Method Article

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

DOI:

10.3791/63665

⸱

June 6th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine, 2Department of Physics and Astronomy, University of New Mexico, 3Comprehensive Cancer Center, University of New Mexico Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Phosphorylierung ist eine notwendige posttranslationale Modifikation, die die Proteinfunktion reguliert und die Ergebnisse der Zellsignalisierung steuert. Aktuelle Methoden zur Messung der Proteinphosphorylierung können die Heterogenität der Phosphorylierung über einzelne Proteine hinweg nicht erhalten. Der Einzelmolekül-Pulldown-Assay (SiMPull) wurde entwickelt, um die Zusammensetzung makromolekularer Komplexe durch Immunpräzipitation von Proteinen auf einem Glasdeckglas zu untersuchen, gefolgt von Einzelmolekül-Bildgebung. Die aktuelle Technik ist eine Adaption von SiMPull, die eine robuste Quantifizierung des Phosphorylierungszustands von Membranrezeptoren in voller Länge auf Einzelmolekülebene ermöglicht. Die Abbildung von Tausenden von einzelnen Rezeptoren auf diese Weise ermöglicht die Quantifizierung von Proteinphosphorylierungsmustern. Das vorliegende Protokoll beschreibt das optimierte SiMPull-Verfahren von der Probenvorbereitung bis zur Bildgebung. Die Optimierung von Glaspräparations- und Antikörperfixierungsprotokollen verbessert die Datenqualität weiter. Das aktuelle Protokoll liefert Code für die Einzelmolekül-Datenanalyse, die den Anteil der in einer Probe phosphorylierten Rezeptoren berechnet. Während sich diese Arbeit auf die Phosphorylierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) konzentriert, kann das Protokoll auf andere Membranrezeptoren und zytosolische Signalmoleküle verallgemeinert werden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die membranassoziierte Signalgebung wird durch eine Kombination aus Ligand-induzierter Membranrezeptoraktivierung und Rekrutierung von nachgeschalteten akzessorischen Proteinen, die das Signal verbreiten, abgestimmt. Die Phosphorylierung von Schlüsseltyrosinen in rezeptorzytoplasmatischen Schwänzen ist entscheidend für die Einleitung der Bildung von Signalkomplexen oder Signalosomen 1,2. Daher ist eine wichtige Frage in der Biologie, wie Phosphorylierungsmuster erzeugt und aufrechterhalten werden, um Signalpartner zu rekrutieren und zelluläre Ergebnisse zu diktieren. Dazu gehört das Verständnis der Heterogenit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Deckglas-Vorbereitung

HINWEIS: Für diesen Schritt muss man persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen, die eine doppelte Schicht Nitrilhandschuhe, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz und einen Laborkittel umfasst.

