Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

1.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/63674

⸱

24. Juni 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Charles Perkins Centre, Central Clinical School, Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 3Department of Molecular Physiology and Biological Physics, School of Medicine, University of Virginia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Technik zur intravitalen Bildgebung der Milchdrüse der laktierenden Maus mittels konfokaler Laserscanning- und Multiphotonenmikroskopie.

Zusammenfassung

Die Brustdrüse stellt ein Modell par excellence für die Untersuchung von Epithelfunktionen dar, einschließlich des Gewebeumbaus, der Zellpolarität und der sekretorischen Mechanismen. Während der Schwangerschaft dehnt sich die Drüse von einem primitiven duktalen Baum, der in ein Fettpolster eingebettet ist, zu einem stark verzweigten Alveolarnetzwerk aus, das für die Bildung und Sekretion von Kolostrum und Milch vorbereitet ist. Nach der Geburt liefert die Drüse alle Nährstoffe, die für das Überleben des Neugeborenen erforderlich sind, einschließlich membranbeschichteter Lipidtröpfchen (LDs), Proteine, Kohlenhydrate, Ionen und Wasser. Verschiedene Milchbestandteile, darunter Laktose, Kaseinmizellen und Magermilchproteine, werden in den Alveolarzellen synthetisiert und durch Exozytose an der apikalen Oberfläche aus den Vesikeln sezerniert. LDs werden von den Synthesestellen im rauen endoplasmatischen Retikulum zur Zellspitze transportiert, sind mit Zellmembranen bedeckt und werden durch einen einzigartigen apokrinen Mechanismus sezerniert. Andere vorgeformte Bestandteile, darunter Antikörper und Hormone, werden durch Transzytose von der serosalen Seite des Epithels in die Milch transportiert. Diese Prozesse sind für die Intravitalmikroskopie zugänglich, da die Brustdrüse eine Hautdrüse ist und daher direkt für experimentelle Manipulationen zugänglich ist. In dieser Arbeit wird ein einfaches Verfahren beschrieben, um die Kinetik der LD-Sekretion in situ, in Echtzeit, an lebenden anästhesierten Mäusen zu untersuchen. Bor-Dipyrromethen (BODIPY)665/676 oder Monodansylpentan werden verwendet, um die neutrale Lipidfraktion transgener Mäuse zu markieren, die entweder lösliches EGFP (enhanced green fluoreszierendes Protein) im Zytoplasma exprimieren oder ein membrangesteuertes Peptid, das entweder mit EGFP oder tdTomato fusioniert ist. Die membranmarkierten Fusionsproteine dienen als Marker für Zelloberflächen, und die Lipidfarbstoffe lösen LDs ≥ 0,7 μm auf. Zeitrafferbilder können mit der konfokalen Standard-Laserscanning-Mikroskopie bis zu einer Tiefe von 15-25 μm oder mit der Multiphotonenmikroskopie für die Bildgebung tiefer im Gewebe aufgenommen werden. Die Brustdrüse kann während der gesamten Operation mit pharmakologischen Wirkstoffen oder Fluoreszenzfarbstoffen gebadet werden, um bei Bedarf eine Plattform für akute experimentelle Manipulationen zu bieten.

Einleitung

Die Intravitalmikroskopie der Brustdrüse der Maus erregt zunehmend Aufmerksamkeit als leistungsfähige Methode zur Analyse einer ganzen Reihe biologischer Phänomene, einschließlich der Herkunft und Differenzierung von Stammzellen 1,2, des Fortschreitens metastasierender Tumoren 3,4,5 und der Rolle duktaler Makrophagen während der Brustentwicklung und -involution6. Durch die Entwicklung der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie (ISMic)7 wurden die Untersuchungen auf den Membranverkehr und die sekretorischen Mechanismen während der Laktationausgeweitet 8,9 und die Oxytocin-vermittelte Kontraktion von Myoepithelzellen 9,10. Es wurden zwei Hauptmethoden entwickelt, die sich die Zugänglichkeit der Drüse zwischen Haut und Körperwand zunutze machen.

Beim ersten Ansatz wird ein Acryl- oder Glasfenster in die Haut eingesetzt und mit einem Metallsicherungsring 1,3,11 gesichert. Die Mäuse vertragen die Operation gut, und verschiedene Phänomene können intermittierend über mehrere Wochen am selben Tier analysiert werden. Diese Methode hat sich als besonders nützlich fürdie Abstammungsverfolgung 1,12 und die Überwachung der Invasion und des Fortschreitens von Mammatumoren in situerwiesen 3,11. Eine Auflösung unterhalb der Ganzzellebene erwies sich jedoch als schwierig, da die Drüse noch an der Körperwand befestigt ist und somit Bewegungsartefakten ausgesetzt ist, die durch Atmung und Herzschlag verursacht werden.

