의 출현은 항균제에 대한 대안 또는 보조 요법을 개발하려는 우려를 제기합니다.
항미생물 광역학 요법 (aPDT)은 PS6의 피크 흡수 파장에서 빛으로 특정 광감작제 (PS)를 활성화시키는 것을 포함한다. 여기 후, 흥분된 PS는 에너지 또는 전자를 근처의 산소 분자로 전달하고 바닥 상태로 되돌아갑니다. 이 과정에서 반응성 산소 종과 일중항 산소가 형성되어 세포 손상을 일으 킵니다. aPDT는 1990년대7일부터 미생물을 죽이기 위해 널리 사용되어 왔다. aPDT의 이점 중 하나는 조사 중에 단일 산소 및 / 또는 반응성 산소 종 (ROS)에 의해 세포에서 여러 소기관이 손상된다는 것입니다. 따라서 aPDT에 대한 저항은 오늘날까지 발견되지 않았습니다. 더욱이, 최근의 한 연구는 aPDT 이후에 생존한 박테리아가 항생제에 더 민감해졌다고 보고하였다8.
aPDT에 사용되는 광원에는 레이저, 필터가 있는 금속 할로겐 램프, 근적외선 및 발광 다이오드(LED)9,10,11,12가 포함됩니다. 레이저는 일반적으로 0.5W/cm2보다 큰 높은 광전력을 제공하므로 매우 짧은 시간에 높은 광량을 제공할 수 있습니다. 구강 감염에 대한 aPDT와 같이 치료 시간이 길어지는 경우에 널리 사용되고 있다. 레이저의 단점은 조명의 스폿 크기가 작으며 디퓨저를 사용하면 수백 마이크로 미터에서 10mm에 이릅니다. 또한 레이저 장비는 비용이 많이 들고 작동하려면 특정 교육이 필요합니다. 한편, 필터를 이용한 금속 할로겐 램프의 조사 면적은 상대적으로 크다(13). 그러나 램프가 너무 무겁고 비쌉니다. LED 광원은 작고 저렴하기 때문에 피부과 분야에서 aPDT의 주류가되었습니다. 조사 영역은 LED 전구의 어레이 배열로 비교적 클 수 있다. 얼굴 전체를 동시에 비출 수 있습니다9. 그럼에도 불구하고, 전부는 아닐지라도 오늘날 이용 가능한 대부분의 LED 광원은 임상 사용을 위해 설계되었습니다. 그것은 공간을 차지하고 비싸기 때문에 실험실에서의 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 우리는 매우 작고 LED 스트립에서 절단 및 조립 할 수있는 저렴한 LED 어레이를 개발했습니다. LED는 다양한 실험 설계를 위해 다양한 배열로 장착할 수 있습니다. aPDT의 상이한 조건은 하나의 실험에서 96-웰 플레이트 또는 심지어 384-웰 플레이트에서 완성될 수 있다.
로즈 벵골 (RB)은 인간의 눈에서 각막 손상의 시각화를 향상시키기 위해 널리 사용되는 컬러 염료입니다14. RB 매개 aPDT는 스타필로코커스 아우레우스, 에스케리치아 콜리 및 C. 알비칸 에 대한 사멸 효과를 톨루이딘 블루O15의 것과 거의 유사한 효율로 나타냈다. 본 연구는 다제내성 C. 알비칸에 대한 RB-aPDT의 효과를 검증하는 방법을 시연한다.
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Protocol
1. aPDT 시스템 준비
- LED 스트립( 재료 표 참조)에서 녹색 발광 다이오드(LED) 4개를 잘라내어 96웰 플레이트의 네 웰에 정렬합니다(그림 1).
참고: LED는 4 x 3 어레이로 배열되었습니다. LED의 뒷면은 조사 중에 열을 분산시키기 위해 방열판에 부착되었습니다. - 광 전력계로 540 nm에서 LED의 플루언스 속도(11 )를 측정 한다(재료 표 참조). LED의 플루언스 속도가 510-560nm 사이인지 확인하려면 보충 그림 1을 참조하십시오.
- 조사시 플레이트와 나란히 선풍기를 넣어 항온(25± 1°C)을 유지한다11. 보충 그림 2 를 참조하여 조사 동안 배지의 항온이 유지되도록 하십시오.
2. C. 알비칸의 효모 형태의 배양
참고: 플루코나졸을 포함한 대부분의 항진균제에 내성이 있는 다제내성 C. 알비칸 (BCRC 21538/ATCC 10231)이 실험16에 사용된다.
- 이전에 공개된 보고서17에 이어 디스크 확산 방법으로 항균제 약물 민감성을 결정한다.
- 미세 생태 환경에 따라 효모, 균사 및 의사 균사 형태로 C. 알비칸 을 재배하십시오18.