  1. Führen Sie Piranha-Ätzen durch, um organische Ablagerungen aus dem Glas zu entfernen.
    ACHTUNG: Piranha-Lösung ist ein starkes Oxidationsmittel, das bei Kontakt mit organischen Materialien korrosiv und hochreaktiv ist. Die Reaktion mit organischen Ablagerungen ist exotherm und potenziell explosiv. Daher muss das Verfahren in einem chemischen Abzug mit abgesenktem Flügel durchgeführt werden. F....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein Cartoon, der den SiMPull-Prozess darstellt, ist in Abbildung 1A dargestellt. Deckgläser werden mit NeutrAvidin als Anker für biotinylierte Anti-EGFR-Antikörper funktionalisiert, um EGFR-GFP aus dem Gesamtprotein Lysate zu gewinnen. Nach dem Abwaschen von ungebundenem Protein werden die phosphorylierten Rezeptoren mit einem Anti-Phosphotyrosin (Anti-PY)-Antikörper 15 markiert. Abbildung 1B zeigt ein Bild des hydrophoben Arrays, in dem .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um quantitative Messungen der Rezeptorphosphorylierung auf Einzelproteinebene zu ermöglichen. Es wurden mehrere einfache, aber wichtige Modifikationen am SiMPull-Protokoll entwickelt, die die Zuverlässigkeit der Messung für den Phospho-Tyrosin-Nachweis verbesserten, einschließlich der Verringerung der Autofluoreszenz mit NaBH4-Behandlung und Nachfixierung der Probe, um eine Antikörperdissoziation zu verhindern. Die Verwendung der grünen Kanalmaske zur Identifizi.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R35GM126934, R01AI153617 und R01CA248166 zu DSL unterstützt. EMB wurde durch das ASERT-IRACDA-Programm (NIH K12GM088021) und JAR durch das UNM MARC-Programm (NIH 2T34GM008751-20) unterstützt. Wir danken der Verwendung der gemeinsamen Ressource der Fluoreszenzmikroskopie der University of New Mexico Comprehensive Cancer Center, die von NIH P30CA118100 unterstützt wird. Wir möchten Dr. Ankur Jain und Dr. Taekijip Ha würdigen, deren ursprüngliche Entwicklung von SiMPull diese Arbeit inspiriert hat.
ES-C anwesende Adresse: Immunodynamics Group, Laboratory of Integrative Cancer Immunology, Center for Cancer Resear....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenMTC BioC2000
10 mM Tris-HCl pH 7,4
10 mM Tris-HCl pH 8,0/ 50 mM NaClT50 Puffer
100 mm GewebekulturschaleCELLTREAT229620Lagerung von Piranhas geätztem Glas/Arrays
15 mL konisches Röhrchen
16% Paraformaldehyd wässrig LösungElektronenmikroskopie Sciences15710Gefährliches
50 mL konisches RöhrchenFunktionalisierte Glaslagerung / KOH-Wiederverwendung
50 mM Tris-HCl pH 7,2/150 mM NaClLyse Pufferkomponente
60 mm GewebekulturschaleCorning430166
8% Glutaraldehyd wässrige LösungElektronenmikroskopie Sciences16020Gefährliches
Aceton (C3H6O)Millipore Sigma270725Gefährliches
Alexa Fluor 647 NHS EsterThermo Fisher ScientificA-20006
Tierversuchsfreies rekombinantes humanes EGFPeprotechAF-100-15
Anti-Human-EGFR (externe Domäne) – BiotinLeinco Technologies, IncE101
Anti-p-Tyr Antikörper (PY99) Alexa Fluor 647Santa Cruz Biotechnologysc-7020 AF647
Bad-sonicatorBranson1200
BCA Protein Assay KitPierce23227
Biotin-PEGLaysan BioBiotin-PEG-SVA, MW 5.000
RinderserumalbuminGold BiotechnologyA-420-1Tyrode's Buffer Component
Buchner Trichter
Bunsenbrenner
Calciumchlorid (CaCl2)Millipore SigmaC4901Tyrode's Buffer Component
Cell ScraperBioworld30900017-1
Konischer FilterkolbenFisher ScientificS15464
Coplin JarWHEATON900470
Countess II Automatisierter ZellzählerThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Deckgläser 24 x 60 #1,5Elektronenmikroskopie Sciences63793
DipImagehttps://diplib.org/
DMEMCaisson LabsDML19-500
