Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gehirn-Clearing mit der CLARITY-Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung einer großen Anzahl von Neuronen und Astrozyten.
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Methodenartikel
Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Kombination von viraler Vektortransduktion und Gewebereinigung mit der CLARITY-Methode ermöglicht es, mehrere Arten von Gehirnzellen und deren Wechselwirkungen gleichzeitig zu untersuchen. Die virale Vektortransduktion ermöglicht die Markierung verschiedener Zelltypen in verschiedenen Fluoreszenzfarben innerhalb desselben Gewebes. Zellen können genetisch durch Aktivität oder Projektion identifiziert werden. Unter Verwendung eines modifizierten CLARITY-Protokolls ist die potenzielle Stichprobengröße von Astrozyten und Neuronen um 2-3 Größenordnungen gewachsen. Der Einsatz von CLARITY ermöglicht die Abbildung kompletter Astrozyten, die zu groß sind, um in ihrer Gesamtheit in Scheiben zu passen, und die Untersuchung der Somata mit all ihren Prozessen. Darüber hinaus bietet es die Möglichkeit, die räumliche Interaktion zwischen Astrozyten und verschiedenen neuronalen Zelltypen zu untersuchen, nämlich die Anzahl der pyramidenförmigen Neuronen in jeder astrozytischen Domäne oder die Nähe zwischen Astrozyten und spezifischen inhibitorischen Neuronenpopulationen. In diesem Beitrag wird ausführlich beschrieben, wie diese Methoden anzuwenden sind.
Einleitung
In den letzten Jahren hat das Wissen über die Funktion von Astrozyten und wie sie mit neuronalen Schaltkreisen interagieren, dramatisch zugenommen. Astrozyten können die Plastizität beeinflussen 1,2, die neuronale Erholung nach einer Verletzungunterstützen 3,4 und sogar eine de novo neuronale Potenzierung induzieren, wobei neuere Studien die Bedeutung von Astrozyten für den Gedächtniserwerb und die Belohnung zeigen, die bisher als rein neuronale Funktionen angesehen wurden 5,6,7
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Protokoll
Die Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der Hebrew University genehmigt und entsprachen den Richtlinien des National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virale Vektortransduktion
HINWEIS: Virale Vektortransduktion wird verwendet, um Fluorophore im Gehirn zu exprimieren.
- Verwenden Sie einen Atlas (z. B. Allen Brain Atlas), um die relevante Koordination des Zielbereichs zu lokalisieren.
HINWEIS: 3D-Atlanten können online gefunden werden (z. B. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Injizieren Sie mittels ster....
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Ergebnisse
Die erfolgreiche Beseitigung dicker Hirngewebeschnitte führt zu einer neuen Reihe von Fragen, die in Bezug auf die Eigenschaften von großzelligen Populationen im Gegensatz zu den Eigenschaften einzelner Zellen oder benachbarter Zellgruppen gestellt werden können. Um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen, sollte man sich strikt an das CLARITY-Protokoll halten, da es eine Vielzahl von Parametern gibt, die berücksichtigt werden müssen, um die Varianz zwischen den Proben zu reduzieren (z. B. Prozentsatz der Klarheit, Fluoresze.......
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Diskussion
Gewebe-Clearing-Methoden stellen ein revolutionäres Werkzeug in der Hirnforschung dar und laden zu Fragen ein, die bisher nicht hätten gestellt werden können. CLARITY zielt nicht mehr auf die Eigenschaften einer kleinen Gruppe von Zellen, einer einzelnen Zelle oder sogar einer einzelnen Synapse ab und ermöglicht nun das Targeting von Gesamtzellpopulationen oder langreichweitigen Konnektivitätsmerkmalen durch die Verwendung relevanter Fluorophore.
Das Ergebnis der Kombination aus Fluorophorexpr.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement No 803589), der Israel Science Foundation (ISF-Grant Nr. 1815/18) und der Canada-Israel Grants (CIHR-ISF, Grant No. 2591/18) gefördert. Wir danken Nechama Novick für den Kommentar zum gesamten Manuskript.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraler Vektor zum Nachweis von Astrozyten | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraler Vektor zum Nachweis von Neuronen | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viraler Vektor zum Nachweis von Neuronalkernen | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | Viraler Vektor zum Nachweis von Neuronen | |
| Acrylamid (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamid (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Borsäure | Sigma | #B7901 | Molekulargewicht - 61,83 g/mol |
| Konfokales Mikroskop, Scanning, FV1000 | Olympus | 4x Objektiv (UPlanSApo, 0,16 NA) | |
| Imaris Software | Bitplane, UK | Eine Software, die die 3D-Analyse von Bildern ermöglicht | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin Labor | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin Labor | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass-Software | Eine Software, die die 3D-Analyse von Bildern mithilfe von Virtual Reality ermöglicht | ||
| Tris-Basis 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molekulargewicht - 121,14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Zwei-Photonen-Mikroskop | Neurolabware | Ti:Saphir-Laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP-Photomultiplier-Röhren (Hamamatsu, H10770-40), Bandpassfilter (Semrock), 16x Wasserimmersionsobjektiv (Nikon, 0,8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Referenzen
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 sur....
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Nachdrucke und Genehmigungen
