Verwendung einer Zell-Tracer-Injektion zur Untersuchung des Ursprungs von Neointima-bildenden Zellen in einem Rattensack-Seitenwandmodell

Subarachnoidalblutungen, die durch die Ruptur eines intrakraniellen Aneurysmas (IA) verursacht werden, sind eine verheerende neurochirurgische Erkrankung, die mit hoher Morbidität und Mortalität einhergeht 1,2,3,4. Neben dem mikrochirurgischen Clipping, das einen direkten Endothel-zu-Endothel-Kontakt ermöglicht, haben endovaskuläre Geräte in den letzten Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung für die Behandlung von rupturierten und zufällig entdeckten IAs gewonnen. Die Heilungsreaktion bei endovaskulär behandelten invasiven Therapien hängt hauptsächlich von der Neointima-Bildung und der Thrombusorganisation ab. Beides sind synergetische Prozesse, abhängig von der Zellmigration aus dem benachbarten Gefäß und der Aneurysmawand. ⁵ Bis heute ist der Ursprung von Endothelzellen bei der Neointima-Bildung von endovaskulär behandelten Aneurysmen unklar. In der Literatur gibt es eine anhaltende Debatte über die Quelle, aus der Neointima-bildende Zellen rekrutiert werden.

Durch die Verwendung einer Zell-Tracer-Injektion von CM-Dil-Farbstoff (siehe Materialtabelle) in die Bauchaorta von Ratten wollten wir die Rolle von Endothelzellen, die aus der Elternarterie stammen, bei der Neointima-Bildung an zwei verschiedenen FU-Zeitpunkten (Tag 7 und Tag 21) analysieren (Abbildung 1). Ein Vorteil des Modells ist die direkte lokale Zell-Tracer-Inkubation in vivo in einer Elternarterie vor der Aneurysmanaht, die FU zu späteren Zeitpunkten ermöglicht. In-vivo-Injektionstechniken , wie die Zell-Tracer-Inkubation, wurden in der Literatur nicht beschrieben. Ein Vorteil dieser Technik ist die direkte, einpunktige, intraoperative In-vivo-Injektion , die das Modell robust und reproduzierbar macht.

Die tierärztliche Betreuung erfolgte nach institutionellen Richtlinien. Die Experimente wurden von der Lokalen Ethikkommission, Schweiz, genehmigt (BE 60/19). Die ARRIVE-Richtlinien und ^{3R-Prinzipien} wurden strikt befolgt^6,7. Einunddreißig männliche Lewis-Ratten, 12 Wochen alt und mit einem Gewicht von 492 ± 8 g, wurden eingeschlossen. Halten Sie alle Ratten bei einer Raumtemperatur von 23 °C und einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus auf. Bieten Sie freien Zugang zu Wasser und Pellets. Statistische Analysen wurden mit dem nichtparametrischen Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test durchgeführt. Wahrscheinlichkeitswerte (p) von ≤ 0,05 und/oder ≤ 0,01 wurden als signifikant eingestuft.

