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Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Konstruktion von maßgeschneiderten Mikroelektrodenarrays, um lokale Feldpotentiale in vivo aus mehreren Gehirnstrukturen gleichzeitig aufzuzeichnen.

Abstract

Forscher müssen oft lokale Feldpotentiale (LFPs) gleichzeitig von mehreren Gehirnstrukturen erfassen. Die Aufzeichnung aus mehreren gewünschten Hirnregionen erfordert unterschiedliche Mikroelektrodendesigns, aber kommerziell erhältliche Mikroelektrodenarrays bieten oft keine solche Flexibilität. Hier skizziert das vorliegende Protokoll das einfache Design von maßgeschneiderten Mikroelektrodenarrays, um LFPs von mehreren Gehirnstrukturen gleichzeitig in verschiedenen Tiefen aufzuzeichnen. Diese Arbeit beschreibt exemplarisch die Konstruktion der bilateralen kortikalen, striatischen, ventrolateralen thalamischen und nigralen Mikroelektroden. Das skizzierte Designprinzip bietet Flexibilität, und die Mikroelektroden können modifiziert und angepasst werden, um LFPs von jeder Struktur aufzuzeichnen, indem stereotaktische Koordinaten berechnet und die Konstruktion schnell entsprechend geändert wird, um verschiedene Gehirnregionen in frei beweglichen oder betäubten Mäusen anzusprechen. Die Mikroelektrodenmontage erfordert Standardwerkzeuge und -zubehör. Diese kundenspezifischen Mikroelektroden-Arrays ermöglichen es den Ermittlern, Mikroelektroden-Arrays in jeder Konfiguration zu entwerfen, um die neuronale Aktivität zu verfolgen und LFP-Aufzeichnungen mit einer Auflösung von Millisekunden bereitzustellen.

Introduction

Lokale Feldpotentiale (LFPs) sind die elektrischen Potentiale, die aus dem extrazellulären Raum im Gehirn aufgezeichnet werden. Sie werden durch Ionenkonzentrationsungleichgewichte außerhalb von Neuronen erzeugt und repräsentieren die Aktivität einer kleinen, lokalisierten Population von Neuronen, so dass die Aktivität einer bestimmten Gehirnregion im Vergleich zu den makroskaligen EEG-Aufzeichnungen 1 genau überwacht^{werden kann}. Als Schätzung entsprechen die LFP-Mikroelektroden, die durch 1 mm getrennt sind, zwei völlig unterschiedlichen Populationen von Neuronen. Während das EEG-Signal von Hirngewebe, Zerebrospinalflüssigkeit, Schädel, Muskeln und Haut gefiltert wird, ist das LFP-Signal ein zuverlässiger Marker für die lokale neuronale Aktivität¹.

Forscher müssen oft gleichzeitig LFPs aus mehreren Gehirnstrukturen aufzeichnen, aber kommerziell erhältliche Mikroelektroden-Arrays bieten oft keine solche Flexibilität. Hier beschreibt das vorliegende Protokoll vollständig anpassbare, einfach zu konstruierende Mikroelektroden, um LFPs aus jeder gewünschten Hirnregion in verschiedenen Tiefen gleichzeitig aufzuzeichnen. Obwohl LFPs ausgiebig verwendet wurden, um die neuronale Aktivität einer bestimmten Gehirnregion^{aufzuzeichnen} 2,3,4,5,6,7,8,9, ermöglicht das derzeit leicht anpassbare Design die Aufzeichnung von LFPs aus mehreren oberflächlichen oder tiefen Hirnregionen ^11,12 . Das Protokoll kann auch modifiziert werden, um ein beliebiges Mikroelektrodenarray zu konstruieren, indem stereotaktische Koordinaten der Gehirnregionen bestimmt und das Array entsprechend zusammengesetzt wird. Diese Mikroelektroden mit einer Abtastrate von 10 kHz und einem Widerstand von 60-70 kΩ (2 cm Länge) ermöglichen es uns, LFPs mit einer Genauigkeit von Millisekunden aufzunehmen. Die Daten können dann durch einen 16-Kanal-Verstärker verstärkt, gefiltert (Tiefpass 1 Hz, Hochpass 5 kHz) und digitalisiert werden.

