Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.
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Methodenartikel
Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus
In diesem Artikel
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist eine der zerstörerischsten invasiven Arten weltweit, die das Welken und schließlich das Absterben von Kiefern verursacht. Trotz der Anerkennung ihrer ökonomischen und ökologischen Bedeutung war es bisher unmöglich, die detaillierten Genfunktionen von pflanzenparasitischen Nematoden (PPNs) mit konventioneller Vorwärtsgenetik und transgenen Methoden zu untersuchen. Als umgekehrte genetische Technologie erleichtert die RNA-Interferenz (RNAi) jedoch die Untersuchung der funktionellen Gene von Nematoden, einschließlich B. xylophilus.
Dieser Artikel skizziert ein neues Protokoll für RNAi des ppm-1-Gens in B. xylophilus, von dem berichtet wurde, dass es eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reproduktion anderer pathogener Nematoden spielt. Für RNAi wurde der T7-Promotor durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem 5′-Terminal des Zielfragments verknüpft, und doppelsträngige RNA (dsRNA) wurde durch In-vitro-Transkription synthetisiert. Anschließend wurde die dsRNA-Abgabe erreicht, indem die Nematoden in einer dsRNA-Lösung mit synthetischen Neurostimulanzien eingeweicht wurden. Synchronisierte Jungtiere von B. xylophilus (ca. 20.000 Individuen) wurden gewaschen und im Einweichpuffer für 24 h im Dunkeln bei 25 °C in dsRNA (0,8 μg/ml) eingeweicht.
Die gleiche Menge an Nematoden wurde in einen Einweichpuffer ohne dsRNA als Kontrolle gegeben. In der Zwischenzeit wurde eine weitere identische Menge von Nematoden in einen Einweichpuffer mit dem grün fluoreszierenden Protein (gfp) -Gen dsRNA als Kontrolle gegeben. Nach dem Einweichen wurde das Expressionsniveau der Zieltranskripte mittels quantitativer real-time PCR bestimmt. Die Wirkung von RNAi wurde dann durch mikroskopische Beobachtung der Phänotypen und einen Vergleich der Körpergröße der Erwachsenen unter den Gruppen bestätigt. Das aktuelle Protokoll kann dazu beitragen, die Forschung voranzutreiben, um die Funktionen der Gene von B. xylophilus und anderen parasitären Nematoden besser zu verstehen, um Kontrollstrategien durch Gentechnik zu entwickeln.
Einleitung
Pflanzenparasitäre Nematoden (PPNs) sind eine anhaltende Bedrohung für die Ernährungssicherheit und die Waldökosysteme. Sie verursachen jedes Jahr schätzungsweise 100 Milliarden USD an wirtschaftlichen Verlusten1, von denen die problematischsten vor allem Wurzelknotennematoden, Zystennematoden und Kiefernnematoden sind. Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus, ist ein wandernder, endoparasitischer Fadenwurm, der der ursächliche Erreger der Kiefernwelkeist 2. Es hat den Kiefernwäldern weltweit großen Schaden zugefügt3. Nach der Terminologie von Van Megen et al.4<....
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Protokoll
Die Studie wurde vom Rat für Tierversuche der Zhejiang Agricultural & Forestry University genehmigt. Das B. xylophilus-Isolat NXY61 wurde ursprünglich aus einem erkrankten Pinus massoniana in der Region Ningbo in der Provinz Zhejiang, Chinaextrahiert 11.
1. Klonen von Genen
HINWEIS: Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Grundierungen finden Sie in der Materialtabelle .
- Sammle Nematoden.
- Kultur des B. xylophilus-Stammes auf den Myzelien von Botrytis cinerea auf Kartoffel-Dextrose-Ag....
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Ergebnisse
Analyse der ppm-1-Expression von B. xylophilus nach RNAi
Das relative Expressionsniveau des ppm-1-Gens von B. xylophilus, das mit GFP dsRNA getränkt und mit Zielgen dsRNA getränkt war, betrug 0,92 bzw. 0,52 (das ppm-1-Genexpressionsniveau der ddH2 O-behandelten Kontrollgruppe wurde auf 1 festgelegt) (Abbildung 1). Daher hat exogene dsRNA keinen Einfl.......
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Diskussion
Obwohl sich die Lebensgeschichte und die parasitäre Umgebung von B. xylophilus von denen anderer Nematoden unterscheiden, gibt es nur begrenzte Forschung über die molekulare Pathogenese dieses Pflanzenpathogens. Trotz großer Fortschritte bei der Anwendung der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie bei C. elegans und anderen Nematoden wurde bisher nur die RNAi-Technologie veröffentlicht, die auf B. xylophilus angewendet wurde17. RNAi ist eines der leistungsfähigsten verfüg.......