1. Präoperative Phase-allgemeine Vorbereitung und anästhesische Aspekte

1. Randomisieren Sie Ratten entweder in Spulen- oder Stentbehandlungsgruppen (Abbildung 2) über ein webbasiertes Randomisierungssystem. Führen Sie nun eine präoperative klinische Untersuchung aller Tiere durch, die für eine Operation geplant sind, neben einem ruhigen, aseptischen Operationssaal mit einer Raumtemperatur von 23 ± 3 ° C. Analysieren Sie das Verhalten der Tiere und untersuchen Sie die Schleimhäute und den Turgor im Rahmen der präoperativen klinischen Untersuchung.
2. Notieren Sie das Gewicht jedes Tieres.
3. Vor der Operation die arteriellen Beutel von Spenderratten in 0,1% Natriumdodecylsulfat für 10 h bei 37 ° C inkubieren, um dezellularisierte Aneurysmen^{zu erhalten 8}. Holen Sie diese Beutel einige Tage vor der Operation von Spendertieren ab.
   1. Bereiten Sie die gesamte Länge der Bauchaorta mit Mikroschere und Pinzette vor und tragen Sie 6-0 nicht resorbierbare Ligaturen in einem Abstand von 3-4 mm auf.
   2. Erzeugen Sie direkt lebenswichtige Aneurysmen intraoperativ durch einen zuvor ligierten arteriellen Gefäßbeutel aus dem Brustteil eines Spendertieres⁹. Führen Sie eine Thorakotomie mit einer Schere und einer chirurgischen Pinzette zum angegebenen FU-Zeitpunkt durch und ligiieren Sie den Gefäßbeutel in der gewünschten Länge.
4. Implantieren Sie den Beutel direkt in den Empfänger und ernten Sie das Aneurysma vom Spendertier für die weitere makroskopische Analyse und histologische Verarbeitung.
5. Für die Anästhesieinduktion legen Sie alle Ratten in eine saubere Box, die mit Sauerstoff (_O2) versorgt ist, bis sie nach 5-10 min das Bewusstsein verlieren. Anästhesieren Sie Ratten mit einer subkutanen (SC) Injektion einer Mischung aus Fentanyl 0,005 mg/kg, Medetomidin 0,15 mg/kg und Midazolam 2 mg/kg.
   HINWEIS: Dies gewährleistet eine Operationsebene von mindestens 45 min.
6. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen des Pedalentzugsreflexes.
7. Legen Sie die Ratten in Rückenlage und rasieren Sie den Thoracoabdominalteil mit einem elektrischen Rasierer.
8. Befestigen Sie die 4 Pfoten der Ratten mit Klebeband auf einem Brett, das von einem Heizkissen bedeckt ist, das mit einer autoregulierenden rektalen Sonde verbunden ist. Setzen Sie die rektale Sonde in den Anus der Ratte ein, um die gewünschte Temperatur von 37 ° C mit Hilfe des Heizkissens aufrechtzuerhalten.
9. Installieren Sie nun einen Sensor am rechten Hinterbein, der mit einem computergestützten System verbunden ist, um die Vitalparameter intraoperativ zu überprüfen.
10. Bedecken Sie Nase und Mund der Ratte mit einer Gesichtsmaske. Wenn eine längere Anästhesie erforderlich ist, beginnen Sie mit Isofluran (1,0-2,0% titriert, um in 100% O₂ zu wirken).
11. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Povidon-Jod oder wechselnden Desinfektionsmitteln und drapieren Sie das Operationsfeld steril.
12. Für die perianästhetische Pflege tragen Sie ein steriles ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen auf und bedecken Sie sie mit einer undurchsichtigen Folienmaske, um ein Austrocknen und Beschädigen durch die OP-Lampe zu verhindern.
13. Versorgen Sie sich während der gesamten Operation kontinuierlich mit Sauerstoff über die Gesichtsmaske, überwachen Sie die Körpertemperatur und liefern Sie Wärme mit einem Heizkissen, um die Normothermie aufrechtzuerhalten.
14. Überwachen Sie kontinuierlich andere Vitalfunktionen (Puls- und Atemdehnung, Herz- und Atemfrequenz sowie Sauerstoffsättigung).

2. Operative Phase - Zell-Tracer-Injektion

HINWEIS: Der detaillierte chirurgische Ansatz im mikrochirurgischen Seitenwandaneurysma Modell⁹ der Helsinkier Ratte und Techniken zur Spulen- und Stentimplantation werden an anderer Stelle^{beschrieben 8,10,11}.

