Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

2.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/63636

⸱

6. April 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.

Zusammenfassung

Vererbte Immunität beschreibt, wie einige Tiere das "Gedächtnis" einer früheren Infektion an ihre Nachkommen weitergeben können. Dies kann die Resistenz von Krankheitserregern in ihren Nachkommen erhöhen und das Überleben fördern. Während bei vielen wirbellosen Tieren eine vererbte Immunität berichtet wurde, sind die Mechanismen, die diesem epigenetischen Phänomen zugrunde liegen, weitgehend unbekannt. Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den natürlichen mikrosporidianen Erreger Nematocida parisii führt dazu, dass die Würmer Nachkommen produzieren, die robust resistent gegen Mikrosporidien sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der intergenerationellen Immunität im einfachen und genetisch behandelbaren N. parisii-C . elegans Infektionsmodell. Der aktuelle Artikel beschreibt Methoden zur Infektion von C. elegans und zur Erzeugung von immungrundierten Nachkommen. Es werden auch Methoden zur Bestimmung der Resistenz gegen Mikrosporidieninfektionen durch Färbung auf Mikrosporidien und Visualisierung der Infektion durch Mikroskopie gegeben. Insbesondere verhindert die vererbte Immunität die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien, und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann zur Quantifizierung von Invasionsereignissen verwendet werden. Die relative Menge an Mikrosporidiensporen, die bei den immungrundierten Nachkommen produziert werden, kann quantifiziert werden, indem die Sporen mit einem Chitin-bindenden Farbstoff gefärbt werden. Bis heute haben diese Methoden Aufschluss über die Kinetik und die Spezifität der vererbten Immunität sowie die ihr zugrunde liegenden molekularen Mechanismen gegeben. Diese Techniken, zusammen mit den umfangreichen Werkzeugen, die für die Forschung von C. elegans zur Verfügung stehen, werden wichtige Entdeckungen auf dem Gebiet der vererbten Immunität ermöglichen.

Einleitung

Die vererbte Immunität ist ein epigenetisches Phänomen, bei dem die elterliche Exposition gegenüber Krankheitserregern die Produktion von infektionsresistenten Nachkommen ermöglichen kann. Diese Art von Immungedächtnis wurde bei vielen wirbellosen Tieren gezeigt, denen ein adaptives Immunsystem fehlt und die vor viralen, bakteriellen und Pilzerkrankungen schützen können1. Während die vererbte Immunität wichtige Auswirkungen auf das Verständnis von Gesundheit und Evolution hat, sind die molekularen Mechanismen, die diesem Schutz zugrunde liegen, weitgehend unbekannt. Dies liegt zum Teil daran, dass viele der Tiere, bei denen eine vererbte Immunität beschrieben wurde, keine etablierten Modellorganismen für die Forschung sind. Im Gegensatz dazu profitieren Studien am transparenten Fadenwurm Caenorhabditis elegans von einem umfangreichen genetischen und biochemischen Toolkit2,3, einem stark annotierten Genom 4,5 und einer kurzen Generationszeit. Tatsächlich hat die Forschung in C. elegans grundlegende Fortschritte auf den Gebieten der Epigenetik und der angeborenen Immunitätermöglicht 6,7, und es ist jetzt ein etabliertes Modell für die Untersuchung des Immungedächtnisses 8,9.

Mikrosporidien sind pilzliche Krankheitserreger, die fast alle Tiere infizieren und bei immungeschwächten Menschen tödliche Infektionen verursachen10. Die Infektion beginnt, wenn eine Mikrosporidiensporie ihren Zellinhalt (Sporoplasma) in eine Wirtszelle injiziert oder "feuert", indem sie eine Struktur verwendet, die als Polröhre bezeichnet wird. Die intrazelluläre Replikation des Parasiten führt zur Bildung von Meronten, die sich letztendlich in reife Sporen differenzieren, die die Zelleverlassen können 11,12. Während diese Parasiten sowohl für die menschliche Gesundheit als auch für die Ernährungssicherheit schädlich sind, gibt es noch viel über ihre Infektionsbiologiezu lernen 12. Nematocida parisii ist ein natürlicher mikrosporidianer Parasit, der sich ausschließlich in den Darmzellen von Würmern repliziert, was zu einer verminderten Fruchtbarkeit und letztendlich zum Tod führt. Das N. parisii-C. elegans-Infektionsmodell wurde verwendet, um zu zeigen: (1) die Rolle der Autophagie bei der Pathogen-Clearance 13, (2) wie Mikrosporidien infizierte Zellen nicht-lytisch verlassen können 14, (3) wie sich Krankheitserreger von Zelle zu Zelle ausbreiten können, indem sie Synzytie15 bilden, (4) die Proteine, die N. parisii verwendet, um mit seinem Wirt 16 zu interagieren, und (5) die Regulation der transkriptionellen intrazellulären Pathogenantwort (IPR)17, 18.