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Offenlegungen
Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31870637, 31200487) finanziert und gemeinsam durch den Zhejiang Key Research Plan (2019C02024, LGN22C160004) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Baermann-Schornstein | n/a | n/a | um Nematoden zu isolieren |
| Beacon Designer 7.9 | Shanghai Kangyusheng Information Technology Co. | n/a | um qPCR-Primer zu entwerfen |
| Botrytis cinerea | n/a | n/a | als Nahrung für Nematoden |
| Bursaphelenchus xylophilus | n/a | n/a | ihre Nummer war NXY61 und sie wurde ursprünglich aus der Krankheit Pinus massoniana in Ningbo, Provinz Zhejiang, China, gewonnen. |
| Inkubator bei konstanter Temperatur | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co. | H1703544 | um Nematoden zu kultivieren |
| Elektrophoreseapparat | Bio-Rad Labore | 1704466 | zur Erreichung der elektrophoretischen Analyse |
| Ethanol, 75 % | Sinopharm Chemical Reagent Co. | 80176961 | RNA zu extrahieren |
| Ex Taq Polymerase-Vormischung | Takara Bio Inc. | RR030A | für PCR |
| Ex Taq Polymerase-Vormischung | Takara Bio Inc. | RR390A | für PCR |
| Gel-Bildgeber | LongGene Scientific Instruments Co. | LG2020 | um Nukleinsäurebänder sichtbar zu machen |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad-Prisma | n/a | um die Daten zu analysieren und Figuren zu erstellen |
| Hochgeschwindigkeitszentrifuge | Hangzhou Allsheng Instruments Co. | AS0813000 | Zentrifuge |
| Hochfluss-Gewebeschleifer | Bertin | RNA zu extrahieren | |
| ImageJ-Software | Nationale Gesundheitsinstitute | n/a | um die Körperlängen zu messen |
| Isopropylalkohol | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co. | L1909022 | RNA zu extrahieren |
| Leica DM4B-Mikroskop | Leica Microsystems Inc. | Nematoden zu beobachten | |
| Magnetperlen | Aoran Science Technology Co. | 150010C | RNA zu extrahieren |
| MEGAscript T7 Hochleistungs-Transkriptionskit | Thermo Fisher Scientific Inc. | AM1333 | um dsRNA in vitro zu synthetisieren |
| NanoDrop ND-2000 Spektrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | NanoDrop 2000/2000C | um die Qualität der dsRNA zu analysieren |
| PCR-Verstärker | Bio-Rad Life Medical Products Co. | 1851148 | zur Amplifizierung der Nukleinsäuresequenz |
| Petrischalen | n/a | n/a | um Nematoden zu kultivieren |
| pGEM-T Easy-Vektor | Promega Corporation | A1360 | Für das Klonen |
| Kartoffel-Dextrose-Agar (Medium) | n/a | n/a | um Botrytis cinerea |
| Prime Script RT Reagenz-Kit mit gDNA-Radiergummi | Takara Bio Inc. | RR047B | um synthetische cDNA zu synthetisieren |
| Primer Premier 5.0 | PREMIER Biosoft | n/a | um PCR-Primer zu entwerfen |
| Grundbücher:ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-GATGCGAAGTTGCCAATCATTCT -3'; R: 5'- CCAGATCCAGTCCACCATACACC -3 |
| q-ppm-1-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-CATCCGAATGGCAATACAG-3'; R: 5'-ACTATCCTCAGCGTTAGC-3' |
| Echtzeit-Thermalzykler qTOWER 2.2 | Analytique Jena Instruments (Peking) Co. | für qPCR | |
| Zitternder Tisch | Shanghai Zhicheng Analyseinstrumentenherstellung GmbH. | um Nematoden einzuweichen | |
| Stereoskopisches Mikroskop | Chongqing Optec Instrument Co. | 1814120 | Nematoden zu beobachten |
| T7-GFP-F/R | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | F: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAA GGAGAAGAACTTTTCAC-3'; R: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTG TTACAAACTCAAGAAGG-3' |
| T7-Veranstalter | Tsingke Biotechnology Co. | n/a | TAATACGACTCACTATAGGG |
| Takara MiniBEST Agarose Gel DNA-Extraktionsset | Takara Bio Inc. | 9762 | um DNA zu gewinnen |
| TaKaRa TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara Bio Inc. | RR820A | für qPCR |
| Trichlorethan | Shanghai LingFeng Chemical Reagent Co. | RNA zu extrahieren | |
| TRIzol-Reagenz | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15596026 | gesamte RNA-Extraktionsreagenz, um RNA zu extrahieren |
Referenzen
- Nicol, J. M., et al. Current nematode threats to world agriculture. Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions. Jones, J., Gheysen, G., Fenoll, C. , Springer. Dordrecht. 21-43 (2011).
- Jones, J. T., et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology. <....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus
Posted by JoVE Editors on 4/16/2024. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/63645-v