1. Lagern Sie den fluoreszierenden lipophilen Zell-Tracer die ganze Zeit bei ≤ -20 °C, geschützt vor Licht.
2. Führen Sie die Operation durch, indem Sie die Rattenaorta und die Cavalvene vorbereiten, gefolgt von der Trennung beider sowie proximaler und distaler temporärer Klemmung der Aorta.
   HINWEIS: Diese Technik wurde bereits⁹ beschrieben.
   1. Klemmen Sie die proximalen und distalen Teile der Aorta mit zwei temporären Titanclips.
3. Legen Sie jeweils einen Mikrotupfer mit violetter Polsterung unter die proximalen und distalen Teile der Aorta, um die Arterie besser sichtbar zu machen.
4. Schützen Sie nun den Bauch mit nasser Gaze.
5. Am Tag der Operation werden 2 μL des Zell-Tracers durch Pipettieren in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst.
6. Die Mischung wird in eine 1-ml-Spritze überführt, die mit einer sterilen Kanüle mit 27-1/2 G (0,4 x 13 mm) ausgestattet ist.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, bei den Schritten 2.5 und 2.6 keine Lichteinwirkung zu vermeiden.
7. Schalten Sie das Licht im Operationssaal aus. Während Sie unter ein Mikroskop schauen, führen Sie die Ein-Punkt-Injektion in den mittleren ventralen Teil der Aorta mit einer Mikrozange durch und injizieren Sie vorsichtig 1 ml heparinisierte 0,9% ige Kochsalzlösung.
8. Injizieren Sie den Zell-Tracer vorsichtig (Video 1) und schalten Sie sofort auch das Operationsmikroskop aus. Schützen Sie den Bauch erneut mit nasser Gaze.
9. Lassen Sie den Farbstoff mindestens 15 min inkubieren. Schalten Sie nach der Inkubationszeit das Mikroskop und die Operationssaalbeleuchtung ein.
10. Führen Sie die Längsarteriotomie und das Nähen des Aneurysmas durch, wie an anderer Stelle^{beschrieben 11}.
    1. Verwenden Sie eine Mikropinzette und eine Mikroschere, um die Arteriotomie so durchzuführen, dass ihre Länge den Durchmesser des geernteten Aneurysmas mittelt (Schritt 1.3). Um die richtige Länge zu gewährleisten, platzieren Sie das Aneurysma neben der Aorta, bevor Sie eine Arteriotomie durchführen. Nähen Sie das Aneurysma mit 8-10 Einzelstichen mit einer nicht resorbierbaren 10-0-Naht und entfernen Sie vorsichtig die temporären Klemmen, die distal unter kontinuierlicher Bewässerung mit heparinisierter Kochsalzlösung beginnen. Schließen Sie die Wunde in einer geschichteten Art und Weise. Bemerkenswert ist, dass Sie eine Spulenpackungsdichte von 1 cm verwenden.
       ANMERKUNG: Die Technik der Spulen- oder Stentimplantation wurde an anderer Stelle^{beschrieben 8,10}.

3. Postoperative Phasenüberwachung und analgetische Versorgung

1. Am Ende der Operation kehren Sie die Anästhesie mit einer SC-Injektionsmischung aus Buprenorphin 0,05 mg / kg, Atipamezol 0,75 mg / kg und Fumazenil 0,2 mg / kg um. Lassen Sie jedes betriebene Tier sich in einem sauberen Käfig erholen, bis es vollständig wach und warm ist, je nach Bedarf, mit einer Heizlampe.
2. Verabreichen Sie 3 Tage lang 1 mg/kg Meloxicam (eine Injektion oder orale Anwendung pro Tag) und Buprenorphin (0,05 mg/kg viermal täglich) SC. Über Nacht Buprenorphin kontinuierlich im Trinkwasser mit der gleichen Dosierung bereitstellen: 6 ml Buprenorphin 0,3 mg/ml, 360 mL Trinkwasser, 10 ml 5% Glukose.
3. In der unmittelbaren postoperativen Phase unterbringen Sie jedes Tier zum Schutz in einem einzigen Käfig. Gruppieren Sie die Tiere nach 24 Stunden neu.
4. Wenn eine Ratte nach der SC-Injektion ein verzweifeltes oder aggressives Verhalten zeigt, verabreichen Sie Buprenorphin tagsüber im Trinkwasser.
5. Stellen Sie weiches Futter auf dem Käfigboden bereit, um die Fütterung und Erholung postoperativ zu unterstützen.
6. Beobachten und pflegen Sie alle Tiere gemäß dem Wohlfühl- und Schmerz-Score-Blatt.
7. Verabreichen Sie bei Bedarf eine Rettungsanalgesie SC (Meloxicam 1 mg/kg und 0,05 mg/kg Buprenorphin).