Protocol

Die vorliegende Arbeit wurde vom Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt. Für die Experimente wurden C57Bl/6-Mäuse beiderlei Geschlechts (7-12 Wochen) verwendet. Die Tiere wurden in einem 12 h Hell/12 h Dunkelzyklus gehalten und hatten ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. 1. Aufbau von Mikroelektroden Um die Mikroelektroden zu konstruieren, verwenden Sie 50 μm (Durchmesser) diamellbeschichteten Nickel-Chrom-Draht (siehe Materialtabelle). Kleben Sie ein Ende des Drahtes an der Rückseite der Plattform ab, und wickeln Sie den Draht dreimal um den nächstgelegenen Knopf auf der Plattform (Abbildung 1A,C).HINWEIS: Hier wurde eine Acrylplattform mit zwei Knöpfen (2 x 5 Zoll) verwendet, aber jede Plattform kann verwendet werden. Strecken Sie den Draht um den am weitesten entfernten zweiten Knopf, um zwei Schlaufen zwischen den Knöpfen zu machen. Wickeln Sie den Draht noch drei weitere Male um den ersten Knopf, um den Draht an Ort und Stelle zu befestigen, und kleben Sie das Ende wieder an der Rückseite der Plattform.HINWEIS: Nachdem die Drähte getrennt wurden (Schritte 1.2-1.3.1), müssen sich auf jeder Seite zwei Drähte befinden (insgesamt vier Drähte, Abbildung 1B). Platzieren Sie die Spannstangen unter den Drähten, wobei das Band um sie gewickelt ist (klebrige Seite nach oben) (Abbildung 1C).HINWEIS: Für die Spannstangen wurden dreieckige Acrylstücke verwendet, um die Klebeband gewickelt war (klebrige Seite außen, um die Drähte zu befestigen). Die klebrige Seite des Bandes außerhalb der Spannstangen hält die Drähte an Ort und Stelle, um den Abstand zwischen ihnen einzustellen. Die Zugstäbe müssen ~ 2,5 cm von den Knöpfen entfernt sein, und die Drähte dürfen nicht locker sein. Machen Sie mit einem Mikroskop und einer feinen Pinzette entweder einen Abstand von 3 mm oder 4,5 mm zwischen den Drähten (3 mm Abstand zwischen den Drähten, um kortikale (Ctx) – ventrolaterale Thalamuskern (VL) Mikroelektroden herzustellen; 4,5 mm Spalt zur Herstellung von striatalen (Str) – nigralen (SNR) Mikroelektroden) (Abbildung 1B). Wenn am Mikroskop eine Vergrößerung verwendet wird, stellen Sie sicher, dass Sie den Unterschied in der Vergrößerung und den tatsächlichen Abstand zwischen den Drähten berechnen und anpassen.HINWEIS: Wenn Mikroelektroden für andere als die hier verwendeten Strukturen konstruiert werden, muss der Abstand zwischen den Drähten an den stereotaktischen Abstand zwischen den Strukturen angepasst werden. Abbildung 2B zeigt ein Beispiel für die Organisation der Drähte. Dementsprechend müssen die stereotaktischen Koordinaten für andere Strukturen angepasst werden. Schneiden Sie vier kleine Kunststoffstücke (0,5 mm dick) ~6 mm (Breite) x 3 mm (Höhe) (Abbildung 1C).HINWEIS: Alle Kunststoffteile können verwendet werden, solange sie 0,5 mm dick sind; Hier wurden quadratische Schläuche verwendet, in denen die Stifte verkauft wurden (Pins, siehe Materialtabelle). Wenn eine andere Dicke verwendet wird, fügen Sie bitte mehr oder weniger Kunststoffteile hinzu, um die erforderlichen stereotaktischen Koordinaten zu passen. Tragen Sie Kleber (siehe Materialtabelle) auf den Kunststoff auf und legen Sie ihn auf die Drähte (Abbildung 1C). Legen Sie Kunststoffteile ~ 1,0 cm von der Mitte des Drahtes entfernt, die 1,0 cm von der Zugstange entfernt ist. Entfernen Sie den überschüssigen Sekundenkleber mit einem Wattestäbchen. Nachdem der Sekundenkleber getrocknet ist, schneiden Sie die Drähte mit einer feinen Schere in der in Abbildung 1C angegebenen Reihenfolge. Schneiden Sie vier 7-mm-Glasröhren mit einem handelsüblichen Kit (siehe Materialtabelle) und setzen Sie die Elektrodendrähte in die Glasröhren ein, wie in Abbildung 2A dargestellt. Führen Sie VL- und SNR-Elektrodenpaare in die Glasröhren ein.HINWEIS: Nur die Drähte für tiefe Strukturen müssen in die Glasröhren eingeführt werden, um die chirurgische Implantation zu unterstützen. Achten Sie darauf, keine kortikalen Elektroden in das Glasröhrchen einzuführen. Legen Sie den Kleber an die Basis der Glasröhren, um sie mit dem Kunststoff zu verbinden. Warten Sie einige Zeit, bis der Kleber trocknet. Die Glasröhren und Drähte werden mit einem Skalpell geschnitten, wie in Tabelle 1 angegeben; Stellen Sie sicher, dass die Längen der Mikroelektroden korrekt sind. Wenn die Mikroelektroden auf unterschiedliche Strukturen abzielen, passen Sie den Schnittabstand entsprechend den erforderlichen stereotaktischen Koordinaten an. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Mikroelektrodenaufbaus . (A) Aufbau von Drähten auf der Plattform mit Zugstäben unterhalb der Drähte. (B) Der Abstand zwischen den Drähten. (C) Vier Stück Kunststoff werden auf die Drähte geklebt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. ctx Str VL SNR AP (Vorder-/Hinterseite) 2.2 1.2 -1.3 -3.3 ML (Medial/Lateral) 1.8 1.5 1 1.5 DV (Dorsal/Ventral) 0.5 3.5 4 4.75 Elektrodenlänge 4 4.75 5.25 6 Tabelle 1: Stereotaktische Implantationskoordinaten und Abmessungen der Mikroelektroden. 2. Mikroelektroden-Array-Baugruppe Verwenden Sie den Kleber, um Kunststoffe in der gewünschten Reihenfolge der Zielregionen zu befestigen. Ein Beispiel für kortikale, thalamische, striatale und nigrale Elektroden ist in Abbildung 2B,C dargestellt. Platzieren Sie das Ctx-VL-Elektrodenpaar mit der Vorderseite nach unten (die Seite mit Elektrodendrähten muss nach unten zeigen) und verbinden Sie zwei 6 mm x 3 mm leere Kunststoffstücke oben mit Klebstoff. Legen Sie das zweite Ctx-VL-Elektrodenpaar auf die drei Kunststoffteile mit den nach oben gerichteten Elektroden (verwenden Sie ein Mikroskop und stellen Sie sicher, dass die VL-Elektroden ausgerichtet sind).HINWEIS: Die Ausrichtung der bilateralen Elektroden (hier die Ausrichtung der linken und rechten VL-Elektroden) ist unerlässlich, um die gewünschten bilateralen Strukturen angemessen anzusprechen. Verwenden Sie den Kleber, um die SNR-Elektroden oben mit den SNR-Elektroden 2,0 mm von den VL-Elektroden und ~ 5,0 mm von den kortikalen Elektroden entfernt zu befestigen (die SNR-Elektrodendrähte müssen nach oben zeigen). Wiederholen Sie Schritt 2.1.3. für die andere Seite (die SNR-Elektrodendrähte müssen außerhalb des Mikroelektrodenarrays zugewandt sein). Tragen Sie Epoxidharz um den Kunststoff auf, um die Elektroden miteinander zu verbinden. Vermeiden Sie es, Epoxidharz auf die Elektroden zu geben. Nehmen Sie einen dicken Draht und machen Sie eine Schleife an einem Ende. Tauchen Sie die Schlaufe in die Epoxidlösung und legen Sie sie auf den Kunststoff, um sicherzustellen, dass der dicke Draht flach liegt (Abbildung 2D), damit dieser Draht für die nächsten Schritte als Griff verwendet werden kann. Warten Sie, bis die Elektroden vollständig trocken sind. Schneiden Sie die Drähte auf 2 cm ab, wie in Abbildung 2E dargestellt. Abbildung 2: Aufbau und Abmessungen der Mikroelektroden. (A) Vier Elektrodenpaare, die gebildet wurden, nachdem die Drähte mit einer Schere geschnitten wurden, wie in Abbildung 1C dargestellt (2 Paare von Ctx-VL-Elektroden und 2 Paare von Str-SNR-Elektroden). Führen Sie Tiefenstrukturelektroden (VL und SNR) in die Glasröhren ein und kleben Sie ihre Basen auf Kunststoff (rote Punkte). (B) Draufsicht: Die Elektrodenpaare von (A) werden in einen Stapel geklebt, um den Mikroelektrodenkern zu erzeugen. Rote Linien zeigen Klebelinien an. (C) Vordere Seitenansicht von (B). (D) Der dicke Draht war an den Mikroelektroden befestigt. (E) Die Drähte werden wie angegeben gruppiert, und die isolierten Enden werden abgekratzt und in 2 cm geschnitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 3. Mikroelektrodenverbindung zum Headset Gruppieren Sie die Drähte wie in Abbildung 2E dargestellt und kratzen Sie 1 mm der isolierten Enden mit einem Skalpell ab. Biegen Sie die kortikalen Elektroden, wie in Abbildung 3A dargestellt. Trennen Sie die Drähte wie in Abbildung 3B dargestellt. Machen Sie mit einer feinen Pinzette eine Schleife am Ende jedes Drahtes (Abbildung 3B). Halten Sie ein 10-poliges Headset mit einem Hämostat (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie das Holzende eines Wattestäbchens, um minimale Mengen an Flussmittel auf die Stifte aufzutragen (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass kein Flussmittel außerhalb der Pins platziert wird, um einen Kurzschluss zwischen den Pins zu vermeiden. Verwenden Sie das Holzende eines Wattestäbchens, um Flussmittel auf die Drahtschlaufen aufzutragen. Löten Sie die Kabelschlaufen an das 10-polige Headset, wie in Abbildung 3C dargestellt. Trocknen Sie das Headset nach dem Löten, um einen Kurzschluss zwischen den Pins zu vermeiden. Nehmen Sie einen dünnen Draht (0,005-0,008 Zoll) für die Referenz- und Erdungsdrähte und entfernen Sie den Kunststoff von