Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Summary

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Abstract

Mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven begleitet mehrere Krankheiten, die mit peripherer Neuropathie verbunden sind, die durch mehrere Ursachen ausgelöst werden können, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen, Erbkrankheiten und Tumoren. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven der Maus kann aufgrund der geringen Probengröße, einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien im Gewebe und des Vorhandenseins einer Myelinscheide eine Herausforderung darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik minimiert diese Herausforderungen, indem sie ein einzigartiges Permeabilisierungsprotokoll verwendet, das an das für Muskelfasern verwendete Protokoll angepasst ist, um die mitochondriale Funktion des Ischiasnervs zu beurteilen, anstatt die Mitochondrien vom Gewebe zu isolieren. Durch die Messung der fluorimetrischen reaktiven Speziesproduktion mit Amplex Red/Peroxidase und den Vergleich verschiedener mitochondrialer Substrate und Inhibitoren in saponin-permeabilisierten Nerven war es möglich, mitochondriale Atmungszustände, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivität von mitochondrialen Komplexen gleichzeitig nachzuweisen. Daher bietet die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der Beurteilung der mitochondrialen Funktion durch andere Techniken.

Introduction

Mitochondrien sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und erfüllen zahlreiche Zellfunktionen wie den Energiestoffwechsel (Glukose-, Aminosäure-, Lipid- und Nukleotidstoffwechselwege). Als primärer Ort der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind Mitochondrien in mehreren Zellsignalprozessen wie Apoptose von zentraler Bedeutung und beteiligen sich an der Synthese von Eisen-Schwefel (Fe-S) -Clustern, dem Import und der Reifung von mitochondrialen Proteinen sowie der Aufrechterhaltung ihres Genoms und ihrer Ribosomen ^1,2,3. Das mitochondriale Membrandynamiknetzwerk wird durch Fusions- und Spaltungsprozesse gesteuert, und sie verfügen auch über Maschinen zur Qualitätskontrolle und Mitophagie ^4,5,6.

Mitochondriale Dysfunktion ist mit dem Auftreten mehrerer pathologischer Zustände wie Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit verbunden⁷. Störungen der mitochondrialen Funktion werden bei neurodegenerativen Erkrankungen festgestellt, die das zentrale Nervensystem betreffen, wie bei der Alzheimer-Krankheit ^8,9, der Parkinson-Krankheit 10,11, der amyotrophen Lateralsklerose 12,13 und der Huntington-Krankheit ^14,15 . Im peripheren Nervensystem wird ein Verlust der mitochondrialen Funktion in Axonen bei Immunneuropathien wie dem Guillain-Barré-Syndrom 16,17 beobachtet^, und in Verbindung mit einer hohen mitochondrialen ROS-Produktion in Axonen führen diese Ereignisse zu einer MAP-Kinase-Aktivierung in Schwann-Zellen¹⁸. Dies zeigt, dass die mitochondriale Physiologie nicht nur für eine ortsspezifische Zelle, sondern für ein ganzes Gewebe unerlässlich sein kann. Bei der HIV-assoziierten distalen sensorischen Polyneuropathie (HIV-DSP) spielen Mitochondrien eine Rolle in dem Mechanismus, durch den das HIV-TAT-Protein (Transaktivator of Transkription) es HIV ermöglicht, sich effizient zu replizieren, sowie mehrere andere Rollen bei der HIV-Infektionspathogenese^{19, 20}.

Die Beurteilung der mitochondrialen Physiologie des Ischiasnervs hat sich als wesentliches Ziel für die Untersuchung der Neuropathie^{herausgestellt} 7,21,22. Bei der diabetischen Neuropathie deuten proteomische und metabolomische Analysen darauf hin, dass die meisten molekularen Veränderungen bei Diabetes die mitochondriale oxidative Phosphorylierung des Ischiasnervs und den Fettstoffwechsel^{beeinflussen 7}. Diese Veränderungen scheinen auch frühe Anzeichen für einen durch Fettleibigkeit verursachten Diabetes^{zu sein 21}. In einem Mausmodell der chemotherapieinduzierten schmerzhaften Neuropathie wird eine mitochondriale Beeinträchtigung des Ischiasnervs als Abnahme der oxidativen Phosphorylierung²² und eine Verringerung der Aktivitäten der mitochondrialen Komplexe, des Membranpotentials und des ATP-Gehalts²³ nachgewiesen. Obwohl mehrere Gruppen mitochondriale Dysfunktion bei Neuropathien zitiert haben, beschränken sich diese Studien auf die Messungen der Aktivität in mitochondrialen Komplexen ohne Erhaltung der mitochondrialen Membranen, fehlende Bewertung der mitochondrialen Integrität oder Messungen des ATP-Gehalts als Parameter für die mitochondriale ATP-Produktion. Im Allgemeinen erfordert eine ordnungsgemäße Beurteilung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion die Isolierung von Mitochondrien durch differentielle Zentrifugation in einem Percoll/Saccharose-Gradienten. Die Isolierung von Mitochondrien kann aufgrund der großen Menge an benötigtem Gewebe und des Verlusts und der Störung der Mitochondrien auch ein limitierender Faktor für Ischiasnervengewebe sein.