Insgesamt wurden 31 Tiere in die Laborumgebung einbezogen: 27 Ratten wurden in die endgültige statistische Analyse einbezogen; 4 Ratten starben vorzeitig (12,9% Mortalitätsrate). Intraoperativ war die Atemdehnung bei Stent- (12,9 μm ± 0,7) im Vergleich zu spulenbehandelten (13,5 μm ± 0,6) Ratten signifikant reduziert (p = 0,03). Die Fluoreszenzangiographie wurde für jede Ratte am Ende der abschließenden FU durchgeführt. Bei allen 6 mit Spulen behandelten Tieren war eine Reperfusion indiziert, während eine Reperfusion nur bei 12,5 % der 8 mit Stents behandelten Tiere beobachtet wurde.

Die gepoolten Baseline-Aneurysmavolumina für Tag 7 und Tag 21 unterschieden sich nicht signifikant (weder für dezellularisierte (p = 0,9) noch vitale (p = 0,1) Aneurysmen) zwischen den Spulen- oder Stentbehandlungsgruppen (Abbildung 3). Gepoolte FU-Volumina für dezellularisierte Aneurysmen zeigten ein nicht signifikantes Aneurysmawachstum in gewickelten Aneurysmen im Vergleich zu den Stented-Aneurysmen (p = 0,28), signifikant größer in der vital gewickelten Gruppe als in der Stented-Gruppe (60,1 mm 3 ±31,1 mm 3 vs. 20,5 mm 3 ± 20,6 mm 3; p = 0,002).

Die Mengen an zell-tracer-positiven Zellen in der Neointima dezellularisierter Aneurysmen unterschieden sich zwischen den mit Stents oder Spulen behandelten Gruppen am Tag 7 der FU (p = 0,8) nicht signifikant, waren aber bei Stent-Ratten am Tag 21 der FU signifikant höher (Abbildung 4; p = 0,04). Bei lebenswichtigen mit Aneurysmen vernähten Ratten wurden weder nach 7 Tagen (p = 1,0) noch nach 21 Tagen (Abbildung 5) keine signifikanten Unterschiede festgestellt. FU (p = 0,66). Bei dezellularisierten Aneurysmen nach 7 Tagen FU verblieben im Thrombus des Stent-Behandelten im Vergleich zur spulenbehandelten Gruppe signifikant mehr zell-tracer-positive Zellen (p = 0,01). Dieser Unterschied wurde bei lebenswichtigen Aneurysmen nach 7 Tagen FU nicht beobachtet. Siehe Tabelle 1 für den Anteil der Zell-Tracer-positiven Zellen für dezellularisierte, sowie vitale gewickelte und gestinkte Aneurysmen für Tag 7 und Tag 21 FU. Die Gegenfärbung des von-Willebrand-Faktors (F8) wurde in den Endothelzellen der Neointima jeder Ratte durchgeführt (Abbildung 6).

Die durchschnittliche Dauer des chirurgischen Eingriffs betrug 119,1 ± 21,3 min für die Wickelgruppe im Vergleich zu 154,1 ± 30,2 min für die Stentgruppe (p = 0,001). Die Anzahl der Stiche für Aneurysma-Nähte unterschied sich auch signifikant (p = 0,000002) für die Spulen- (15,6 ± 2,9 Stiche) und Stent-Gruppen (11,3 ± 1,1).