Protokolle für die Infektion von C. elegans sind in der aktuellen Arbeit beschrieben und können verwendet werden, um die einzigartige Mikrosporidienbiologie aufzudecken und die Reaktion des Wirts auf eine Infektion zu sezieren. Die Mikroskopie von fixierten Würmern, die mit dem Chitin-bindenden Farbstoff Direct Yellow 96 (DY96) angefärbt sind, zeigt die Infektionsausbreitung von Chitin-haltigen Mikrosporidiensporidien im Darm. Die DY96-Färbung ermöglicht auch die Visualisierung von Chitin-haltigen Wurmembryonen zur gleichzeitigen Beurteilung der Wurmschwerkraft (Fähigkeit, Embryonen zu produzieren) als Auslesung der Wirtsfitness.

Jüngste Arbeiten haben ergeben, dass C. elegans , die mit N. parisii infiziert sind, Nachkommen produzieren, die robust resistent gegen die gleiche Infektionsind 19. Diese vererbte Immunität dauert eine einzige Generation und ist dosisabhängig, da Nachkommen von stärker infizierten Eltern resistenter gegen Mikrosporidien sind. Interessanterweise sind N. parisii-grundierte Nachkommen auch resistenter gegen den bakteriellen Darmpathogen Pseudomonas aeruginosa, obwohl sie nicht gegen den natürlichen Erreger Orsay-Virus19 geschützt sind. Die vorliegende Arbeit zeigt auch, dass immungrundierte Nachkommen die Invasion von Wirtszellen durch Mikrosporidien begrenzen. Die Methode beschreibt auch die Sammlung von immungrundierten Nachkommen und wie FISH verwendet werden kann, um N. parisii-RNA in Darmzellen nachzuweisen, um die Invasion von Wirtszellen und das Abfeuern von Sporen20 zu untersuchen.

Zusammen bieten diese Protokolle eine solide Grundlage für die Untersuchung von Mikrosporidien und vererbter Immunität bei C. elegans. Es ist zu hoffen, dass zukünftige Arbeiten in diesem Modellsystem wichtige Entdeckungen auf dem im Entstehen begriffenen Gebiet der vererbten Immunität ermöglichen werden. Diese Techniken sind wahrscheinlich auch Ansatzpunkte für die Untersuchung der mikrosporidieninduzierten vererbten Immunität in anderen Wirtsorganismen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die vorliegende Studie verwendet den Wildtyp-C. elegans Bristol-Stamm N2, der bei 21 °C angebaut wird.

1. Aufbereitung von Medien

  1. Bereiten Sie M9-Medien gemäß dem vorherigen Bericht21,22 vor.
  2. Bereiten Sie Nematodenwachstumsmedium (NGM) gemäß vorherigem Bericht21,22 vor. Gießen Sie 12 ml NGM pro 6 cm Platte oder 30 mL pro 10 cm Platte.
  3. Bereiten Sie den Escherichia coli-Stamm OP50-1 gemäß einem früheren Bericht23 vor.
  4. Bereiten Sie OP50-1-seeded NGM-Platten vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Resuspendieren Sie 10x konzentriertes OP50-1 durch Wirbeln.
    2. Verwenden Sie eine Repeater-Pipette, um die Platten in der Mitte zu säen. Für 6 cm und 10 cm Platten, Samen mit einem Volumen von 200 μL bzw. 500 μL.
    3. Für 10 cm Platten verwenden Sie einen Glasstreuer, um den OP50-1 zu verteilen und einen Rasen aus Bakterien zu schaffen. Verbreiten Sie die Bakterien nicht bis zum äußersten Rand der Platte.
      HINWEIS: Ethanol tauchen und flammen Sie den Streuer alle fünf Platten, um Sterilität zu gewährleisten. Lassen Sie den Streuer einige Sekunden abkühlen, bevor er sich ausbreitet, um zu verhindern, dass Bakterien abgetötet werden.
    4. Lassen Sie die Teller bei Raumtemperatur für 2 Tage trocknen und das Wachstum des Bakterienrasens sicherstellen.
      HINWEIS: Aussaatplatten können bei Raumtemperatur für 2-3 Wochen oder bei 4 °C für bis zu 1 Monat gelagert werden.