Die vorliegende Studie zielt darauf ab, ein Protokoll zur Messung der mitochondrialen Physiologie wie des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion im Ischiasnerv bereitzustellen, wobei die mitochondrialen Membranen erhalten bleiben und keine Mitochondrien isoliert werden müssen. Dieses Protokoll wird aus Sauerstoffverbrauchsmessungen in permeabilisierten Muskelfasern²⁴ durch hochauflösende Respirometrie (HRR) angepasst. Die Vorteile dieses Verfahrens sind die Möglichkeit, Mitochondrien in kleinen Gewebemengen wie dem Ischiasnerv zu bewerten und mitochondriale Parameter in situ zu bewerten, wodurch die mitochondriale Umgebung, Struktur und das bioenergetische Profil erhalten bleiben, um ein physiologisch vertrauenswürdiges Ergebnis zu erhalten. Die mitochondrialen Atmungszustände wurden mit Substraten und Inhibitoren nach der Permeabilisierung des Ischiasnervs bestimmt, um die mitochondriale Bioenergetik und den Cytochrom-c-Koeffizienten für die Integrität der mitochondrialen Membran richtig zu beurteilen und einen Leitfaden für Schritte der Bewertung des mitochondrialen Elektronentransportsystems (ETS) und der Berechnung wesentlicher Parameter zu geben. Diese Studie kann Werkzeuge zur Beantwortung von Fragen in pathophysiologischen Mechanismen liefern, an denen der Ischiasnervenstoffwechsel beteiligt ist, wie z.B. periphere Neuropathien.

Protocol

Das vorliegende Protokoll wird von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) und den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt. Der Ischiasnerv wird aus vier Monate alten männlichen C57BL / 6-Mäusen isoliert, die gemäß den institutionellen Richtlinien durch Zervixdislokation eingeschläfert werden. Die Protokollschritte sind optimiert, um eine Verschlechterung der Mitochondrien zu vermeiden. Daher wurde in diesem Protokoll die Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren vor der Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervengewebes der Maus durchgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien

1. Bereiten Sie den Gewebekonservierungspuffer (TP-Puffer) vor.
   1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien in Reinstwasserlösung vor: 10 mM Ca-EGTA-Puffer mit 0,1 μM freiem Kalzium, 20 mM Imidazol, 20 mM Taurin, 50 mM K-MES, 0,5 mM DTT, 6,56 mM MgCl₂, 5,77 mM ATP, 15 mM Phosphokreatin (siehe Materialtabelle), pH 7,1. Bei -20°C lagern.
2. Bereiten Sie den Mitochondrien-Atmungspuffer (MR-Puffer) vor.
   1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien in Reinstwasserlösung vor: 0,5 mM_K2EGTA, 3 mM MgCl 2, 60 mM MES, 20 mM Taurin, 10 mM KH₂ PO 4, 20 mM HEPES, 110 mM D-Saccharose, 1 mg/ml BSA (fettsäurefrei) (siehe Materialtabelle), pH_7,4. Bei -20 °C lagern.
3. Bereiten Sie die Sapolin-Stammlösung vor, indem Sie 5 mg Saponin (siehe Materialtabelle) in 1 ml TP-Puffer (Schritt 1.1) auflösen und auf Eis halten. Saponin wird frisch zubereitet.
4. Bereiten Sie Amplex Red vor, indem Sie das Pulver (siehe Materialtabelle) mit DMSO resuspendieren, um eine Lagerkonzentration von 2 mM zu erhalten, und lagern Sie es bei -20 °C in einer vor Licht geschützten Durchstechflasche.
   HINWEIS: Um zu vermeiden, dass die Sonde durch Einfrieren und Auftauen abgenutzt wird, machen Sie kleine Aliquots für die Lagerung nicht länger als 6 Monate²⁵.

2. Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren für die hochauflösende Respirometrie (HRR)

1. Reinigen Sie die HRR-Kammern des Instruments und der Spritzen (siehe Materialtabelle).
   1. HRR-Kammern öffnen, mit destilliertem Wasser bis zur Oberseite füllen und 5 min 3x umrühren. Wiederholen Sie mit Ethanol und dann noch einmal mit Wasser. Waschstopfen und Spritzen mit Wasser/Ethanol/Wasser je 3x.
2. Wenden Sie die folgenden Kalibrierungseinstellungen in der HRR-Software an (siehe Materialverzeichnis).
   1. Addieren Sie in der HRR-Softwaresteuerung die experimentelle Temperatur (37 °C), die Parameter für den Sauerstoffsensor (Verstärkung, 2; Polarisationsspannung, 800 mV) und für den amperometrischen Sensor (Verstärkung, 1000; Polarisationsspannung, 100 mV).
3. Kalibrieren Sie die Sauerstoffsensoren.
   1. Pipette 2,1 ml MR-Puffer (Schritt 1.2) in jede Kammer. Schließen Sie mit den Stoppern und saugen Sie Luft in die Kammer, bis sich eine Blase bildet. Im Kalibriermodus 1 h bei 37 °C umrühren, bis der Sauerstofffluss pro Masse stabil ist.
   2. Führen Sie eine Luftkalibrierung der polarographischen Sauerstoffsensoren in der Software gemäß dem Protokoll²⁴ des Herstellers durch.
      HINWEIS: Der Kalibrierungsschritt wird vor einem Experiment nur einmal durchgeführt. Zusätzliche Experimente in gleichem Atmungsmedium und gleicher Temperatur können nach dem bloßen Waschen von Kammern durchgeführt werden (Schritt 2.1).

3. Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervs

1. Entfernen Sie den Ischiasnerv mit den folgenden Schritten.
   1. Euthanasieren Sie das Tier durch Zervixdislokation, nachdem Sie es aus seinem Käfig entfernt und sanft auf der Bank ruhen lassen.
   2. Machen Sie bei dem eingeschläferten Tier einen Schnitt mit einer Schere im unteren Rückenbereich, beginnend in der Nähe der Wirbelsäule und den Oberschenkel hinunter zum Fuß. Entfernen Sie Haut und Muskeln, die am Nerv befestigt sind, und schneiden und entfernen Sie dann den gesamten Ischiasnerv.
   3. Wiegen Sie das Gewebe sofort und legen Sie es in eine Durchstechflasche, die mit kaltem TB-Puffer (4 °C) gefüllt ist. Führen Sie die Schritte 3.2-3.3 auf dem Eis aus.
      HINWEIS: Das Nassgewebegewicht wird verwendet, um den Sauerstoffverbrauch und den ROS-Produktionsfluss in den folgenden Schritten zu normalisieren. Wenn das Gewebe nicht sofort gewogen werden kann, bewahren Sie es in einem kalten TB-Puffer auf. Das Verfahren wird in frischem Gewebe durchgeführt und darf nicht eingefroren werden, um mitochondriale Schäden zu vermeiden.
2. Für die Gewebepräparation legen Sie den Ischiasnerv in eine Petrischale mit genügend TP-Puffer, um ihn zu bedecken. Halten Sie ein Ende des Nervs mit einer Pinzette und ziehen Sie mit einer anderen Pinzette die Nervenbündel horizontal heraus.
   HINWEIS: Dieses Verfahren muss in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, um eine Verschlechterung des Gewebes zu vermeiden. Das Gewebe ist bereit, wenn es als transparente neblige Schichten gegenüber dem vorherigen weißen undurchsichtigen Gewebe sichtbar gemacht werden kann (Abbildung 1).
3. Übertragen Sie zuerst das gespreizte Gewebe in eine kleine Schale, die 1 ml TP-Puffer für die Gewebepermeabilisierung enthält. Um mit der Permeabilisierung zu beginnen, wird das Gewebe mit einer Pinzette in eine Schale überführt, die 1 ml TP-Puffer und 10 μL Saponin enthält (aus Stammlösung, Schritt 1.3).
   1. In einem Mikroplatten-Shaker vorsichtig für 30 min schütteln, dann das Gewebe mit einer Pinzette in eine frische Schale mit MR-Puffer (1 ml) geben und vorsichtig für 10 min schütteln. Überführen Sie das Gewebe mit einer Pinzette in eine kalibrierte HRR-Kammer.

4. Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs und der ROS-Produktion

1. Füllen Sie die HRR-Kammern mit 2,1 ml MR-Puffer, fügen Sie Amplex Red (Schritt 1.4) zu einer Endkonzentration von 5 μM und Peroxidase zu 2 E/ml hinzu und fügen Sie den permeabilisierten Ischiasnerv hinzu (Schritt 3).
   1. Schließen Sie die Fluoreszenzsensoren des Instruments an, schalten Sie die Lichter im Steuerungsbereich der Software aus und drücken Sie Mit Oxygraph verbinden. Geben Sie unter "Protokolle bearbeiten" in der Software das in Schritt 3.1.3 gemessene Gewebegewicht ein.
2. Gehen Sie zu "Layout", wählen Sie die Option "Spezifischer Fluss pro Probeneinheit" und wählen Sie Plots aus, um gleichzeitig auf die Sauerstoffverbrauchsanzeige und, falls gewünscht, auf die_{H2O2-Produktion}zuzugreifen_. Warten Sie ~ 10 min.
   HINWEIS: Diese Zeit ist erforderlich, um den basalen Fluss des Sauerstoffverbrauchs ohne zusätzliches Substrat (basal) zu stabilisieren. Stellen Sie vor weiteren Injektionen sicher, dass der Sauerstofffluss stabilisiert wird.
3. Injizieren Sie zwei H2O2-Impulse mit jeweils einer Endkonzentration von 260 μM, um sie später in der Kammer zu kalibrieren.
4. Injizieren Sie 20 μL Succinat (siehe Materialtabelle), ein substrat des mitochondrialen Komplexes II, um das mitochondriale Elektronentransportsystem zu aktivieren.
   HINWEIS: Verschiedene mitochondriale Substrate können an dieser Stelle hinzugefügt werden, um die mitochondriale Funktion durch verschiedene Komplexe zu bewerten. Repräsentative Ergebnisse mit unterschiedlichen Substraten für die mitochondrialen Komplexe I und II sind in Abbildung 2 und Abbildung 3 dargestellt. An dieser Stelle ist in Abbildung 3 ein gleichzeitiger Anstieg des O2-Verbrauchs und der H2O2-Produktion zu beobachten.
5. Fügen Sie 20 μL Adenosindiphosphat (ADP) hinzu, um die Adenosintriphosphat (ATP) -Synthese zu aktivieren.
   HINWEIS: ADP stimuliert die ATP-Synthese und reduziert das Membranpotential. Es wird erwartet, dass ein Anstieg des_{O2-Verbrauchs} und ein Rückgang der Produktion von_H2O2beobachtet werden^26,27_.
6. Fügen Sie nacheinander 5 μL Cytochrom c (siehe Materialtabelle) als Indikator für die Membranintegrität hinzu.
   HINWEIS: Wenn das Gewebe gut vorbereitet und permeabilisiert ist, sollte Cytochrom c den Sauerstoffverbrauch nicht um mehr als 15% erhöhen. Wenn dies der Fall ist, suchen Sie im Abschnitt zur Fehlerbehebung nach Empfehlungen.
7. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,2 μg/ml Oligomycin (siehe Materialtabelle), bis kein weiterer Rückgang des_{O2-Verbrauchs} beobachtet wird.
   HINWEIS: Oligomycin wirkt, indem es die ATP-Synthese hemmt, was zu einer Abnahme des O2-Flusses und einer Verbesserung der_H2O2-Bildungführt, die durch das hohe Membranpotential ^26,27 begünstigt wird.
8. Titrieren Sie mit Aliquots von 0,5 μmol/L Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) (siehe Materialtabelle), dem mitochondrialen Entkoppler, bis kein weiterer Anstieg des_{O2-Verbrauchs} mehr beobachtet werden kann. Um das Experiment zu beenden, injizieren Sie 2 μl Antimycin A auf eine Endkonzentration von 5 μM und warten Sie auf die Stabilisierung des Flusses.
   HINWEIS: Eine Abnahme der_{H2O2-Produktion}wird aufgrund der Membranpotentialdissipation nach der Injektion von FCCP beobachtet. Antimycin A hemmt den Komplex III und verhindert so den Elektronenfluss. Daher ist der mitochondrienabhängige O2-Verbrauch beeinträchtigt, was den Sauerstofffluss pro Masse verringert und den Elektronenverlust stimuliert, wodurch die_{H2O2-Produktion}um ^26,27 erhöht wird.
9. Gehen Sie in die Befehlsleiste, suchen Sie in der Software nach "multisensorisch", klicken Sie auf Control > Save file und Disconnect.
   HINWEIS: Die Zugabe anderer Substrate und Inhibitoren kann entsprechend der untersuchten Frage durchgeführt werden. Ein Beispiel ist in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Die_{H2O2-Kalibrierung}wird nach Beendigung des Experiments gemäß dem Protokoll²⁸ des Herstellers durchgeführt.
10. Öffnen Sie die gespeicherte Datei und wählen Sie die Spur "Sauerstofffluss pro Masse", um die experimentellen Sauerstoffverbrauchsergebnisse zu erhalten. Wählen Sie das Fenster zwischen den Injektionen manuell aus, indem Sie Umschalttaste + Linke Maustaste drücken.
    1. Gehen Sie zu Marks > Statistics, um die Ergebnisse für jede Injektion von Substrat / Inhibitoren / entkoppeltem Protokoll zu visualisieren. Führen Sie fürdie H 2_{O 2-Produktion} den gleichen Vorgang mit der Spur "Amp-Slope" durch.
       HINWEIS: Vermeiden Sie bei der Auswahl des Fensters Artefakte von Volumeninjektionen, indem Sie ein Fenster wählen, in dem Sauerstoff (oder_H2O2)stabiler und konstanter ist. Beispiele für ausgewählte Fenster werden in den repräsentativen Ergebnissen durch schwarze geschweifte Klammern dargestellt (Abbildung 2 und Abbildung 3).