참고 : 균사와 의사 균사 형태는 정확한 계산을 위해 어렵습니다. 효모 형태는 현미경 또는 유세포 분석기로 정확하게 계산할 수 있습니다. 세포 성장 동안의 온도는 그 형태를 결정합니다. 실온 (25 °C)에서, 거의 모든 세포는 효모 형태이다. 30° C에서 C. 알비칸의 4시간 짧은 인큐베이션은 그의 효모 형태학에 영향을 미치지 않았다.
3. 플랑크톤 C. 알비칸에 aPDT
- 멸균 루프가 있는 한천 플레이트로부터 C. 알비칸의 단일 콜로니를 분리하고, 이를 멸균된 유리 튜브 내의 3 mL 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 배지( 재료 표 참조)에 첨가한다.
- 튜브를 155 rpm의 회전 속도로 인큐베이터에서 하룻밤 (14-16 h) 25± 1°C에서 인큐베이션하여 C. 알비칸을 확장시키고 정확한 정량화를 위해 효모 형태의 균류를 유지한다.
- 하룻밤 동안 배양된 배지를 30°C에서 약 0.5의OD600 값으로 희석하고 155rpm의 속도로 4시간 동안 회전시켜 C. 알비칸의 로그 성장 단계를 달성한다.
- 로그상 배양물을 신선한 YPD 배지로 다시 희석하여OD600 값 0.65 (약 1 x 107 콜로니 형성 단위, CFU/mL)로 한다. 최종 농도를 한천 플레이트8 상에서 연속 희석법으로 확인하였다.
- 상기 분말을 1x PBS에 용해시켜 로즈벵골(RB)의 원액(4%)을 제조하였다. 0.22 μm 필터로 여과하고 멸균한 후 어둠 속에서 4°C에 보관한다. RB의 최종 작동 농도는 0.2 %입니다.
- 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 1 mL의 로그상 C. 알비칸 에 111 μL의 2% RB를 첨가하고, 실온에서 상이한 시점(0, 15, 및 30분)에서 공동 배양하여 세포 내의 RB의 흡수를 이해하였다(도 2).
- 공동 배양물을 실온에서 2.5 분 동안 16,100 x g에서 원심분리하여 1 mL의 1x PBS로 3회 세척하였다.
참고: aPDT에는 절대 제어(광 노출 없음, RB 없음), 어두운 제어(RB와 함께 인큐베이션된 빛은 없음), 조명 제어(RB가 없는 빛에 노출됨), aPDT(RB가 있을 때 빛에 노출됨)의 네 가지 조건이 포함되어 있습니다. - C. 알비칸을 1x PBS의 1 mL에 재현탁시키고 각 조건에 대해 96 웰 플레이트의 세 개의 다른 웰에 할당하십시오. 세척 후 웰을 LED 어레이에 맞춥니다.
- 빛에 노출 된 그룹에서는 전기 팬과 조명을 켭니다.
참고: 웰을 다양한 기간에 노출시킴으로써 다른 플루언스(J/cm2)를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 16.7 분 광 노출은 10 mW / cm2 LED 전구가있는 10 J /cm2에 도달합니다. - 조사 후, 한 웰에서 20 μL의 공동 배양 용액을 1x PBS의 180 μL를 함유하는 1.5 mL 원심분리 튜브에 첨가하여 10x 희석액을 제조하였다. 또한, 열 번 희석하고, 이어서 동일한 방법을 따른다.
- 각 연속 희석액의 20 μL의 세 방울을 YPD 한천 플레이트의 한 사분면 상에 떨어뜨려 플레이트를 계수가능한 콜로니를 달성한다. 콜로니에 희석 인자3을 곱하여 CFU/mL를 계산하십시오.
4. 통계 분석
- 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 수집된 데이터를 분석 합니다(자료 표 참조).
- 평균의 표준 오차± 평균으로 데이터를 묘사합니다. 분산8 에 대한 양방향 ANOVA 분석을 수행하여 서로 다른 테스트 조건 간의 유의한 차이를 평가합니다.
- 쌍 비교를 위해 Tukey의 다중 비교 테스트 수행8. 각각의 다른 치료에 대해 적어도 세 개의 독립적 인 실험을 수행하십시오. p-값 < 0.05를 통계적으로 유의하다고 생각하십시오.
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Representative Results
도 1은 본 연구에 사용되고 있는 aPDT 시스템을 나타낸 것이다. 고온은 상당한 셀 사멸을 일으킬 수 있기 때문에, LED 어레이는 전기 팬에 의해 냉각되고, 25 ± 1°C에서 일정한 온도를 유지하기 위해 조사 중에 방열판이 사용된다. 열 효과는 할인 될 수 있습니다. 균일한 광 분포를 갖는 것은 또한 성공적인 aPDT를 위한 중요한 결정 인자이다; 따라서 조명 중에 LED 전구를 잘 정밀하게 정렬하는 것이 중요합니다. LED의 밝기로 인해 조명을 켜기 전에 선글라스를 장착해야합니다.