einem Ende. Machen Sie eine Schleife am anderen Ende des Drahtes. Löten Sie die abisolierte Seite der Referenz- und Massedrähte an die jeweiligen Stifte (Abbildung 3A,C). Halten Sie den dicken Draht fest (Abbildung 2D), tragen Sie Kranioplastikzement um die Mikroelektroden auf, insbesondere dort, wo die Drähte mit den Stiften verbunden sind. Vermeiden Sie es, die eigentlichen Elektrodenenden mit dem Zement zu berühren. Nachdem der Zement getrocknet ist, legen Sie Epoxidharz an die Basis der Glasröhren, der striatalen Mikroelektrodendrähte und der gesamten Elektrode. Vermeiden Sie es, die eigentlichen Elektrodenenden mit Epoxidharz zu berühren. Warten Sie, bis die Elektroden vollständig trocken sind. Die Elektroden sind fertig. Bohren Sie Löcher in den Schädel der Maus (gemäß den erforderlichen stereotaktischen Koordinaten) mit einem Zahnbohrer und implantieren Sie das Headset wie in Abbildung 3D gezeigt, indem Sie das Headset mit Mikroelektroden zum Schädel und den entsprechenden Löchern hin absenken. Das Headset könnte zur Unterstützung während der Implantation am stereotaktischen Arm befestigt werden. Abbildung 3: Mikroelektrodenimplantation. (A) Die kortikalen Elektroden sind wie angegeben gebogen. (B) Die Drähte werden getrennt, um Schleifen an den Enden zu bilden. (C) Das Flussmittel (an den roten Punkten) und die Schlingendrähte werden mit dem 10-poligen Headset verlötet, um sicherzustellen, dass jedes Kabel zu seinem entsprechenden Pin geht. (D) Das Headset wird implantiert, um LFPs aufzuzeichnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 4. Markieren der Elektrodenposition nach Aufnahmen Bestätigen Sie am Ende der LFP-Aufzeichnungen die korrekte Position der Elektroden im Zielbereich, indem Sie einen Strom an den Elektrodenspitzen anlegen, um eine Läsion zu erzeugen, und 30 Minuten warten, bevor Sie die Maus durchbluten.HINWEIS: Läsionseinstellungen zur Bestätigung der Position der Elektrodenspitzen: Single burst, 40 μA, 0,75 ms monophasischer Rechteckwellenpuls, 50 Hz, 30 s. Betäuben Sie die Mäuse mit Isofluran (bis die Maus einschlief) undperfundierten Sie 10 transkardial mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer. Schneiden Sie das Gehirn (40 μm dick) auf einen Kryostaten (siehe Materialtabelle) und färben Sie es mit DAPI (0,02% in PBS). Bestätigen Sie die korrekte Position der Elektroden durch das Vorhandensein der Elektrodenspitzenläsionen, wie in Abbildung 4B,C gezeigt.HINWEIS: Der Prozentsatz des Isoflurans muss gemäß den Richtlinien der einzelnen Institutionen angewendet werden. 5. Messung des Elektrodenwiderstandes Messen Sie den Widerstand der Elektroden und überprüfen Sie den Kurzschluss zwischen den Elektroden mit einem Mehrbereichs-Ohmmeter (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Widerstandsskala auf R x 10.000 ein, was darauf hinweist, dass eine Einheitsauslenkung im Zeiger einem Widerstand von 1 kΩ entspricht. 2 cm lange Elektroden müssen einen Widerstand von 60-70 kΩ haben. Passen Sie das Headset an, indem Sie zehn einzelne Pins nehmen (siehe Materialtabelle). Löten Sie jeden Stift mit einem dünnen, mehradrigen Kupferdraht in einem Kabel. Drücken Sie die gelöteten Stifte mit den entsprechenden Kabelendeln in die 10-polige zweireihige Gegensteckbuchse (passende Buchsen). Drücken Sie die offenen Pins der Gegensteckdose in das LFP-Headset. Auf diese Weise hat jede LFP-Elektrode einen designierten Kabeldraht in der Baugruppe. Tauchen Sie die Spitze jeder LFP-Elektrode (deren Widerstand gemessen werden soll) in 0,9% NaCl-Kochsalzlösung (NaCl-Konzentration im Blut). Verbinden Sie das Kabeldrahtende, das der LFP-Elektrode entspricht, mit dem Pluspol des Ohmmeters. Verwenden Sie einen Draht mit niedrigem Widerstand ( ̴100 Ω) mit einer Seite im Salzwasser und der anderen Seite als offenes Ende. Verbinden Sie das offene Ende des widerstandsarmen Drahtes mit der Masse des Ohmmeterzeigers.HINWEIS: Diese Anordnung vervollständigt die Schaltung und führt zu einer Ablenkung des Ohmmeterzeigers. Stellen Sie sicher, dass keine elektrische Verbindung zwischen zwei Elektroden am Headset besteht. Überprüfen Sie die elektrische Isolierung von paarweisen LFP-Elektroden (Masse: ein Kabel entspricht einer Elektrode; positiv: ein anderes Kabel entspricht einer anderen Elektrode). Entsorgen Sie die Elektroden, wenn in diesem Fall eine Durchbiegung beobachtet wird.