Abbildung 1: Flussdiagramm der Versuchsumgebung. Insgesamt wurden 35 Tiere operiert und in Wickel- oder Stentgruppen randomisiert. Zwei Tiere der Stentgruppe starben im unmittelbaren postoperativen Verlauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Intraoperative Aufnahmen von Aneurysmen während der Spulen- und Stentembolisation . (A) zeigt ein Seitenwand-Aneurysma (#), das an der Bauchrattenaorta (*) vernäht ist. Beachten Sie die im Aneurysma eingeführte Spulenvorrichtung, bevor Sie den letzten Stich durchführen, um die Aneurysmanaht zu vervollständigen. Beachten Sie die rosafarbene Färbung (Pfeil) auf der linken Seite der Arteriotomie, die die korrekte Verteilung des Zelltracers anzeigt. (B) Die gleiche Einstellung wie in A, die die Stentvorrichtung bereits vor Ort anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Makroskopische Obduktionsmessungen an 31 Tieren. Aneurysmavolumina (mm3) wurden vor der Implantation und bei der Nachuntersuchung entlang der y-Achse dokumentiert. (A) Baseline (dezellularisiert), (B) Follow-up (decellularisiert), (C) Baseline (vital), (D) Follow-up (vital). Daten für Tag 7 und Tag 21 werden gepoolt. ** p < 0,01. Werte werden als Mediane mit Interquartilsbereichen ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Beispielbild eines mit Stents behandelten dezellularisierten Aneurysmas am 21. Tag. Rechts ist eine Bildübersicht eines monoklonalen Antiα-SMA, zelldeplementierten Aneurysmas (2-fache Vergrößerung) zu sehen; Maßstab bar = 150 μm. Links, mit DAPI gebeizt; Rote Blutkörperchen sind Zell-Tracer-positiv (A) in der Aneurysmawand, (B) im Thrombus, (C) verbleibende gefärbte, aber verblasste Zell-Tracer-positive Zellen in der Neointima und (D) im angrenzenden Gefäßkomplex. Maßstabsstäbe = 100 μm (A-D). Ein einzelner Pfeil markiert die Aneurysmawand, der Doppelpfeil die übergeordnete Arterie. Abkürzungen: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; α-SMA = α-glattes Muskelaktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Beispielbild eines spulenbehandelten Vitalaneurysmas am 21. Tag. Auf der rechten Seite ist eine Bildübersicht eines monoklonalen antiα-SMA, zellreichen Aneurysmas (2-fache Vergrößerung) zu sehen; Maßstab bar = 150 μm. Linke Seite, mit DAPI konterbefleckt; Rote Blutkörperchen sind zell-tracer-positiv (A) in der Aneurysmawand, (B) im Thrombus, (C) mehrere positive Zellen in der Neointima und (D) im angrenzenden Gefäßkomplex. Maßstabsstäbe = 100 μm (A-D). Ein einzelner Pfeil markiert die Aneurysmawand, der Doppelpfeil die übergeordnete Arterie. Abkürzungen: DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; α-SMA = α-glattes Muskelaktin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: 40-fache Vergrößerung durch F8-Färbung. # zeigt die Thrombusbildung, * die Neointima und § die Endoluminalseite unterhalb der Aneurysmaöffnung. Beachten Sie die endotheliale Schichtung, die als violette Färbung in der endoluminalen Schicht der Neointima dargestellt ist. Maßstabsleiste = 175 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Anteil der Zell-Tracer-positiven Zellen in Neointima, Elternarterie, Thrombus und Aneurysmawand. Die Werte werden als Prozentsätze für dezellularisierte und lebenswichtige Beutel für die Spulen- und Stentbehandlung für Tag 7 und Tag 21 dargestellt. Abkürzung: DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol.

Video 1: Zell-Tracer-Injektion in den Bauchteil der Rattenaorta. Diese Technik wird mit einer Ein-Punkt-Injektion in die geklemmte Rattenaorta durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Die Autoren sind für die Gestaltung und Durchführung der vorgestellten Studie allein verantwortlich und erklären keine konkurrierenden Interessen.