C. 알비칸은 형광 현미경 하에서 적색 형광에 의해 가시화되는 바와 같이 RB로 즉시 염색된다( 도 2의 0분). RB가 시간 의존적으로 세포에 진입하는 것을 알 수 있다(도 2). 이 연구는 15 분 RB 인큐베이션을 사용했으며, 15 분 후에 대부분의 세포를 RB로 염색했습니다. RB의 농도가 높을수록 형광이 강해져 곰팡이를 죽이기 위해 더 많은 자유 라디칼이 생성됩니다. 그러나, 그것은 또한 정상 세포에서 상당한 세포 사멸을 일으킬 수 있다; 따라서 0.2 % RB 농도는 클리닉에서 일반적으로 사용됩니다. 따라서, 그 정확한 농도는 본 연구에서 선택되었다.
PDT는 빛과 함께 RB의 활성화를 포함한다. 활성화된 RB가 바닥 상태로 돌아오면 에너지와 전자를 근처의 산소로 전달하여 자유 라디칼과 일중항 산소를 생성하여 세포 사멸을 초래합니다. 도 3은 RB의 조사 없음 또는 부재하에서의 세포사멸이 없음을 보여준다. C. 알비칸은 0.2 % RB의 존재 하에 녹색 광 조사 후 광량 의존적 방식으로 억제되었다(도 3). 곰팡이를 30 J /cm2 로 녹색 빛에 노출하면 세포 성장의 4-log (99.99 %)가 억제되었습니다.
그림 1: 광역학 시스템 . (A) 녹색 LED 어레이를 금속 방열판에 부착하여 조사 중에 열을 분산시켰다. 광원과 함께 전기 팬을 넣어 온도를 25± 1°C로 일정하게 유지하였다. (B) 광을 켰다. (c) 96 웰 플레이트의 웰을 LED의 중심과 정렬하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : C. albicans에 들어가는 로즈 벵골에 대한 시간 의존적 연구. C. 알비칸의 브라이트-필드(A-D) 및 형광 이미지(E-H)를 0-30분 후에 0.2% 로즈 벵골(RB)과 공동 배양하였다. (a) 및 (E) RB 공동배양없이 대조군. (B) 및 (F) 세포를 즉시 0.2% RB로 염색하였다. (c) 및 (G) 배양 15분 후, 대부분의 세포는 적색 형광을 보였으며, 이는 세포 내부의 RB를 나타낸다. (d) 및 (H) RB의 더 강한 형광은 30분 인큐베이션으로 주목되었다. 배율 막대 = 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 다제내성 C. 알비칸에 대한 항균성 광역학 치료 효과. 세포의 성장 억제는 광플루언스에 의존한다. C. 알비칸을 10 J/cm2의 플루언스에 노출시키면 1.5 로그, 20 J/cm2로 2 로그,0.2% 로즈 벵골이 있는 상태에서 각각 30 J/cm2로 4개의 로그만큼 세포 성장을 억제하였다. -RB, 로즈 벵골 인큐베이션 없이; +RB, 로즈 벵골과 15분 동안 공동 배양하였다. 데이터는 중복± 수행된 세 개의 개별 실험의 SEM을 의미한다. p 값은 그림에 표시됩니다 (Tukey의 다중 비교 테스트, 양방향 ANOVA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: LED 출력 스펙트럼. 플루언스 레이트는 파워 미터로 510-560 nm에서 2 nm마다 측정되었다. 데이터는 삼중 측정을 통한 두 개의 독립적인 실험에서 풀링됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 조사 중 배지의 온도. 열전대를 100 μL 브로스로 채워진 96-웰 플레이트의 각 웰에 삽입하여 온도를 측정하였다. 온도는 25± 1°C에서 일정하였다. 데이터는 삼중 우물을 사용한 중복 실험에서 풀링됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
곰팡이 각막염에 대한 RB-PDT의 임상 적용의 고무적인 결과가 최근19 보고되었다. RB의 흡수 피크는 450-650 nm에 있다. 성공적인 aPDT를 위해 광원의 플루언스 속도를 결정하는 것이 필수적입니다. 암세포를 치료하기 위해서는 높은 플루언스 (보통 >100 J /cm2)가 필요하지만 감염된 병변을 치료하기 위해서는 더 낮은 플루언스가 필요합니다6. 높은 플루언스는 임상 환경에서 실용적이지 않을 수있는 긴 노출 시간을 의미합니다. 진균성 각막염을 치료하기 위해, 5.4 J/cm2 가 안과 커뮤니티(20)에서 합의된다. RB의 긴 인큐베이션 시간은 또한 환자가 aPDT 치료를 받는 데 불편하다. 따라서, 추가 실험을 위해 15분 인큐베이션 시간을 선택하였다.