2. Aufrechterhaltung von C. elegans

  1. Pflegen Sie Würmer auf einer konstanten bakteriellen Nahrungsquelle auf OP50-1-seeded NGM-Platten.
    HINWEIS: Hunger kann zu generationenübergreifenden Phänotypen führen, die die Ergebnisse beeinflussen können. Eine 10 cm große OP50-1-säte Platte unterstützt 2.500 L1s (das früheste Larvenstadium von C. elegans) für bis zu 72 h.
  2. Wenn die Würmer verhungern, wachsen Sie drei Generationen lang auf OP50-1, bevor Sie die Würmer für Experimente verwenden.

3. Synchronisation von C. elegans-Populationen unter Verwendung von Natriumhypochlorit (Bleichen)

HINWEIS: Dieser Schritt ist sehr zeitkritisch, also stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge verfügbar ist, bevor Sie beginnen. Alternative, weniger schnelle Bleichprotokolle sind in der Literatur verfügbar und können verwendet werden, wenn gewünscht. Um zu verhindern, dass 6% Natriumhypochlorit im Laufe der Zeit an Aktivität verliert, lagern Sie das Reagenz im Dunkeln bei 4 ° C und bewahren Sie es bis zu 1 Jahr auf.

  1. Bereiten Sie 2 ml Bleichlösung für jede Probe vor, indem Sie 400 μL 1 M NaOH, 250 μL 6% Natriumhypochlorit (siehe Materialtabelle) und 1350 μL destilliertes Wasser mischen.
  2. Waschen Sie erwachsene Würmer (~ 72 h nach dem Schlüpfen) von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Medien.
    HINWEIS: Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand mit einer 1 ml Pipettenspitze und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
  3. Zentrifugieren Sie bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren, und waschen Sie dann 2x mit 1 ml M9-Medien, um Bakterien zu entfernen.
  4. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml der vorbereiteten Bleichlösung hinzu (Schritt 3.1.) und stellen Sie einen Timer auf 1 Minute ein. Drehen Sie die Röhren 3-4x um.
    HINWEIS: Unter einem Lichtmikroskop können die Würmer gesehen werden, um das Schlagen zu stoppen.
  5. Nach 1 min bei 3.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur zentrifugieren, um die Würmer zu pelletieren, dann den Überstand entfernen und 1 ml frische Bleichlösung hinzufügen.
  6. Überwachen Sie die Röhre(n) genau unter einem Lichtmikroskop, um die Wurmkadaver zu visualisieren, die sich aufspalten und Embryonen freisetzen. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, wenn ~ 50% -80% der Kadaver aufgebrochen sind und viele Embryonen freigesetzt wurden.
    HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Tiere und dem Wurmstamm kann dieser Schritt 15 s bis 4 Minuten dauern. Aus unbekannten Gründen brauchen N. parisii-infizierte Würmer oft länger zum Bleichen als nicht infizierte Tiere.
  7. Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Embryonen zu pelletieren, und waschen Sie dann 3x in 1 ml M9-Medien.
    HINWEIS: Waschungen verdünnen die restliche Hypochloritlösung aus den Röhrchen und müssen schnell durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Bleichlösung die Embryonen nicht schädigt.
  8. Geben Sie 1 ml M9-Medien in das endgültige Pellet und geben Sie es in ein 15 ml konisches Röhrchen, das 4 ml M9-Medien enthält. Suspendieren Sie die Embryonen in einem Endvolumen von 5 ml.
  9. Drehen Sie die Rohre auf einem mechanischen Rotor (siehe Materialtabelle) bei 21 °C für 18-24 h, um die Embryonen zu L1s zu schlüpfen.
    HINWEIS: Da N. parisii den Wurmdarm infiziert und nicht in die Keimbahn eindringt, geben infizierte Eltern die Infektion nicht durch vertikale Übertragung an ihre Nachkommenweiter 19. Das Bleichen infizierter Erwachsener synchronisiert F1-Tiere und zerstört N. parisii-Sporen , wodurch sichergestellt wird, dass F1-Nachkommen nicht mit Sporen infiziert werden, die von den Eltern übertragen wurden.
  10. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 1 min bei 1.800 x g bei Raumtemperatur, um die L1s zu pelletieren, und entsorgen Sie alle bis auf 1 ml des Überstands.
  11. Pipettieren Sie 1-5 μL L1-Mischung auf eine ungesäte NGM-Platte und zählen Sie sofort die Anzahl der L1s im Tröpfchen, indem Sie unter einem Lichtmikroskop visualisieren. Wiederholen Sie 3x und mitteln Sie die Zählungen, um die Konzentration und Gesamtzahl der L1s zu bestimmen.
    HINWEIS: Die Mehrheit der Embryonen sollte geschlüpft sein, und die L1s sollten sich schnell im flüssigen Tröpfchen bewegen. Wenn ein großer Teil der nicht geschlüpften Embryonen und lethargischen (sich langsam bewegenden) L1s verbleibt, deutet dies auf eine zu lange Bleiche hin.

