Methodenartikel

Untersuchung der lindernden Wirkung der Verabreichung von Bacillus cereus auf Colitis durch Modulation der Darmmikrobiota

DOI:

10.3791/63707

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27. Juli 2022

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1School of Life Sciences, Anhui University, 2Key Laboratory of Human Microenvironment and Precision Medicine of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University, 3Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, 4Institute of Physical Science and Information Technology, Anhui University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung des Antibiotika-induzierten pseudo-keimfreien Dextransulfat-Natrium-induzierten Colitis-Mausmodells vor, um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der positiven Auswirkungen von Bacillus cereus auf Colitis zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wird angenommen, dass die Dysbiose der Darmmikrobiota eine Rolle beim Fortschreiten der Kolitis spielt. Die genauen Standards für die Verabreichung von Probiotika bei der Linderung von Colitis sind jedoch noch nicht definiert. Die meisten Analysemethoden beruhen auf einer begrenzten Vielfalt und Häufigkeit von Darmmikroorganismen. Daher können Beobachtungsstudien keine Kausalität nachweisen. In dieser Studie haben wir Antibiotika-induzierte pseudokeimfreie Mäuse angewendet, um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der probiotischen Wirkungen von Bacillus cereus (B. cereus) auf Dextransulfat-Natrium (DSS)-induzierte Kolitis bei Mäusen zu untersuchen. Dieser Prozess ermöglicht es, die bidirektionale regulierende Wirkung einer B . cereus-Supplementierung auf die Gesundheit zu bewerten und stabile und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern. Hier werden die detaillierten Protokolle für die Kultivierung von B. cereus , die Sondenoperation, die Stuhlsammlung und die Behandlung der Antibiotika-Clearance an Colitis-Mäusen bereitgestellt. Die Optimierungsmethoden sind auch auf andere chronisch entzündliche Erkrankungen anwendbar. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verabreichung von B. cereus den Gewichtsverlust am Körper, die Verkürzung der Dickdarmlänge, den Krankheitsaktivitätsindex und die histopathologischen Werte verringerte. Die Behandlung mit Antibiotika unterdrückte jedoch die positive Wirkung von B. cereus auf die Kolitis. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Darmmikrobiota für die lindernde Wirkung von B. cereus auf Colitis benötigt wird. Daher ist die Erforschung der positiven Wirkungen von Probiotika in dieser Forschung ein vielversprechender Ansatz für die Entwicklung neuartiger Behandlungsstrategien zur Linderung der Symptome chronisch entzündlicher Erkrankungen.

Einleitung

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Entzündliche Darmerkrankungen (CEDs) sind häufige chronische gastrointestinale Entzündungserkrankungen, einschließlich Morbus Crohn und Colitis ulcerosa (UC)1. Die derzeitigen therapeutischen Wege für entzündliche Colitis sind 5-Aminosalicylate, Kortikosteroide, Azathioprin und Antibiotika2. Darüber hinaus haben diese Medikamente erhebliche Nebenwirkungen3. Daher sollten wir der Wirkung von Probiotika bei der Behandlung von Colitis mehr Aufmerksamkeit schenken.

Zu den alternativen Therapieansätzen gehört die Verabreichung von Probiotika, die in Tiermodellen und klinischen Studien eingesetzt wurde. Frühere Studien haben gezeigt, dass verschiedene probiotische Verabreichungen wie Bacillus cereus oder Bifidobacterium infantis die Kolitis lindern können 4,5. In präklinischen Studien muss die Wirksamkeit und Sicherheit von Probiotika im Tiermodell untersucht werden.

Dextransulfat-Natrium (DSS)-Colitis-Mausmodelle können helfen, die Mechanismen der Kolitis zu erforschen und die positiven Auswirkungen von Probiotika zu bewerten. Die DSS-Induktion führt zu einer Erosion der Darmschleimhaut, einer Funktionsstörung der Darmbarriere und einer Erhöhung der intestinalen Epithelpermeabilität6. Die meisten Mausmodelle für Probiotika haben hauptsächlich biologische Wirkungen hervorgehoben. Der Mechanismus hinter der Verabreichung dieses Probiotikums ist jedoch schwer zu erforschen, da die weitere Überprüfung des kausalen Zusammenhangs zwischen Probiotika und der Linderung von Colitis begrenzt ist. Daher besteht die Notwendigkeit, eine standardisierte Methode zur Untersuchung des Mechanismus von Probiotika zu entwickeln.