Results

Der mitochondriale Sauerstoffverbrauch durch den permeabilisierten Ischiasnerv ist in Abbildung 2 dargestellt. Die rote Spur stellt den_O2-Fluss pro Masseneinheit in pmol/s.mg dar. Nach der Erfassung eines basalen Sauerstoffverbrauchs mit endogenen Substraten (Routineatmung) wird Succinat (SUCC) injiziert, um die durch Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) angetriebene Atmung aufzuzeichnen, was zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs führt. In der Folge wird eine sättigende Konzen...

Discussion

Mehrere Krankheiten oder Zustände, die Neuropathien begleiten, haben eine mitochondriale Dysfunktion als Risikofaktor. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven ist unerlässlich, um aufzuklären, wie sich die Mitochondrien bei diesen neurodegenerativen Zuständen verhalten. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist aufgrund der Schwierigkeit der Isolationsmethode und der Materialknappheit mühsam. Daher ist die Entwicklung von Gewebepermeabilisierungstechniken, die keine Isolierung der Mitocho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosin 5'-Triphosphat-Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosin-5′-diphosphat-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagenz	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red wird in DMSO gemäß Produktdatenblatt
hergestellt Antimycin A (von Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7030	Hitzeschockfraktion, proteasefrei, fettsäurefrei, im Wesentlichen globulinfrei, pH 7, ≥ 98%
Calciumcarbonat	Sigma-Aldrich	C6763
Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrom c	Sigma-Aldrich	C7752	(aus Pferdeherz; kleines Hämprotein)
DataLab Version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digitaler orbitaler Mikroplattenschüttler 120V	Thermo Fisher wissenschaftlicher	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA Natriumsalz	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton Spritze	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 μl, 25 μl und 50 μl
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Wasserstoff Peroxidlösung 30% W/W	Merck	H1009
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Apfelsäure	Sigma-Aldrich	M7397
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	M2393
MES Natriumsalz	Sigma-Aldrich	M3885
Mikro-Präparierzange, gebogen	Sigma-Aldrich	F4142
Mikro-Präparierzange, gerade	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Filterset Amplex Rot	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondrien. Mitochondr Physiol Netzwerk 17.17.
O2K - Fluoreszenz LED2 - Modulkomponente Fluoreszenz-Sensor Grün	OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich	44210-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	(aus Streptomyces diastatochromogenes; Mischung aus Oligomycinen A, B und C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitin (Palmitoyl-DL-Carnitin-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase aus Meerrettich	Sigma-Aldrich	P8375
Petrischale, Polystyrol	MERCK	P5606
Phosphokreatin Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	P7936
Kaliumdihydrogenphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	PHR1330
Kaliumhydroxid	Sigma-Aldrich	221473
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
Saponin	Sigma-Aldrich	SAE0073
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P5280
Natriumsuccinat zweibasisches Hexahydrat	Sigma-Aldrich	S2378
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurin	Sigma-Aldrich	T0625