4. Herstellung von N. parisii Sporen

  1. Bereiten Sie N. parisii-Sporen nach zuvor veröffentlichten Referenzenvor 19,24.

5. Infektion von C. elegans mit N. parisii zur Erzielung immungrundierter Nachkommen

  1. Bewegen Sie einen Tag vor geplanten Infektionen die erforderliche Anzahl von 10 cm ungesäten NGM-Platten von 4 °C auf Raumtemperatur.
  2. Unmittelbar vor der Infektion zentrifugieren ~ 2.500 synchronisierte L1-Würmer bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze, um Würmer in ~ 50 μL M9-Medien zu belassen.
  3. Fügen Sie 1 ml 10x OP50-1 zu den L1s und N. parisii Sporen zur gewünschten Konzentration hinzu (typischerweise ~ 2,5 Millionen Sporen). Als nicht infizierte Kontrolle ist ein äquivalentes Röhrchen L1s und OP50-1 mit einem Volumen von M9-Medien herzustellen, das dem Volumen der verwendeten Sporenzubereitung entspricht.
    HINWEIS: Um immunisierte Nachkommen zu erhalten, verwenden Sie eine Sporendosis, die hoch genug ist, so dass >90% der Tiere mit 72 h infiziert sind (gemessen durch DY96-Färbung, Schritt 7), aber niedrig genug, so dass >80% der Tiere immer noch gravid sind. Dies stellt sicher, dass die meisten Nachkommen von infizierten Eltern stammen und dass das Ausbleichen der Eltern genügend Embryonen für F1-Tests liefert. Obwohl Sporenpräparate in Konzentration und Infektiosität variieren, liegt eine geeignete elterliche Dosis typischerweise zwischen 5-15 μL Sporenpräparation (~ 2,5 Millionen Sporen) pro 10 cm Platte.
  4. Wirbeln Sie kurz, um die oben genannten 1 ml Würmer zu mischen und auf eine 10 cm lange ungesäte NGM-Platte zu legen. Schwenken, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeit über die gesamte Platte verteilt.
  5. Trocknen Sie die Platten in einem sauberen Schrank mit abgenommenen Deckeln für 10-20 min oder bis sie vollständig trocken sind, bevor Sie bei 21 °C für 72 h inkubieren.
  6. Bei 72 h nach der Infektion (hpi) waschen Sie die Würmer von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Medien. Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 30 s, entfernen Sie den Überstand und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
  7. Zentrifen Sie bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur zu Pelletwürmern, waschen Sie 2x mit 1 ml M9-Medien oder bis der Überstand klar ist. Resuspendieren Sie in einem Endvolumen von 1 ml M9-Medien.
  8. Pipette auf und ab, um zu mischen, dann 100 μL der suspendierten Würmer in ein frisches Röhrchen zu übertragen.
    HINWEIS: Diese Stichprobe von ~ 250 Erwachsenen kann später fixiert und gefärbt werden, um die elterliche Wurmfitness und den Infektionsstatus zu bestimmen, wie in Schritt 7 und zu Beginn von Schritt 3 beschrieben.
  9. Um die erwachsenen Würmer aufzubrechen und F1-Embryonen zum Testen freizusetzen, bleichen Sie die verbleibenden 900 μL suspendierter Würmer aus, wie in Schritt 3 beschrieben.
    HINWEIS: Dieser Schritt zerstört auch alle N. parisii-Sporen vor nachfolgenden Infektionstests.