emCCD-KameraAndor iXon
Fötales Rinderserum, OptimaBio-TechneS12450HHitzeinaktiviertes
Fusion 360 SoftwareAutodesk
Geneticin G418 DisulfatCaisson LabsG030-5GM
Eisessig (CH3COOH)JT BakerJTB-9526-01Gefährlich
Serologische Glaspipetten
Glasrührstab
Glukose (D-(+)-Glukose)Millipore SigmaD9434Tyrode-Pufferkomponente
Halt Phosphotase und Proteasehemmer Cocktail (100X)Thermo Fisher Scientific78446Lysepufferkomponente
HEPESMillipore SigmaH3375Tyrode's Pufferkomponente
Salzsäure (HCl)VWRBDH7204-1Gefährliches
Wasserstoffperoxid (H2O2) (3%)HX0645
Wasserstoffperoxid (H2O2) (30%)EMD MilliporeHX0635-2
Ice
IGEPAL CA-630 ( NP-40)Sigma AldrichI8896Lysepufferkomponente
ImmEdge Hydrophober BarrierestiftVector LaboratoriesH-4000
Immersol 518F ImmersionsölZeiss444960-0000-000
hauseigene Vakuumleitung
L-GlutaminThermo Fisher Scientific25030-164
Magnessiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2-6H2O)MPBio2191421Tyrode's Buffer Component
MatlabMathworksCurve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox und Statistics and Machine Learning
Toolbox Methanol (CH3OH)IBIS ScientificMX0486-1Gefährliches
Milli-Q-Wasser
Mix-n-Stain CF Farbstoff-AntikörpermarkierungskitsBiotium92245Empfohlenes Konjugationskit
mPEGLaysan BiomPEG-Succinimidylvalerat, MW 5.000
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilanUCT United ChemicalA0700Hazardous
NanogridMiraloma Tech
NeutrAvidin Biotin Binding ProteinThermo Fisher Scientific31000
Stickstoff (Druckgas)
NVIDIA GPU mit CUDAKompatibilität bei https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html
Olympus iX71 MikroskopOlympus
Parafilm M SiegelfolieDas Labor DepotHS234526C
PBS pH 7,4Caisson LabsPBL06
PC-200 Analoge HeizplatteCorning6795-200
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-163
Phospho-EGF-Rezeptor (Tyr1068) (1H12) Maus mAbZellsignaltechnologie2236BF
Kaliumchlorid (KCl)Millipore Sigma529552Tyrode's Buffer Component
Potassium Hydroxide (KOH)Millipore Sigma1050330500Hazardous
Premium PLA Filament, 1,75 mm DurchmesserRaise 3DPMS:2035U/RAL:3028Drucktemperaturbereich: 205-235 ° C
Pro2 3D-DruckerRaise 3D
Pyrex 1 L Becherglas
PYREX 100 mL VorratsflaschenCorning1395-100CH3OH/C3H6O Wiederverwendung
Pyrex 250 mL Becher
Pyrex 4 L Becher
Quad-view Bild SplitterPhotometrieModell QV2
KühlzentrifugeEppendorfEP-5415R
RevCount Zellzähler, EVE ZellzählobjektträgerVWR10027-446
Semrock Emissionsfilter: blau (445/45 nm), grün (525/45 nm), rot (600/37 nm), dunkelrot (685/40 nm)SemrockLF405/488/561/635-4X4M-B-000
Serologische Pipettiersteuerung
Serologische Pipetten
zerschlagen Einzelmolekül-Analysepakethttps://github.com/LidkeLab/smite.git
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma AldrichS6014Gefährliches
Natriumborhydrid (NaBH4)Millipore Sigma452874Tyrode' s Pufferkomponente
Natriumchlorid (NaCl)Millipore SigmaS9625Durch sukzessive Wärme- und pH-Zyklen aktivieren
NatriumhydroxidVWRBDH3247-1
Natriumorthovanadat (Na3VO4)Millipore SigmaS6508Gefährliche
Schwefelsäure (H2SO4)Millipore Sigma258105Gefährliche
TetraSpeck MikrosphärenThermo Fisher ScientificT7279Multifluoreszenzkügelchen
Tris (Trizma) BaseMillipore SigmaT1503
Trypanblau Färbung, 0,4 %Thermo Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA 0,05 %Thermo Fisher Scientific25300120

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  2. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Pull DownProtein PhosphorylationPhosphorylation QuantificationEGFR PhosphorylationImmunoprecipitation AssayAntibody LabelingGlass PreparationSingle Molecule ImagingColocalization AnalysisGaussian Localization

Related Articles