Representative Results

In dieser Arbeit wurden die LFP-Mikroelektroden verwendet, um die Anfallsausbreitung durch die Basalganglien11 zu kartieren. Simultane LFP-Aufnahmen wurden vom rechten prämotorischen Kortex (wo sich der Anfallsfokus befand) und der linken VL, dem Striatum und dem SNR durchgeführt (Abbildung 4). Der Anfallsbeginn wurde als Ablenkung der Spannungsspur identifiziert, die mindestens doppelt so hoch war wie der Ausgangswert (Abbildung 4A, ro…

Discussion

In der Vergangenheit wurden Mikroelektroden-Arrays häufig verwendet, um neuronale Aktivität aus einer bestimmten Gehirnregion von Interesse^{aufzuzeichnen} 2,3,4,5,6,7,8,9,13. Unser einfaches Mikroelektrodendesign ermöglic…

Materials

Amplifier 16-Channel	A-M Systems	Model 3600	Amplifier
Cranioplasty cement	Coltene	Perm Reeline/Repair Resin Type II Class I Shade – Clear	Cement to hold microelectrodes
Cryostat Microtome	Precisionary	CF-6100	To slice brain
Diamel-coatednickel-chromium wire	Johnson Matthey Inc.	50 µm	Microelectrode wire
Dremel	Dremel	300 Series	To drill holes in mouse skull
Epoxy	CEC Corp	C-POXY 5	Fast setting adhesive
Hemostat	Any		To hold the headset
Forceps	Any		To hold microelectrodes
Light microscope	Nikon	SMZ-10	To see alignment
Ohmmeter	Any		To measurre resistance
Pins (Headers and matching Sockets)	Mill-Max	Interconnects, 833 series, 2 mm grid gull wing surface mount headers and sockets	To attach microelectrodes to
Polymicro Tubing Kit	Neuralynx	ID 100 ± 04 µm, OD 164 ± 06 µm, coating thickness 12 µm	Glass tubes
Pulse Stimulator	A-M Systems	Model 2100	To mark the microelectrode location at the end of the recordings
Scissors	Any		To cut microelectrodes
Superglue	Gorilla		Adhesive
Thick wire 0.008 in. – 0.011 in.	A-M Systems	791900	Tick wire to hold the microelectrode array
Thin wire 0.005 in. – 0.008 in.	A-M Systems	791400	Thin wire for reference and ground