6. Prüfung der vererbten Immunität gegen N. parisii bei C. elegans

  1. Führen Sie Infektionen wie in den Schritten 5.1.-5.6 beschrieben mit den unten genannten Änderungen durch.
    HINWEIS: Infektionsassays auf F1s können verkleinert und auf 6 cm NGM-Platten mit ~ 1.000 L1-Würmern und 400 μL von 10x OP50-1 durchgeführt werden. Es muss auch eine "hohe" Dosis von Sporen verwendet werden, so dass ~ 100% der naiven F1s (dh Würmer von nicht infizierten Eltern) infiziert sind und nur ~ 10% der naiven F1s gravid sind. Obwohl Sporenpräparate in Konzentration und Infektiosität variieren, liegt eine geeignete Dosis typischerweise zwischen 5-15 μL (~ 2,5 Millionen Sporen) pro 6-cm-Platte.
  2. Bei 72 hpi fixieren und färben Sie, um die Fitness und den Infektionsstatus des Wurms zu bestimmen, wie in Schritt 7 beschrieben.

7. DY96-Färbung von C. elegans zur Visualisierung von Embryonen und Mikrosporidiensporen

HINWEIS: DY96 ist ein grün fluoreszierender Chitin-bindender Farbstoff, der Wurmembryonen und Mikrosporidien-Sporenwände 19,15,25 färbt. Dies ermöglicht die gleichzeitige Überwachung der Fitness und des Infektionsstatus der Würmer.

  1. Waschen Sie die Würmer von den Platten in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml M9-Medien, die 0,1% Tween-20 enthalten. Wenn viele Würmer auf den Platten verbleiben, pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze und führen Sie zusätzliche Plattenwäschen durch.
  2. Zentrifugieren Sie bei 1.400 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren, und waschen Sie 2x mit 1 ml M9-Medien mit 0,1% Tween-20 oder bis der Überstand klar ist.
  3. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 700 μL Aceton hinzu und lassen Sie die Würmer bei Raumtemperatur für 10 Minuten fixieren.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Würmer bei -20 °C gelagert werden, um sie auf Wunsch bis zu mehreren Monaten später zu verarbeiten.
  4. Zentrifizieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die festen Würmer zu pelletieren, und waschen Sie 2x mit 1 ml PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST).
  5. Bereiten Sie 50 ml DY96-Arbeitslösung vor: PBST, 0,1% (v/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 20 μg/ml DY96 (aus einer 5 mg/ml Stammlösung in destilliertem Wasser) (siehe Materialtabelle). Wickeln Sie das Röhrchen in Folie und bewahren Sie es in einer Schublade auf, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
    HINWEIS: DY96-Lager und Arbeitslösungen können bei > 1 Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie im Dunkeln aufbewahrt werden.
  6. Zentrigieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren und Überstände zu entfernen. 500 μL DY96-Arbeitslösung in das Pellet geben und 30 min bei Raumtemperatur drehen.
  7. Zentrigieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um die Würmer zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 15 μL des Montagemediums mit/ohne DAPI hinzu (siehe Materialtabelle).
  8. Pipette 10 μL der Lösung, die gefärbte Würmer enthält, auf einen Objektträger und legen Sie ein Deckglas darüber auf.
    HINWEIS: Objektträger und zusätzliche Proben können bei 4 °C im Dunkeln zur Langzeitlagerung gelagert werden.

