Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Summary

Hochauflösende Respirometrie, gekoppelt mit Fluoreszenzsensoren, bestimmt den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung der mitochondrialen Atemfrequenzen und der ROS-Produktion im permeabilisierten Ischiasnerv.

Abstract

Mitochondriale Dysfunktion in peripheren Nerven begleitet mehrere Krankheiten, die mit peripherer Neuropathie verbunden sind, die durch mehrere Ursachen ausgelöst werden können, einschließlich Autoimmunerkrankungen, Diabetes, Infektionen, Erbkrankheiten und Tumoren. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven der Maus kann aufgrund der geringen Probengröße, einer begrenzten Anzahl von Mitochondrien im Gewebe und des Vorhandenseins einer Myelinscheide eine Herausforderung darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Technik minimiert diese Herausforderungen, indem sie ein einzigartiges Permeabilisierungsprotokoll verwendet, das an das für Muskelfasern verwendete Protokoll angepasst ist, um die mitochondriale Funktion des Ischiasnervs zu beurteilen, anstatt die Mitochondrien vom Gewebe zu isolieren. Durch die Messung der fluorimetrischen reaktiven Speziesproduktion mit Amplex Red/Peroxidase und den Vergleich verschiedener mitochondrialer Substrate und Inhibitoren in saponin-permeabilisierten Nerven war es möglich, mitochondriale Atmungszustände, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und die Aktivität von mitochondrialen Komplexen gleichzeitig nachzuweisen. Daher bietet die hier vorgestellte Methode Vorteile gegenüber der Beurteilung der mitochondrialen Funktion durch andere Techniken.

Introduction

Mitochondrien sind essentiell für die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und erfüllen zahlreiche Zellfunktionen wie den Energiestoffwechsel (Glukose-, Aminosäure-, Lipid- und Nukleotidstoffwechselwege). Als primärer Ort der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) sind Mitochondrien in mehreren Zellsignalprozessen wie Apoptose von zentraler Bedeutung und beteiligen sich an der Synthese von Eisen-Schwefel (Fe-S) -Clustern, dem Import und der Reifung von mitochondrialen Proteinen sowie der Aufrechterhaltung ihres Genoms und ihrer Ribosomen ^1,2,3. Das mitochondriale M....

Protocol

Das vorliegende Protokoll wird von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren in der Forschung, CCS/UFRJ (CEUA-101/19) und den Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt. Der Ischiasnerv wird aus vier Monate alten männlichen C57BL / 6-Mäusen isoliert, die gemäß den institutionellen Richtlinien durch Zervixdislokation eingeschläfert werden. Die Protokollschritte sind optimiert, um eine Verschlechterung der Mitochondrien zu vermeiden. Daher wurde in diesem Protokoll die Kalibrierung von polarographischen Sauerstoffsensoren vor der Dissektion und Permeabilisierung des Ischiasnervengewebes der Maus durch....

Results

Der mitochondriale Sauerstoffverbrauch durch den permeabilisierten Ischiasnerv ist in Abbildung 2 dargestellt. Die rote Spur stellt den_O2-Fluss pro Masseneinheit in pmol/s.mg dar. Nach der Erfassung eines basalen Sauerstoffverbrauchs mit endogenen Substraten (Routineatmung) wird Succinat (SUCC) injiziert, um die durch Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) angetriebene Atmung aufzuzeichnen, was zu einer Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs führt. In der Folge wird eine sättigende Konzen.......

Discussion

Mehrere Krankheiten oder Zustände, die Neuropathien begleiten, haben eine mitochondriale Dysfunktion als Risikofaktor. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion in peripheren Nerven ist unerlässlich, um aufzuklären, wie sich die Mitochondrien bei diesen neurodegenerativen Zuständen verhalten. Die Beurteilung der mitochondrialen Funktion ist aufgrund der Schwierigkeit der Isolationsmethode und der Materialknappheit mühsam. Daher ist die Entwicklung von Gewebepermeabilisierungstechniken, die keine Isolierung der Mitocho.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosin 5'-Triphosphat-Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	A26209
Adenosin-5′-diphosphat-Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A2754
Amplex Red Reagenz	Thermo Fisher scientific	A12222	Amplex Red wird in DMSO gemäß Produktdatenblatt
hergestellt Antimycin A (von Streptomyces sp.)	Sigma-Aldrich	A8674
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A7030	Hitzeschockfraktion, proteasefrei, fettsäurefrei, im Wesentlichen globulinfrei, pH 7, ≥ 98%
Calciumcarbonat	Sigma-Aldrich	C6763
Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cytochrom c	Sigma-Aldrich	C7752	(aus Pferdeherz; kleines Hämprotein)
DataLab Version 5.1.1.91	OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich		Copyright (c) 2002 - 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digitaler orbitaler Mikroplattenschüttler 120V	Thermo Fisher wissenschaftlicher	88882005
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
EGTA Natriumsalz	Sigma-Aldrich	E8145
Hamilton Spritze	Sigma-Aldrich	HAM80075	10 μl, 25 μl und 50 μl
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Wasserstoff Peroxidlösung 30% W/W	Merck	H1009
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
L-(−)-Apfelsäure	Sigma-Aldrich	M7397
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma-Aldrich	M2393
MES Natriumsalz	Sigma-Aldrich	M3885
Mikro-Präparierzange, gebogen	Sigma-Aldrich	F4142
Mikro-Präparierzange, gerade	Sigma-Aldrich	F4017
O2K - Filterset Amplex Rot	OROBOROS INSTRUMENTS, Austria	44321-01	Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondrien. Mitochondr Physiol Netzwerk 17.17.
O2K - Fluoreszenz LED2 - Modulkomponente Fluoreszenz-Sensor Grün	OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich	44210-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	(aus Streptomyces diastatochromogenes; Mischung aus Oligomycinen A, B und C
OROBOROS Oxygraph-2k	OROBOROS INSTRUMENTS, Österreich	http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitin (Palmitoyl-DL-Carnitin-HCl)	Sigma-Aldrich	P4509
Peroxidase aus Meerrettich	Sigma-Aldrich	P8375
Petrischale, Polystyrol	MERCK	P5606
Phosphokreatin Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	P7936
Kaliumdihydrogenphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	PHR1330
Kaliumhydroxid	Sigma-Aldrich	221473
Rotenon	Sigma-Aldrich	R8875
Saponin	Sigma-Aldrich	SAE0073
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P5280
Natriumsuccinat zweibasisches Hexahydrat	Sigma-Aldrich	S2378
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378
Taurin	Sigma-Aldrich	T0625