Traditionell erfordern diese Studien die Inokulation bestimmter Probiotika in keimfreie Mäuse7. Es gibt jedoch einige Laboreinschränkungen bei der Verwendung von keimfreien Mäusen als Rezeptoren für Probiotika, wie z. B. die geringe Immunkapazität und teure keimfreie Einrichtungen8. Um diese Einschränkungen zu vermeiden, wurde ein alternatives DSS-induziertes Kolitis-Modell mit pseudokeimfreien Mäusen etabliert. Das pseudokeimfreie Mausmodell wurde durch die Gabe von Antibiotika etabliert, wie zuvor beschrieben 9,10.

In diesem Artikel etablieren wir pseudo-keimfreie Mäuse mit einem Antibiotika-Cocktail. Wir beschreiben auch ausführlich die Methodik zur Etablierung und Bewertung von Maus-Colitis-Modellen und untersuchen die Auswirkungen von Probiotika auf die Linderung von Colitis-Symptomen. Das folgende Protokoll enthält auch die Methoden der probiotischen Verabreichung durch Sonde.

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Protokoll

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Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Anhui, China, durchgeführt, und alle Verfahren wurden von der Ethikkommission für Tiere der Universität Anhui, China (Nr. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Verabreichung von Antibiotika

  1. Bereiten Sie einen Cocktail aus Antibiotika vor, indem Sie Ampicillin (1 g/l), Neomycinsulfat (1 g/l), Metronidazol (0,5 g/l) und Vancomycin (0,5 g/l) in 1 l Trinkwasser auflösen5.
  2. Nach vollständiger Auflösung werden die Lösungen bei 4 °C gelagert.
  3. Geben Sie die antibiotischen Cocktaillösungen in eine Wasserflasche. Stellen Sie die Flasche auf den Mäusekäfig.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, braune Flaschen zu verwenden oder die Flaschen mit Alufolie einzuwickeln, um die Antibiotikalösungen vor Licht zu schützen.
  4. Ersetzen Sie den Antibiotika-Cocktail 2x pro Woche durch frische Lösungen.
  5. Lassen Sie die Mäuse die Antibiotika-Cocktail-Lösungen 4 Wochen lang frei trinken.

2. Zubereitung von DSS-Trinkwasser und Induktion von Colitis

  1. Um eine 2,5%ige Dextransulfat-Natrium-Lösung (DSS) herzustellen, lösen Sie 2,5 g DSS in 100 ml destilliertem Wasserauf 11.
  2. Ersetzen Sie das Trinkwasser durch die 2,5%ige DSS-Lösung in der Gruppe der Colitis-Modellmäuse. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse der Colitis-Gruppe keinen Zugang zu anderem Trinkwasser haben. Behandeln Sie in der Zwischenzeit die Kontrollmäuse mit destilliertem Wasser ohne DSS.
  3. Männliche C57BL/6J-Mäuse (durchschnittliches Körpergewicht, 20 g ± 2 g; Alter 7 Wochen) unter erregerfreien Bedingungen mit freiem Zugang zu Standardfutter und Wasser unterbringen.
    HINWEIS: Halten Sie insgesamt fünf Mäuse pro Käfig unter pathogenfreien Bedingungen.
  4. Experimentelle Planung
    HINWEIS: Die Tierversuche wurden in zwei Stufen konzipiert. Für jede Gruppe wurden fünf Mäuse eingeschlossen.
    1. Erste Phase: Um die positive Wirkung von B. cereus auf die Linderung von Colitis zu bewerten, werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip den folgenden drei Gruppen zugeordnet: Kontrollgruppe (Kontrolle), DSS-induziertes Colitis-Modell (DSS), probiotische B. cereus-Supplementierung für DSS-induzierte Mäuse (B. cereus).
    2. Zweite Phase: Um die Rolle der Darmmikrobiota bei der Regulierung der probiotischen Wirkungen von B. cereus auf DSS-induzierte Kolitis zu untersuchen, werden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in die folgenden drei Gruppen eingeteilt: ABX (Kontrolle), ABX (DSS) und ABX (B. cereus + DSS).
      1. Behandeln Sie die Mäuse der ABX-Gruppe (Kontrollgruppe) mit physiologischer Kochsalzlösung.
      2. Nach 4-wöchiger Behandlung mit Antibiotika-Cocktail-Lösungen erhalten die Mäuse der ABX-Gruppe (DSS) 1 Woche lang Wasser mit 2,5 % DSS und 2 Wochen lang normale physiologische Kochsalzlösung.
      3. Nach der Behandlung mit Antibiotika-Cocktaillösungen und DSS-Wasser behandeln Sie die Mäuse der ABX-Gruppe (B. cereus + DSS) täglich mit B. cereus (2 x 108 Zellen) in 200 μl physiologischer Kochsalzlösung unter Verwendung einer Magenkanüle für 2 Wochen.
  5. Nach der Verabreichung des Antibiotika-Cocktails die männlichen C57BL/6-Mäuse sofort 7 Tage lang mit 2,5%iger DSS-Lösung in Trinkwasser behandeln.
  6. Notieren Sie das Körpergewicht der Mäuse vor der DSS-Intervention als Ausgangsgewicht.

