Der schnelle Nachweis und die zuverlässige Quantifizierung von RNA-Editing-Ereignissen auf genomischer Ebene bleiben eine Herausforderung und basieren derzeit auf direkten RNA-Sequenzierungsmethoden. Das hier beschriebene Protokoll verwendet die Mikrotemperaturgradientengelelektrophorese (μTGGE) als einfache, schnelle und tragbare Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung.
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Methodenartikel
Ein Nonsequencing-Ansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
RNA-Editing ist ein Prozess, der zu posttranskriptionellen Sequenzveränderungen in RNAs führt. Der Nachweis und die Quantifizierung der RNA-Editierung beruhen hauptsächlich auf Sanger-Sequenzierungs- und RNA-Sequenzierungstechniken. Diese Methoden können jedoch kostspielig und zeitaufwendig sein. In diesem Protokoll wird ein tragbares Mikrotemperatur-Gradienten-Gelelektrophorese-System (μTGGE) als Nicht-Sequenzierungsansatz für den schnellen Nachweis der RNA-Editierung verwendet. Das Verfahren basiert auf dem Prinzip der Elektrophorese, bei der bei hohen Temperaturen Nukleinsäureproben denaturiert werden, während sie sich über ein Polyacrylamidgel bewegen. Über einen Temperaturbereich hinweg bildet ein DNA-Fragment einen Gradienten von vollständig doppelsträngiger DNA zu teilweise getrennten Strängen und dann zu vollständig getrennter einzelsträngiger DNA. RNA-editierte Stellen mit unterschiedlichen Nukleotidbasen erzeugen unterschiedliche Schmelzprofile in μTGGE-Analysen. Wir verwendeten den μTGGE-basierten Ansatz, um die Unterschiede zwischen den Schmelzprofilen von vier editierten RNA-Fragmenten und ihren entsprechenden nicht editierten (Wildtyp-) Fragmenten zu charakterisieren. Pattern Similarity Scores (PaSSs) wurden durch den Vergleich der von den editierten und nicht editierten RNAs erzeugten Bandmuster berechnet und zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit der Methode verwendet. Insgesamt ermöglicht die hier beschriebene Plattform den unkomplizierten, einfachen und kostengünstigen Nachweis auch einzelner Basenmutationen in RNAs. Es wird erwartet, dass dieses Analysewerkzeug neue molekularbiologische Erkenntnisse unterstützen wird.
Einleitung
Einzelne Nukleotidvarianten (SNVs) in genomischer RNA, einschließlich A-zu-I-, C-zu-U- und U-zu-C-Varianten, können auf RNA-Editierereignisse hinweisen. Der Nachweis von SNVs in RNA bleibt jedoch eine technisch anspruchsvolle Aufgabe. Herkömmlicherweise wird das Verhältnis von editierter zu nicht editierter RNA durch direkte Sequenzierung, allelspezifische Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, diesich 1,2,3,4,5,6 nähert.
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Protokoll
1. Optimierung des Zielfragments
HINWEIS: Vier editierte Gene wurden bei der Entwicklung dieses Protokolls verwendet, darunter zwei Kerngene (AT2G16586 und AT5G02670) von A. thaliana und die Gene, die für blau fluoreszierendes Protein (BFP) und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) kodieren, die in HEK293-Zellen exprimiert werden.
- Um Genfragmente mit unterschiedlichen Schmelzprofilen zu identifizieren, die bearbeitete und nicht bearbeitete Bereiche darstellen, generieren Sie vorhergesagte Schmelzkurven mit dem webbasierten Tool uMelt HETS, einer Erweiterung der ursprünglichen uMelt-Software
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Ergebnisse
Verwendung von μTGGE zur Identifizierung einzelner Nukleotidbasenänderungen in RNA-Editierungsereignissen
Für dieses Protokoll wurden vier editierte Gene verwendet (Tabelle 1), darunter das BFP-Gen, das in HEK293-Zellen produziert wird (mit C-zu-U-RNA-Editierung durch die Deaminase-Enzyme des Apolipoproteins B mRNA-Editierenzymkomplexes; APOBEC115), das EGFP-Gen, das das ockerfarbene Stop Codon (TAA) enthält, das in HEK293-Zellen produziert wird (mit A-zu-I-RNA.......
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Diskussion
RNA-Editieren spielt eine wichtige Rolle in der Biologie; Aktuelle Methoden zum Nachweis der RNA-Editierung, wie Chromatographie und Sequenzierung, stellen jedoch aufgrund ihrer hohen Kosten, ihres übermäßigen Zeitaufwands und ihrer Komplexität mehrere Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis der RNA-Bearbeitung, die ein tragbares, mikroskaliertes, TGGE-basiertes System verwendet. Dieses System kann verwendet werden, um vor der Sanger-Seque.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Grant-in-Aid for Scientific Research der Japan Society for the Promotion of Science (17H02204 und 18K19288) unterstützt. Ruchika wurde von der japanischen Regierung finanziell unterstützt (MEXT-Stipendium). Wir danken Frau Radhika Biyani (Takagi Laboratory, JAIST) und Dr. Kirti Sharma (BioSeeds Corporation) für ihre Hilfe bei elektrophoresebezogenen Experimenten.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2U ExoI | Takara | 2650A | Exonuklease I |
| 40(w/v)%-Acrylamid/bis (19:1) | Thermofischer | AM9022 | |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| Zentrifuge-Mini-Spin | Eppendorf | 5452000034 | |
| Digitales Trockenbad/Blockheizer | Thermofischer | NA | |
| Gold Taq Polymerase-Master-Gemisch | Promega | M7122 | |
| LATaq-DNA-Polymerase | TAKARA | RR002A | Taq-Polymerase |
| micro-TGGE Kassettenhalter | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| Mikro-TGGE-Apparat | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE Gel-Kassette | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermofischer | ND-1000 | Spektralphotometer |
| Plant Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace Master Mix | TOYOBO | TRT101 | M-MLV (Moloney Murine Leukämievirus) Reverse-Transkriptase |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Garnelen-alkalische Phosphatase | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold-Nukleinsäure-Gelfarbe | Thermofischer | S11494 | |
| TBE-Puffer | Thermofischer | B52 | |
| Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Nacalai-Tesque | 33401-72 | |
| Getestet auf Harnstoff, Nuklease und Protease | Nacalai-Tesque | 35940-65 |
Referenzen
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).
- Chen, Y. C., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