8. Bildgebung und Analyse von DY96-gefärbten Würmern zur Beurteilung der Wurmfitness und des Infektionsstatus

  1. Um die DY96-gefärbten Würmer (montiert auf Objektträgern, wie in Schritt 7.8) zu analysieren, führen Sie eine Bildgebung mit dem GFP-Kanal eines Fluoreszenzmikroskops durch.
  2. Um die Fitness der Wurmpopulationen zu bestimmen, verwenden Sie ein 5x- oder 10x-Objektiv, um die Schwerkraft von >100 Würmern pro Bedingung zu bestimmen.
    HINWEIS: Würmer, die ≥1 Embryo tragen, gelten als gravid. Mechanische Zellzähler können helfen, menschliche Fehler beim Zählen zu minimieren. Wurmembryonen sind weniger gefärbt (weniger fluoreszierend) als Mikrosporidiensporen19. Embryonen sind eiförmig, ~ 50 μm x ~ 30 μm, und finden sich im Mittelkörper von gesunden C. elegans Erwachsenen. Gesunde, nicht infizierte Erwachsene tragen 10-20 Embryonen, die in Reihen entlang ihrer Körperlängeorganisiert sind 26.
  3. Um subtilere Unterschiede in der Fitness aufzudecken, führen Sie Embryonenzählungen durch. Zählen Sie dazu manuell die Anzahl der Embryonen in 20-30 einzelnen Würmern pro Bedingung.
  4. Um festzustellen, wie infiziert die Wurmpopulationen sind, verwenden Sie ein 5x-40x-Ziel, um den Infektionsstatus von >100 Würmern pro Zustand zu beurteilen. Würmer, die eine beliebige Anzahl von intrazellulären Darmsporen enthalten, gelten als infiziert.
    HINWEIS: Mikrosporidiensporen sind heller als Wurmembryonen. Die bohnenförmigen Sporen von N. parisii sind ~2,2 μm x ~0,8 μm groß und werden in den Darmzellen des Wurms aus ~48 hpi15 produziert. Würmer, bei denen Sporen ausschließlich im Darmlumen und nicht entlang der Darmwände zu sehen sind, gelten nicht als infiziert19. Dies liegt daran, dass diese Sporen wahrscheinlich neu aufgenommene Sporen darstellen, die nicht aus einer Infektion des Individuums resultieren.
  5. Quantifizieren Sie mithilfe von Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle) die Parasitenbelastung und die Wurmgröße gemäß den folgenden Schritten.
    1. Bild 20-30 Würmer, die auf Objektträgern montiert sind, verwenden ein fluoreszierendes aufrechtes Stereoskop für jede Probe. Erfassen Sie Bilder in Brightfield-, DAPI- und GFP-Kanälen. Wählen Sie eine geeignete Exposition im GFP-Kanal, so dass die Fluoreszenz in den am meisten infizierten Proben nicht gesättigt ist.
      HINWEIS: Die Infektion kann immer noch in den am wenigsten infizierten Proben visualisiert werden. Bilder werden in der Regel mit einem 5-fachen Objektiv aufgenommen.
    2. Öffnen Sie Dateien in FIJI/ImageJ. Je nach Dateityp kann das Bio-Formats Importer-Plugin erforderlich sein, um Bilder in ImageJ zu öffnen.
    3. Skizzieren Sie 20-30 einzelne Würmer in Bildern mit Hellfeld- oder DAPI-Bildern und dem Polygon-Auswahlwerkzeug in der Symbolleiste. Speichern Sie jede Gliederung mit Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager im Dropdown-Menü, indem Sie auf Hinzufügen [t] klicken. Skizzieren Sie Tiere, die im Rahmen vollständig sichtbar sind.
      HINWEIS: Wurmumrisse können später erneut besucht werden, indem die Datei mit Umrissen als Tiff gespeichert wird.
    4. Klicken Sie im ROI-Manager auf Auswahl aufheben, um alle Umrisse aus dem Bild zu entfernen, und klicken Sie im Dropdown-Menü auf Bild > Duplizieren. Geben Sie die dem interessierenden Kanal entsprechende Nummer in das Feld "Kanäle" ein, um den GFP-Kanal für die Parasitenbelastung zu duplizieren (z. B. 2).
    5. Schwellen Sie diesen Kanal mit Image > Passen Sie > Schwellenwert auf ein Niveau an, bei dem die helle Parasitenlast erfasst wird, die Dimmerfluoreszenz von Wurmembryonen jedoch nicht, und klicken Sie dann auf Anwenden. Notieren Sie sich die angewandten Schwellenwerte und verwenden Sie diese konsistent für alle Bilder desselben Experiments.
      HINWEIS: Überprüfen Sie, ob der Schwellenwert ein geeigneter Wert für die am wenigsten infizierten und die am häufigsten infizierten Proben ist, bevor Sie alle Bilder analysieren.
    6. Wählen Sie Analysieren > Maße festlegen aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Flächenbruch. Wählen Sie abwechselnd einzelne Wurmumrisse aus dem ROI-Manager aus und klicken Sie auf die Funktion Analyze > Measure. Ein Ergebnisfenster liefert die Messung für %Area (d. h. % Parasitenbelastung).
      HINWEIS: Wenn die Fluoreszenz der Embryonen so hell ist, dass sie den Schwellenwert überschreitet, kann das Pinselwerkzeug in Schwarz in der Symbolleiste verwendet werden, um diese Bereiche manuell zu löschen, bevor %Area gemessen wird.
    7. Um die Wurmgröße als Auslesung der Fitness zu bestimmen, skizzieren Sie die Würmer wie in Schritt 8.3 beschrieben. Wählen Sie Analysieren > Maße festlegen aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für Fläche. Wählen Sie abwechselnd einzelne Wurmumrisse aus dem ROI-Manager aus und klicken Sie auf die Funktion Analyze > Measure. Ein Ergebnisfenster zeigt die Messung für %Area an.