3. Quantifizierung von B. cereus

  1. Bereiten Sie acht 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vor, die mit 900 μl steriler normaler Kochsalzlösung gefüllt sind.
  2. 100 μl logarithmisches Wachstum B. cereus pipettieren und in 900 μl steriler normaler Kochsalzlösung auflösen.
  3. B. cereus mit Hilfe von Röhrchen seriell verdünnen.
  4. Platte 40 μl jeder Verdünnung auf die jeweilige LB-Agarplatte, die mit dem Verdünnungsverhältnis beschriftet ist. Wiederholen Sie dies 3x für jedes Verdünnungsverhältnis.
  5. Kultivieren Sie die Platten in einem 37 °C konstanten Inkubator für 16 h.
  6. Wählen Sie die Platten mit ~20-70 Völkern zum Zählen aus. Berechnen Sie die durchschnittliche Bakterienkonzentration anhand des Verdünnungsvielfachen der ausgewählten Platten.

4. Vorbereitung von B. cereus für die Sonde

  1. Nach der Quantifizierung von B. cereus 1 ml B . cereus-Medium mit 1 x 109 KBE sammeln und 10 min lang bei 8.000 x g zentrifugieren. Anschließend die Bakterienzellen 2x mit sterilem Wasser durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min waschen und den Überstand entfernen.
  2. Das konzentrierte B. cereus wird mit steriler normaler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 2 x 108 KBE/200 μl4 verdünnt.
  3. Pipettieren Sie die Verdünnung wiederholt auf und ab, um eine dispergierte B. cereus-Suspension zu erhalten.
  4. Die Quantifizierung der B . cereus-Konzentration durch die Keimzahltechnik ist vor Abschluss der Sondenmethode durchzuführen.

5. Anwendung von B. cereus-Nahrungsergänzungsmitteln durch Sonde

  1. Verabreichen Sie den Mäusen die Interventionen (2 x 10,8 KBE, Probiotika in 200 μl normaler Kochsalzlösung) durch orale Sonde zu einem festgelegten Zeitpunkt.
  2. Zur Verabreichung von B. cereus verbinden Sie eine Sondennadel (Zuführnadelstärke: 20 G, 38 mm) mit einer 1-ml-Spritze. Wischen Sie die Außenseite der Sondennadel zwischen den Mäusen mit 70% Ethanol ab und halten Sie die richtige Dosierung aufrecht.
  3. Um die Mäuse festzuhalten, nehmen Sie sie am Schwanz und fassen Sie die lose Haut des Rückens fest, wobei das Ende des Schwanzes zwischen den letzten beiden Fingern des Hundeführers befestigt ist.
  4. Halten Sie die Mäuse in einer vertikalen Position. Führen Sie dann die Sondennadel vorsichtig und vorsichtig durch den Mund in die Speiseröhre ein. Wenn Sie in diesem Schritt auf keinen Widerstand stoßen, schieben Sie die Nadel vorsichtig in den Magen.
    HINWEIS: Bestätigen Sie die regelmäßige und ungehinderte Atmung der Mäuse vor der Verabreichung des Arzneimittels.
  5. Schieben Sie die Nadel langsam vor und verabreichen Sie die B. cereus-Lösung . Ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück, nachdem die Sonde abgeschlossen ist. Lassen Sie die Maus los und setzen Sie sie in ihren Käfig zurück.