Beim zweiten Zugang wird die Drüse chirurgisch auf einem Hautlappen mit intaktem Gefäßsystem freigelegt und auf dem Mikroskoptisch mit Spacern 4,9,13 stabilisiert. Ein Teil der Drüse wird so effektiv von der Bauchdecke getrennt und Bewegungsartefakte werden minimiert. In den meisten Fällen wird das freiliegende Parenchym direkt auf dem Deckglas mit der Bauchseite nach unten auf einem inversen Mikroskop platziert. In einer kürzlichen Modifikation wurde die Maus in Rückenlage auf ein aufrechtes Mikroskop gelegt, und die freiliegende Drüse wurde in einer flüssigkeitsgefüllten Zelle geschützt, die mit einem Deckglas2 verschlossen war. Diese letztere Konfiguration ermöglicht den Zugang zur Parenchymoberfläche für experimentelle Manipulationen während der Bildgebung. Eine Auflösung von bis zu <1 μm ermöglicht in beiden Fällen die Analyse intrazellulärer Prozesse, wie z. B. die Verfolgung von Lipidtröpfchen (LDs) in Brustepithelzellenzeigt 9.

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur intravitalen Bildgebung von Brustepithelzellen auf subzellulärer Ebene am Beispiel der Biogenese, des Transports und der Sekretion von LDs während der Stillzeit. Dieser Ansatz ist auf viele andere Prozesse anwendbar, einschließlich des Transports und der Sekretion von Milchproteinen14, der Transzytose von Proteinen von der erosalen Seite des Epithels zum Alveolallumen15,16 und des Umbaus der Drüse während der Involution 17,18.

Mäuse, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren, werden für die meisten intravitalen Experimente bevorzugt, um die Auswahl geeigneter Bereiche für die Bildgebung zu erleichtern und als morphologischer Referenzmarker. Es steht eine breite Palette geeigneter transgener und knock-in-Mäuse zur Verfügung, die fluoreszierende Proteinmarker in zellulären Kompartimenten, Zytoskelettelementen, Membranen und Organellen exprimieren19. In den gegebenen Beispielen wurde die EGFP-Cyto-FvB-Maus verwendet, bei der ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) auf das Zytoplasma in den meisten Zellen20 gerichtet ist (als EGFP-Zyto bezeichnet), und die C57BL/6J-Tomate (mT/mG) Maus21, bei der es sich um eine doppelt fluoreszierende Cre-Linie handelt, die für tdTomato- und EGFP-Gene kodiert. Die EGFP-Expression wird durch Cre-vermittelte Exzision des tdTomato-Gens ermöglicht. Beide Fluorophore werden in den meisten Zellen durch eine vom MARCKS-Protein abgeleitete Folge auf die Plasmamembrangerichtet 21. In dieser Arbeit werden Mäuse, die das rote tdTomato-Fluorophor exprimieren, als tdTomatomembr (mT) bezeichnet, und Mäuse, die EGFP exprimieren, werden nach Exzision des tdTomato-Gens als EGFPmembr (mG) bezeichnet.

Mäuse haben fünf Paare von Brustdrüsen auf beiden Seiten der ventralen Mittellinie, drei im Brustbereich (mit den Nummern 1-3) und zwei im Leistenbereich (mit den Nummern 4-5) (Abbildung 1A). Für ISMic sind die Leistendrüsen am leichtesten zugänglich und am einfachsten zu stabilisieren, da sie am weitesten von den globalen Bewegungen entfernt sind, die mit der Atmung und dem Herzschlag im Thorax verbunden sind.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Center for Cancer Research, des National Cancer Institute, der National Institutes of Health in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des US National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren, der Richtlinie des US Public Health Service zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren, und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren. Für diese Arbeit wurden die Drüsen Nummer 4 von weiblichen primiperen Mäusen (im Alter von 4-5 Monaten, Tag 10 der Laktation) chirurgisch in der rechten Rückenlage präpariert (Abbildung 1A).