성공적인 실험을 위해 몇 가지 단계가 중요합니다. 진균 배양에 사용된 한천 플레이트를 표면의 수분을 감소시키기 위해 팬을 켠 상태에서 라멜라 플로우 캐빈에서 15-20분 동안 건조시켰다. 축축한 표면은 곰팡이 방울의 흐름이 혼합되어 단일 식민지의 형성을 방지합니다.
희미한 빛에서 모든 실험을 실행하는 것은 RB가 광표백되지 않도록 하는 데 매우 중요합니다. 전기 회로는 병렬 연결되어있어 회로 중 하나에서 중단이 발생하면 나머지 가전 제품은 영향을받지 않습니다. 다른 범위를 벗어나는 결과가 나타나면 어레이를 먼저 검사하여 모든 LED 전구가 제대로 작동하는지 확인할 수 있습니다.
LED 광원 활용의 한 가지 한계는 온도 의존성입니다. LED에서, 열은 LED 전구 자체에 의해 생성되지 않지만, 장치(9) 내의 반도체 접합부에서 생성된다. 정격 전류 이상으로 LED를 과도하게 구동하면 접합 온도가 상승하여 결국 전구가 조기에 고장 나기 때문에 접합부의 적절한 냉각을 제공하기 위해 장치에 금속 방열판을 장착해야합니다. LED 어레이의 현재 설계의 또 다른 한계는 96웰 플레이트의 단일 웰만 수용하는 각 LED 전구에 의해 조명되는 제한 영역입니다. 더 큰 조명 영역이 필요한 경우, 균일 한 조명을 달성하기 위해 플레이트 위 또는 아래에 적절한 대응 거리를 가진 LED 전구의 다른 배열이 필요합니다.
이 연구 설계의 장점은 aPDT 실험을위한 광역학 시스템의 쉽고 저렴한 설정입니다. 곰팡이 감염에 관한 실험에 사용할 수 있습니다. 바이러스와 박테리아도 동일한 시스템에서 테스트 할 수 있습니다. LED 조명 스트립은 가시광선에서 근적외선 광 스펙트럼에 이르기까지 다양한 광감작제의 흡수 피크와 상관 관계를 갖기 위해 다른 색상의 빛 중에서 선택할 수 있습니다. 그들은 시장에서 쉽게 구입할 수 있습니다. 스트립을 절단하고 다른 어레이로 조립하여 높은 처리량 분석을 위해 96웰 플레이트와 정렬할 수 있습니다. 96웰 플레이트를 사용하면 다양한 테스트 조건을 동시에 사용하여 실험실의 시간과 공간을 절약할 수 있습니다.
결론적으로,이 연구에서 확립 된 시스템은 다양한 미생물 및 세포에 대한 다양한 광역학 효과를 조사하기 위해 간단하고 쉽고 다재다능합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 교육부 (MOE)의 고등 교육 새싹 프로젝트의 틀 내에서 특집 지역 연구 센터 프로그램으로부터 응용 나노 의학 센터, 국립 청 쿵 대학 (National Cheng Kung University)과 대만 과학 기술부 [MOST 109-2327-B-006-005]에서 TW Wong에 자금을 지원했습니다. J.H. Hung은 대만 국립 청 쿵 대학 병원 [NCKUH-11006018] 및 [MOST 110-2314-B-006-086-MY3]의 자금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745.x | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Falcon, USA | #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Aluminum foil | sunmei, Tainan, Taiwan | ||
| Aluminum heat sink | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | BK-T220-0051-01 | Disperses heat from the LED array. |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Graph pad prism software | GraphPad 8.0, San Diego, California, USA | graphing and statistics software | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co., Ltd., Tainan, Taiwan | 2835 | Emission peak wavelength: 525 nm, Viewing angle: 150°; originated from https://www.aliva.com.tw/product.php?id=63 |
| Incubator | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Light power meter | Ophir, Jerusalem, Israel | PD300-3W-V1-SENSOR, | |
| Millex 0.22 μm filter | Merck, NJ, USA | SLGVR33RS | |
| Multidrug-resistant Candida albicans | Bioresource Collection and Research CenterBioresource, Hsinchu, Taiwan | BCRC 21538/ATCC 10231 | http://catalog.bcrc.firdi.org.tw/BcrcContent?bid=21538 |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, MO, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei Co., Ltd., Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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