6. Bestimmung des Krankheitsaktivitätsindex

HINWEIS: Der Krankheitsaktivitätsindex (DAI) wurde täglich anhand des Körpergewichtsverlusts der Mäuse, des okkulten Blutes im Stuhl und der Stuhlkonsistenz der Mäuse berechnet.

  1. Messen Sie täglich das Körpergewicht der Mäuse. Weisen Sie jeder Maus eine Punktzahl von 0-4 zu, basierend auf dem prozentualen Gewichtsverlust des Körpers (0: 0 %, 1: 1 %-5 %, 2: 6 %-10 %, 3: 11 %-18 % und 4: >18 %).
  2. Sammeln Sie frische Stuhlproben von jeder Maus. Stimulieren Sie mit einem Wattestäbchen die Kontraktion des Anus, um den Stuhlgang zu fördern. Sammeln Sie dann die Kotproben unmittelbar nach dem Stuhlgang in einem sterilisierten Zentrifugenröhrchen.
  3. Bestimmen Sie das okkulte Blut im Stuhl mit einem Testpapier für okkultes Blut im Stuhl. Sammeln Sie 10 mg Stuhlprobe auf einem Applikatorstäbchen.
  4. Legen Sie die Probe auf die Testkarte und tragen Sie einen dünnen Abstrich auf die Karte auf. Öffnen Sie die hintere Klappe und tragen Sie den Entwickler auf den Abstrich auf.
  5. Bewerten Sie dann okkultes Blut mit dem Testpapier für okkultes Blut im Stuhl innerhalb von 120 s.
    HINWEIS: Jede Spur von Blau auf oder am Rand des Abstrichs ist positiv für okkultes Blut. Die okkulten Werte im Stuhl waren wie folgt: 0: Keine, 1: Hämokcult positiv, 2: Leicht, 3: Blutspuren im Stuhl und 4: Schwere Blutungen.
  6. Identifizieren Sie die Stuhlkonsistenz, indem Sie die Stuhlprobe erkennen11. Vergeben Sie eine Punktzahl von 0-4 (0: Normal, 1: Loser Stuhl, 2: Halbgeformter Stuhl, 3: Flüssiger Stuhl und 4: Durchfall).

7. Gewebeentnahme

  1. Betäuben Sie die Mäuse durch Injektion von 10 % Chloralhydrat (10 mg/kg) am Ende der ersten und zweiten Versuchsstufe. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie bei Mäusen anhand des Pinch-Entzugsreflexes.
  2. Dann werden die Mäuse durch Zervixluxation eingeschläfert.
  3. Fixieren Sie die Maus in Rückenlage auf dem Operationstisch und öffnen Sie die Bauchhöhle.
  4. Trennen Sie den gesamten Dickdarm operativ ab und messen Sie die Länge mit einem Lineal.
  5. Waschen Sie dann den Dickdarm vorsichtig mit einer 5-ml-Spritze, die mit vorgekühltem PBS gefüllt ist.

8. Beurteilung histologischer Schäden

  1. Schneiden Sie das Dickdarmgewebe in kleine Fragmente, fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd und betten Sie sie mit einer Gewebeeinbettungsmaschine in Paraffin ein.
  2. Anschließend wird das in Paraffin eingebettete Gewebe mit einem Mikrotom geschnitten, um 4 μm dicke Dickdarmgewebeschnitte herzustellen. Entwachse und dehydriere die Dickdarmabschnitte. Färben Sie dann die Dickdarmabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E).
    HINWEIS: Die gefärbten Dickdarmproben werden vom Prüfarzt mit einem System für die folgenden Messungen beurteilt: Grad der Infiltration von Entzündungszellen (Keine: 0, Leicht: 1, Mittel: 2, Schwer: 3), Schleimhautschädigung (Keine: 0, Schleimhaut: 1, Submukosa: 2, Muscularis und Serosa: 3), Kryptenschädigung (Keine: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, Gesamt: 3, Gesamt + Epithelverlust: 4), Bereich der Läsionen (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). Der histologische Gesamtschadenswert wird für jeden einzelnen Score der oben genannten Maßeberechnet 5.
  3. Lassen Sie zwei unabhängige Experimentatoren die histologischen Werte der Probe unter einem Lichtmikroskop bewerten (verblinden).