1. Vorbereitung der Tiere

  1. Wiegen Sie die Maus auf einer Topladerwaage, um die erforderliche Anästhesiemenge zu berechnen.
  2. Halten Sie während und nach der Verabreichung von Anästhetika die Körpertemperatur aufrecht, indem Sie die Maus auf ein Wärmekissen legen.
  3. Anästhesieren Sie die Maus durch kurze Exposition gegenüber Isofluran (3,0 %-3,5 %) in einer sauerstoffgesättigten Beatmungskammer (siehe Materialtabelle) für 1-2 Minuten, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin.
  4. Halten Sie die Tiere sowohl während der Operation als auch während der Bildgebung unter einer tiefen Anästhesieebene, indem Sie je nach Bedarf titrierte Dosen von Xylazin und Ketamin (die Hälfte bis ein Viertel der in Schritt 1.3 beschriebenen Anfangsdosis) über einen Verweilkatheter (siehe Schritt 3.4) anwenden.
    HINWEIS: Eine optimale Anästhesieebene lässt sich am einfachsten aufrechterhalten, indem alle 10-20 Minuten auf Lid- und Zehenquetschreflexe überprüft wird. Die Temperatur von bewussten Mäusen liegt bei 36,5-38 °C, die unter Narkose auf 34,5 °C abfällt.
  5. Kreuzpflege der Jungtiere22 , wenn Spendermäuse in einem ähnlichen Laktationsstadium verfügbar sind; Andernfalls euthanasiere den Müll ein.
    HINWEIS: Welpen im Alter von <10 Tagen sollten durch Exposition gegenüber 3,0% Isofluran eingeschläfert werden, gefolgt von einer Enthauptung. Welpen im Alter von ≥10 Tagen sollten durch CO2 -Inhalation eingeschläfert werden, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation.

2. Ablauf der Operation

  1. Halten Sie die Maus während der Operation auf einem Wärmekissen warm. Rasieren Sie das Fell von der Haut, die die Brustdrüsen Nr. 4 und 5 umgibt (Rückenlage, rechte Seite), mit einem Elektrorasierer. Reinigen Sie die rasierte Stelle mit drei abwechselnden Betadin- und Alkoholpeelings.
  2. Wischen Sie alle chirurgischen Instrumente mit 70% Alkohol ab. Machen Sie einen mittleren Schnitt von ~1 cm in der Nähe der vierten Brustwarze, indem Sie die Haut mit einer Pinzette einklemmen und die erhabene Haut mit einer scharfen Schere schneiden. Machen Sie kreisförmige Schnitte um die Drüse sowohl in kranialer als auch in kaudaler Richtung und schälen Sie die Haut vorsichtig vom Bauch ab. Halten Sie die exponierte Haut mit physiologischer Kochsalzlösung feucht.
  3. Um den Blutverlust zu minimieren, verschließen Sie alle hervorstehenden Blutgefäße mit einem Handkauterisierer (siehe Materialtabelle), bevor Sie sie durchschneiden. Jegliches exogene Blut sollte unverzüglich mit physiologischer Kochsalzlösung entfernt werden, um einen späteren Verlust der optischen Auflösung zu vermeiden.
  4. Oberflächliches Binde- und Fettgewebe entfernen, indem die Deckschicht mit einer feinen Pinzette sanft bearbeitet wird.
  5. Halten Sie die freiliegende Drüse mit physiologischer Kochsalzlösung feucht und schützen Sie die Bauchdecke mit Gel und einer halbtransparenten, flexiblen, thermoplastischen Folie (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: In den Schritten 2.2-2.5 wird ein Hautlappen erstellt, bei dem ein Teil der Drüse und des zugehörigen Gefäßsystems von der Bauchdecke getrennt ist (Abbildung 1Bi-iv).
  6. Behandeln Sie die Drüse bei Bedarf mit exogenen Wirkstoffen, z. B. pharmakologischen Wirkstoffen oder organellenspezifischen Farbstoffen, indem Sie die freiliegende Drüse während der Operation baden.
    ANMERKUNG: In den angegebenen Beispielen wurden LDs entweder in einer EGFP-Zyto- oder EGFP-Maus(mG) mit 1,0 ml Bor-Dipyrromethen (BODIPY)665/676 (10 mM Stammlösung in Dimethylsulphoxid, 1- bis 1.000-fach in Kochsalzlösung verdünnt und für <1 h) und in der tdTomatomembr (mT) oder EGFPmembr (mG) Maus markiert. mit 0,5 mL Monodansylpentan23 (0,1 M Stammlösung in Dimethylsulfoxid, 1- bis 1.000-fach in Kochsalzlösung verdünnt und 5 min lang aufgetragen).