9. FISH-Assay zur Beurteilung der Invasion von C. elegans durch Mikrosporidien und Sporenfeuerung

HINWEIS: Die MicroB FISH-Sonde erkennt eine konservierte Region der mikrosporidianen 18s-rRNA und kann verwendet werden, um intrazelluläre Sporoplasmen (dh eingedrungene Wirtszellen) und das genetische Material in Sporen zu markieren.

  1. Infizieren Sie 6.000 bleichmittelsynchronisierte L1-Würmer mit 4 Millionen Sporen von N. parisii und 10 μL von 10x OP50-1 in einem Endvolumen von 400 μL, das mit M9-Medien hergestellt wird.
  2. Die Mischung auf eine 6 cm lange ungesäte NGM-Platte stellen, in einem sauberen Schrank für 10-20 min trocknen und bei 21 °C platzieren.
  3. Nach 30 Minuten waschen Sie die Tiere mit 1 ml M9-Medien mit 0,1% Tween-20 von den Tellern.
  4. Pelletieren Sie die Würmer durch Zentrifugieren bei 1.400 x g für 1 min bei Raumtemperatur.
  5. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze, fügen Sie 700 μL Aceton hinzu und lassen Sie ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Würmer bei -20 °C gelagert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt verarbeiten zu können.
  6. Führen Sie einen FISH-Test über Nacht mit der MicroB-Sonde gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten27,19 durch.
    HINWEIS: Um die Sporenverbrennung zu beurteilen, ergänzen Sie die letzten 500 μL Waschpuffer mit 20 μg/ml DY96 zu den Proben und drehen Sie sie 30 min bei 21 °C, bevor Sie mit dem Protokoll wie gewohnt fortfahren.
  7. Bewahren Sie die Folien in einem Folienkasten bei 4 °C auf. Für die Langzeitlagerung (d. h. mehrere Monate) lagern Sie zusätzliche Proben in Mikrozentrifugenröhrchen bei 4 °C bei Dunkelheit.
  8. Um die Invasion in FISH-gefärbten Würmern zu beurteilen, betrachten Sie die Würmer mit dem roten Kanal eines Fluoreszenzmikroskops. Visualisieren Sie Infektionsereignisse bei hoher Vergrößerung (63-faches Ziel), da L1-Tiere klein sind und sich Sporoplasmen in den frühen Stadien der Replikation befinden. Um die Sporenbefeuerung zu beurteilen, verwenden Sie ein 63-faches Objektiv und sowohl rote als auch grüne Fluoreszenzkanäle.
    HINWEIS: Sporen, in denen GFP und mCherry-Signal kolokalisieren, gelten als unbefeuert; leere GFP-Sporenfälle gelten als gefeuert.
  9. Um die Invasion oder das Sporenfeuern zu untersuchen, zählen Sie manuell die Anzahl der Sporoplasmen (mCherry-Herde in den Darmzellen) oder den Prozentsatz der Sporen, die in 20-30 Würmern pro Zustand abgefeuert werden. Passen Sie den Fokus in der Z-Ebene an, um alle Infektionsereignisse und Sporen zu erfassen, die oft in verschiedenen Ebenen vorkommen.
    HINWEIS: Sporoplasmen befinden sich ausschließlich in den Darmzellen. Die höchste Konzentration von Sporoplasmen wird typischerweise unmittelbar nach dem Pharynx gefunden. Wenn Proben auch mit DY96 gefärbt sind, achten Sie auf das Vorhandensein von Sporoplasmen, die nicht mit der Spore kolokalisieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wurden elterliche Populationen von C. elegans (P0) im L1-Stadium mit einer niedrigen Dosis von N. parisii-Sporen infiziert. Diese Infektionsbedingungen werden typischerweise verwendet, um eine hohe Anzahl von mikrosporidienresistenten F1-Nachkommen durch Bleichen der Eltern zu erhalten. Infizierte Elternpopulationen und nicht infizierte Kontrollen wurden auf 72 hpi festgelegt und mit DY96 gefärbt, um die Wurmembryonen und Mikrosporidiensporen sichtbar zu m...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung von Mikrosporidien und vererbter Immunität in einem einfachen und genetisch behandelbaren N. parisii-C. elegans-Infektionsmodell.

