Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

Shalini Soni; Shubhra Agarwal; Rakesh Aggarwal; Naga Suresh Veerapu

doi:10.3791/63685

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Methodenartikel

Reverse Genetik zur Entwicklung von RNA-Virusvarianten mit positivem Sinn

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DOI:

10.3791/63685

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9. Juni 2022

Shalini Soni¹ , Shubhra Agarwal¹ , Rakesh Aggarwal² , Naga Suresh Veerapu¹

¹Virology Section, Department of Life Sciences, Shiv Nadar University, ²Gastroenterology, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Einführung einer kontrollierbaren genetischen Vielfalt in das Genom des Hepatitis-C-Virus durch die Kombination von mutierter RNA-Synthese in voller Länge mit fehleranfälliger PCR und umgekehrter Genetik. Die Methode stellt ein Modell für die Phänotypauswahl dar und kann für 10 kb lange RNA-Virusgenome verwendet werden.

Zusammenfassung

Das Fehlen einer geeigneten Methode für die iterative Generierung verschiedener Virusvarianten in voller Länge hat die Untersuchung der gerichteten Evolution in RNA-Viren behindert. Durch die Integration einer fehleranfälligen PCR mit vollständigem RNA-Genom und umgekehrter Genetik kann eine zufällige genomweite Substitutionsmutagenese induziert werden. Wir haben eine Methode entwickelt, die diese Technik verwendet, um verschiedene Bibliotheken zu synthetisieren, um virale Mutanten mit Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Diese Methode, die als Full-Length-Mutanten-RNA-Synthese (FL-MRS) bezeichnet wird, bietet die folgenden Vorteile: (i) die Möglichkeit, eine große Bibliothek über eine hocheffiziente, fehleranfällige PCR in einem Schritt zu erstellen; (ii) die Fähigkeit, Gruppen von Bibliotheken mit unterschiedlichem Grad an genetischer Vielfalt zu erstellen, indem die Genauigkeit der DNA-Polymerase manipuliert wird; iii) die Herstellung eines PCR-Produkts in voller Länge, das direkt als Vorlage für die Synthese mutierter RNA dienen kann; und (iv) die Fähigkeit, RNA zu erzeugen, die als nicht selektierter Input-Pool in Wirtszellen eingebracht werden kann, um nach viralen Mutanten des gewünschten Phänotyps zu suchen. Mit Hilfe eines reversen genetischen Ansatzes haben wir herausgefunden, dass FL-MRS ein zuverlässiges Werkzeug ist, um die virale Evolution in allen Stadien des Lebenszyklus des Hepatitis-C-Virus, JFH1-Isolat, zu untersuchen. Diese Technik scheint ein unschätzbares Werkzeug zu sein, um die gerichtete Evolution einzusetzen, um die Anpassung, Replikation und die Rolle viraler Gene in der Pathogenese und antiviralen Resistenz in RNA-Viren mit positivem Sinn zu verstehen.

Einleitung

Das vorausschauende genetische Screening beginnt mit einem viralen Phänotyp von Interesse und versucht dann, durch Sequenzierung seines Genoms und Vergleich mit dem des ursprünglichen Stammes, die Mutation(en) zu identifizieren, die diesen Phänotyp verursachen. Im Gegensatz dazu werden bei umgekehrten genetischen Screenings zufällige Mutationen in ein Zielgen eingeführt, gefolgt von einer Untersuchung des resultierenden Phänotyps/der resultierenden Phänotypen1. Für den Ansatz der umgekehrten Genetik ist die In-vitro-Mutagenese die am weitesten verbreitete Technik, um einen Pool von Varianten zu erstellen, die anschließend auf interessa....