3. Vorbereitung der Bildgebung

  1. Positionieren Sie die Maus vorsichtig mit der Bauchseite nach unten auf einem beheizten (37 °C) inversen Mikroskoptisch, so dass der Hautlappen auf das zentrale Deckglas (30 mm) hinausragt (Abbildung 1Biv). Schützen Sie die freiliegenden Stellen mit einer dünnen Schicht Gel.
  2. Stabilisieren Sie den Hautlappen mit maßgefertigten Abstandshaltern, um die Drüse vor Bewegungsartefakten zu schützen, die durch Atmung und Herzschlag verursacht werden. Um dies zu erreichen, platzieren Sie einen gekerbten Abstandshalter aus drei geklebten Wattestäbchen (Abbildung 1Ci) zwischen dem Hautlappen und der Körperwand und kleben Sie das hintere Bein und den Schwanz hinter dem Abstandshalter auf die Bühne (Abbildung 1Bv).
  3. Verhindern Sie, dass der Hautlappen während der Bildgebung verrutscht, indem Sie eine Kunststoffabdeckung (Abbildung 1Cii) an beiden Enden an der Tischöffnung sicher abkleben (Abbildung 1Bv).
  4. Führen Sie einen subkutanen Verweilkatheter unter die Rückenhaut ein, der an einem Schlauch, einer Spritze und einer Pumpe befestigt ist (siehe Materialtabelle).
  5. Bestätigen Sie, dass der Hautlappen bei ausreichender Durchblutung durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie stabil ist (Abbildung 1Bvi).
  6. Decken Sie die Maus mit Schwammgaze ab (siehe Materialtabelle), um sie während der Bildgebung warm zu halten.
    HINWEIS: Die Schritte 3.1 bis 3.5 sind die wichtigsten, um sicherzustellen, dass hochauflösende Videos aufgenommen werden, die für die quantitative Analyse geeignet sind. Es macht keinen Sinn, über dieses Stadium hinauszugehen, solange die Gewebestabilität nicht bestätigt wurde.

4. Mikroskopie

  1. Für die konventionelle konfokale Mikroskopie der EGFPcyto oder EGFPmembr (mG) Maus, die mit BODIPY665/676 markiert wurde (Abbildung 2, Video 1 und Video 2), verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem vorgeheizten 60-fachen Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist, das bei 37 °C gehalten wird (siehe Materialtabelle).
    1. Getrennte Detektion von EGFP und BODIPY665/676 mit den Lasern 488 bzw. 633; für EGFP, Anregung 488 nm und Emission 560 nm, mit Bandpassfilter BA 505-605; für BODIPY665/676, Anregung 633 nm und Emission 668 nm, mit Bandpassfilter BA 655-755.
    2. Erfassen Sie Bilder per Zeilenscan mit 4 oder 8 μs/Pixel (512 x 512 Pixel; 12 Bit pro Pixel) alle 5 s oder 10 s für 1-2 h und speichern Sie sie als TIFF-Dateien. Behalten Sie die gescannten Bereiche manuell im Bild bei, indem Sie die X/Y-Drift während des gesamten Bildgebungszyklus korrigieren. Erstellen Sie 3D-Bilder aus Z-Scans mit der Software, die mit dem Mikroskop verbunden ist (siehe Materialtabelle).
  2. Für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der EGFPmembr (mG) Maus, die mit Monodansylpentan markiert ist (Abbildung 3, Video 3), verwenden Sie ein inverses Mikroskop, das mit einem abstimmbaren Laser und einem 37 °C vorgeheizten 30-fach-Objektiv ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
    1. Stimulieren Sie die Drüse bei 910 nm und detektieren Sie Monodansylpentan und EGFP mit zwei GaAs-Detektoren, wobei 410-460 nm und 495-540 nm Bandpassfilter für blaue bzw. grüne Emissionen verwendet werden.
    2. Erfassen Sie Bilder per Zeilenscan bei 2 μs/Pixel (320 x 320 Pixel; 16 Bit pro Pixel) und speichern Sie sie als OIR-Dateien. Behalten Sie die gescannten Bereiche manuell im Bild bei, indem Sie die X/Y-Drift während des gesamten Bildgebungszyklus korrigieren. Erstellen Sie 3D-Bilder aus Z-Scans mit der Software, die mit dem Mikroskop verknüpft ist.
  3. Für die Zwei-Photonen-Mikroskopie der mit Monodansylpentan markierten tdTomatomembr (mT)-Maus (Abbildung 4, Video 4) verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit durchstimmbaren Lasern und ein bei 37 °C vorgeheiztes 63-fach-Objektiv (siehe Materialtabelle).
    1. Stimulieren Sie Proben bei 800 nm und 1.060 nm gleichzeitig und detektieren Sie Monodansylpentan mit einem HyD-Hybriddetektor bei einer Emission von 418-471 nm und TdTomato mit einem weiteren HyD-Hybriddetektor bei einer Emission von 595-667 nm.
    2. Sammeln Sie die Bilder per Zeilenscan mit vier Zeilen mit einer Mittelung von 200 Hz (512 x 512 Pixel; 12 Bit pro Pixel) und speichern Sie sie als LIF-Dateien. Behalten Sie die gescannten Bereiche manuell im Bild bei, indem Sie die X/Y-Drift während des gesamten Bildgebungszyklus korrigieren. Erstellen Sie 3D-Bilder aus z-Scans mit der Software, die mit dem Mikroskop verknüpft ist.