Die Sporenpräparation ist ein intensives Protokoll, das in der Regel genügend Sporen für 6 Monate Experimente liefert, abhängig von der Produktivität24. Wichtig ist, dass die Infektiosität für jede neue Sporen-"Menge" bestimmt werden muss, bevor sie für die Experimente ve...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Winnie Zhao und Yin Chen Wan für ihre hilfreichen Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2,0 mm Zirkonoxid-KügelchenBiospec Products Inc.11079124ZX
10 mL SpritzeFisher Scientific1482613
5 μ m FilterMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Zeiss-Fluoreszenzmikroskop zur Darstellung von DY96- und FISH-gefärbten Würmern auf Objektträgern
Axio Zoom V.16 Fluoreszenz-Stereo-Zoom-MikroskopZeiss-ZurLive-Bildgebungvon fluoreszierenden transgenen Tieren zur Visualisierung des IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow CleanBench Baker-
Bead-Disruptor, Genie SI-D238 Analoger Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 VGlobal IndustrialT9FB893150
Cell-VU-Objektträger, Millennium Sciences Einweg-Spermienzahl-ZytometerFisher ScientificDRM600
Direct Yellow 96Sigma-AldrichS472409-1G
EverBrite Eindeckmedium mit DAPIBiotium23001
EverBrite Eindeckmedium ohne DAPIBiotium23002
Fiji/ImageJ SoftwareImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanischer RotorThermo Sceintific415110 / 1834090806873Wird zum Schleudern von Röhrchen mit gebleichten Embryonen für das Schlüpfen über Nacht
MicroB FISH-SondeBiosearch Technologies Inc. verwendet.-Synthetisiert mit einer Quasar 570 (Cy3) 5'-Modifikation und HPLC-gereinigtem, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2Wildtyp, Bristol-StammStandardstammCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-AldrichL3771-100G
Natriumhydroxidlösung (5 N)Fisher ChemicalFLSS256500
Natriumhypochloritlösung (6% )Fisher ChemicalSS290-1
Stemi 508 StereomikroskopZeiss-Fürdie tägliche Wartung von Würmern und die Zählung von L1-Würmern für Assay-Setups
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500

Referenzen

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741(2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011(2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023(2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200(2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458(2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227(2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309(2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425(2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Intergenerationelle ImmunitätNematocida parisiiFluoreszenzmikroskopieDY96-FärbungFluoreszenz-in-situ-HybridisierungParasitenlastWurmfitness
Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.