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Ergebnisse

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B. cereus Supplementierung und Colitis
Das akute experimentelle Colitis-Modell wurde durch die DSS-Intervention im Trinkwasser induziert. Abbildung 1A zeigt das experimentelle Protokoll für die Verabreichung von B. cereus an das Colitis-Mausmodell. Die DSS-Induktion verringerte offensichtlich das Körpergewicht (Abbildung 1B) und die Dickdarmlänge. Die lindernde Wirkung von B. cereus durch orale Sonde wurde an den Co...

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Diskussion

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Um Probiotika in klinischen Studien einsetzen zu können, ist es notwendig, die Wirksamkeit und Sicherheit von Probiotika in Tiermodellen zu bewerten. Die bereitgestellten Protokolle wurden zuvor für die Beurteilung des Schweregrads der Kolitis optimiert. Mäuse, die mit DSS behandelt werden, sind ein Modell für Darmentzündungen, das die klinischen und histologischen Merkmale nachahmt, die für Colitis ulcerosa charakteristisch sind12. Akute Kolitis-Modellmäuse zeich...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde zumindest teilweise von der National Natural Science Foundation of China (K.S., Grant No. 32000081), der Natural Science Foundation of Anhui Province (K.S., Grant No. 1908085QC120), dem Open Project Program des State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University (K.S., Grant No.SKLF-KF-201920), der Natural Science Foundation of Anhui Higher Education Institutions of China (K.S., Zuschuss-Nr. KJ2019A0040), die Doctoral Scientific Research Foundation der Anhui University (K.S., Stipendium Nr. J01003316), die National Natural Science Foundation of China (Y.W., Stipendium Nr. 31770066, 31470218), der Open Fund for Discipline Construction, Institute of Physical Science and Information Technology der Anhui University (Y.W.) und das Outstanding Talents Program der Anhui University, China (Y.W.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,01 M PBS (Pulver, pH7,2– 7.4)Solarbio GmbHP1010-2L
Absoluter EthylalkoholHushi64-17-5
Differenzierungslösung für sauren Alkohol fsatBeyotimeNr.C0163S
AgarSangon Biotech9002-18-0
AmpicillinSolarbio GmbH69-53-4Lagern bei 2– 8 &Grad; C
Anaerober InkubatorLanger YueLA1-3T
Dextransulfat, Natriumsalz, Colitis-QualitätMP Biomedizin160110
Elektrothermischer InkubatorSANFAHP-050A
Allzweck-GewebefixateurBioscharfBL539A
GlycerinHushi56-81-5
Hämatoxylin- und Eosin-FärbekitBeyotimeNr.C0105
Kisser's Mount MediumBeyotimeNr.C0181
MetronidazolSolarbio GmbH443-48-1Lagern bei 2– 8 &Grad; C
NeomyeinsulfatSolarbio GmbH1405-10-3Lagern bei 2– 8 &Grad; C
Oszillierender InkubatorShanghai ZhichuZQLY-180S
NatriumchloridSangon Biotech7647-14-5
Stuhl okkultes Blut TestpapierBasoBA2020B
TryptonOXOID2285856
VancomycinSolarbio GmbH1404-93-9Lagern bei 2– 8 &Grad; C
XylolHushi1330-20-7
HefeextraktSangon Biotech8013-01-2

Referenzen

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Schlagwörter

Colitis ModellSupplementierung mit ProbiotikaDSS induzierte ColitisAntibiotikabehandlungVerabreichung per Gavageokkultes Blut im StuhlKolon Histopathologieentz ndliche Erkrankungen

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