5. Euthanasie

  1. Die Mäuse werden am Ende der Bildgebung durch CO2 -Inhalation nach institutionell anerkannten Protokollen eingeschläfert.

6. Erstellung von Echtzeit-Videos

  1. Konvertieren Sie Zeitsequenzen in TIFF-Dateien und dann mit geeigneter Software in Videos (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die quantitative Analyse bestimmter Videos würde den Rahmen dieses Artikels sprengen und erfordert spezifische Methoden zur Lösung spezifischer Probleme. Siehe z.B. Ebrahim et al.24 für die Rolle von Actinomyosin-Komplexen bei der Exozytose von Speichel aus der Speicheldrüse, Meyer et al.25 für die Dynamik der Gallensekretion aus der Leber und Masedunskas et al.9 für die Analyse der LD-Sekretion aus Brustepithelzellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Milch wird aus polarisierten Alveolarepithelzellen sezerniert, die sich während der Schwangerschaft von den Knospen eines ausgedehnten duktulären Baumes differenzieren26 (Abbildung 2A). Vorläufer für die Milchsynthese werden über basale/laterale Membranen assimiliert und fertige Produkte werden über die apikale Oberfläche in einen zentralen "Milchraum" sezerniert. Die basale Seite jeder Alveole ist von einer sternförmigen Anordnung von Myoepithelzellen bedeckt (

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Ob ein Ein- oder Multiphotonenmikroskop verwendet werden soll, hängt von den gestellten Fragen, der Art und Lage des abzubildenden Gewebes und der erforderlichen Auflösung ab. Multiphotonenmikroskope basieren auf der Erzeugung von zwei oder mehr niederenergetischen Photonen im nahen Infrarot, die Gewebe mit geringerer Phototoxizität in größerer Tiefe durchdringen können als Ein-Photonen-Mikroskope29,30. Außerdem wird das Fluoroph...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Keiner der Autoren hat widersprüchliche Interessen geltend zu machen.

Danksagungen

Die Autoren danken Sherry Rausch und Samri Gebre (National Cancer Institute, NIH) für das Tiermanagement und die Pflege sowie James Mather für die Hilfe bei der Herstellung einer Reihe von Abstandshaltern aus Kunststoff. Diese Forschung wurde [teilweise] durch das Intramural Research Program des NIH unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
488 LaserMelles-Griot-CW  Laser 50 mW
60x PLAPON Öl-Immersionsobjektiv (NA 1.42)Olympus1-U2B933Objektiv Konfokales Mikroskop
633 LaserMelles-Griot-CWHe-Ne Laser 12 mW
63x Objektiv (NA 1.40, HC PL APO CS2)Leica11506350Objektiv Zwei-Photonen-Mikroskop
BA 410-460 nmChroma-Bandpassfilter
BA 495-540 nmChroma-Bandpassfilter
BA 505-605 nmChroma-Bandpassfilter
BA 655-755 nmChroma-Bandpassfilter
Bordipyrromethan (BODIPY) 665/676Thermo Fisher ScientificB3932Lipidperoxiationssensor
Carbomer-940Snowdrift Farm739601480651
GelkatheterTerumoSV27ELGeflügelte Infusionssets 
Kauterisierer Braintree Scientific, IncGEM 5917Kautersystem
CMV-Cre Maus Jackson Labor006054Maus Linie
DeckglasBioptechs-30mmDurchmesser Decklippe für inverses Mikroskop
Curity 4x4 Zoll Allzweck SchwammGaze Covidien9024Schwamm
EGFPcyto MausJackson Labor003291Mauslinie
Fiji/ImageJ SoftwareOpenSource-FreiesSoftware-Tool
Feine PinzetteBraintree Scientific, IncFC003 8Gewebezange
Fluoview 1000 MikroskopOlympusFV1000Konfokales
Mikroskop FluoView SoftwareMikroskop und Zwei-Photonen-Mikroskop
Handheld ElektrorasiererBraintree Scientific, IncCLP-8786-451AAkku-Clipper
WärmekissenBraintree Scientific, IncDPIPHeizkissen für Tiere
HyD-DetektorenLeica-Leica4Tune Spektraldetektor
Imaris SoftwareBitplane / Oxford Instrumente-KommerziellesSoftware-Tool
Ingisht X3 abstimmbarer LaserSpectra PhysicsInsight X3abstimmbarer Puls-Laser
IsofluranVetOne13985-046-40Anästhetikum
Ketamin VetOne13985-702-10Anästhetikum
LAS X SoftwareSoftware-Tool
Mai-Tai abstimmbarer LaserSpectra PhysicsMai-TaiLaser
MetaMorphMolecularDevices-KommerziellesSoftware-Tool
Monodansylpentan AUTODOTAbceptaSm1000aLipid-Tröpfchen-Farbstoff
MPE-RS MikroskopOlympusIX70Zwei-Photonen-Mikroskop
mT/mG MausJackson Labor007676Mauslinie
ObjektivheizungBioptechs150819Objektivheizung für konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskope
Sauerstoffgesättigte AtemkammerPatterson Scientific78933385, SAS3 und EVAC4Gasanästhesie- und Evakuierungssystem 
ParafilmHeathrow ScientificHS234526BHalbtransparenter, flexibler, thermoplastischer
Folien-PMT-Detektor    Detektoren
PMT-DetektorLSM-TechnologieSonderanfertigungenNon-Descan-Detektoren
PumpeHarvard Apparat703602, 704402Nanomit-Injektor und -Controller
KochsalzqualitätBiologisch114-055-721EANormale Kochsalzlösung
Scharfe Schere mit stumpfem EndeBraintree Scientific, IncSCT-S 508Chirurgische Schere
SpritzeCovidien22-257-1501mL Tuberkulinspritze
TCS SP8 TauchspektralmikroskopLeicaSP8Zwei-Photonenmikroskop
Pinzette Braintree Scientific, IncFC032Gewebezange
Xylazin  VetOne13985-704-10Anästhetikum
Olympus-Konfokales Leica-Zwei-Photonen-Mikroskop Olympus-Descanned

Referenzen

  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis. Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).
  2. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  3. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  4. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Dawson, C. A., et al. Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling. Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).
  7. Ebrahim, S., Weigert, R. Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms. Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).
  8. Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. Advances in Intravital Microscopy. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).
  9. Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).
  10. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  11. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).
  12. Zomer, A., et al. Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).
  13. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  14. Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. Secretion of milk proteins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).
  15. Monks, J., Neville, M. C. Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland. Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).
  16. Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells. Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).
  17. Green, K. A., Lund, L. R. ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland. Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).
  18. Lund, L. R., et al. Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways. Development. 122 (1), 181-193 (1996).
  19. Abe, T., Fujimori, T. Reporter mouse lines for fluorescence imaging. Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).
  20. Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).
  21. Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  22. Fostering litters. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips# (2022).
  23. Yang, H. -J., Hsu, C. -L., Yang, J. -Y., Yang, W. -Y. Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging. PloS One. 7 (3), 32693(2012).
  24. Ebrahim, S., et al. Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice. Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).
  25. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).
  26. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  27. Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion. Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).
  28. Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. Enhanced diffusion in active intracellular transport. Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).
  29. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  30. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time. Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).
  31. So, P. T. C. Two-photon fluorescence light microscopy. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).
  32. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).
  33. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  34. Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig. Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).
  35. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  36. Palade, G. Intracellular aspects of the process of protein synthesis. Science. 189 (4200), 347-358 (1975).
  37. Heald, C. W., Saacke, R. G. Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro. Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).
  38. Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. Epithelial transcytosis of immunoglobulins. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).
  39. Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
  40. Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat. Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).
  41. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Weitere Artikel entdecken

Intravitalmikroskopiesubzelluläre BildgebungLipidtröpfchensekretionKonfokalmikroskopieZwei-Photonen-Mikroskopiesekretorische EpithelzellenEGFP-Mäuseapokrine SekretionZeitraffer-Bildgebung
Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.