Dieses Protokoll beschreibt, wie Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie von Zebrafisch-Embryonalschnitten erhalten werden können. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Es ist nützlich, die Expressionsmuster zweier Gene im Zebrafisch nachzuweisen, wenn ein Mangel an Antikörpern vorliegt.
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Methodenartikel
In situ Hybridisierung kombiniert mit Immunhistochemie in kryogeschnittenen Zebrafischembryonen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Als Wirbeltier ist der Zebrafisch in biologischen Studien weit verbreitet. Zebrafisch und Mensch teilen eine hohe genetische Homologie, die es ermöglicht, sie als Modell für menschliche Krankheiten zu verwenden. Die Genfunktionsstudie basiert auf der Detektion von Genexpressionsmustern. Obwohl die Immunhistochemie eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinexpression bietet, schränkt die begrenzte Anzahl kommerziell erhältlicher Antikörper im Zebrafisch die Anwendung der Cofärbung ein. Die In-situ-Hybridisierung wird häufig in Zebrafischembryonen eingesetzt, um die mRNA-Expression nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Bilder durch die Kombination von In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie für Zebrafisch-Embryonenschnitte erhält. Vor der Kryosektion wurde eine In-situ-Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von einer Antikörperfärbung. Die Immunhistochemie und die Bildgebung eines einzelnen Kryoschnitts wurden nach in situ Hybridisierung durchgeführt. Das Protokoll ist hilfreich, um das Expressionsmuster zweier Gene zu entschlüsseln, zuerst durch In-situ-Transkriptdetektion und dann durch Immunhistochemie gegen ein Protein im selben Abschnitt.
Einleitung
Der Zebrafisch ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell für Entwicklungs- und Genetikstudien 1,2. Zebrafisch und Mensch haben eine hohe genetische Homologie (70 % der Gene werden mit dem menschlichen Genom geteilt), was die Verwendung als Modell für menschliche Krankheiten ermöglicht3. Im Zebrafisch ist es durchaus üblich, die Expressionsmuster zweier Gene und ihre räumliche Beziehung zu erkennen. Die Immunhistochemie wurde erstmals 1941 zum Nachweis von Krankheitserregern in infizierten Geweben durch Anwendung von FITC-markierten Antikörpern eingesetzt4. Das Zi....
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Protokoll
Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Nantong genehmigt (Nr. S20191210-402).
1. Entnahme von Zebrafisch-Embryonen
- In der Nacht vor der Entnahme der Eier ein Zebrafischpaar in Zuchtbecken aufstellen, einen transgenen Zebrafisch und einen AB-Wildtyp-Zebrafisch (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB Wildtyp oder Tg (hb9:egfp) X AB Wildtyp) (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine diagonale Trennwand aus Kunststoff, um den Mann und die Frau zu trennen, um einen physischen Zugang auszuschließen. Setzen Sie am nächsten Tag d....
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Ergebnisse
Mit diesem Protokoll kann das Expressionsmuster einer mRNA und eines Proteins gleichzeitig untersucht werden. Abbildung 1 zeigt den experimentellen Arbeitsablauf. Der 5-HT2C-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT-Rezeptors, der an den Neurotransmitter Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) gebunden ist. Es ist im zentralen Nervensystem (ZNS) weit verbreitet und kann eine Vielzahl von Gehirnfunktionen wie Appetit, Stimmung, Angst und Fortpflanzungsverhalten erheblich regulieren13
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Diskussion
Dieses Protokoll schlägt eine Kombination aus In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie vor, ein wichtiger Schritt in den Kolokalisationsexperimenten an Zebrafischembryonen. Diese Methode dient als einfache und effiziente Möglichkeit, gleichzeitig eine mRNA und ein Protein zu analysieren. In-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung wurden an Zebrafischembryonen durchgeführt. Im Gegensatz zu mehreren zuvor veröffentlichten Protokollen14,15,16<.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), der Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) und der Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab-Fragmente | 11093274910 | ||
| Anti-GFP-Antikörper | Millipore | MAB3580 | |
| Blockierungsreagenz | Roche | 11096176001 | |
| Blockierungslösung-1 | hergestellt im | Labor N/A | Das Blockierungsreagenz in 1X MAB auf eine Endkonzentration von 10 % (wt/vol) auflösen. Autoklavieren und lagern bei -20 ° C vor Gebrauch. |
| Blockierungslösung-2 | hergestellt im Labor | N/A | 0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% Ziegenserum in 1x PBS |
| BM lila | Roche | 11442074001 | |
| Rinderserum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citratpuffer | Leagene | IH0305 | |
| Zitronensäure | Sigma | C2404 | |
| Kryoform für Gewebe, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Kopf Biotechnologie | H4566 | |
| DEPC-behandeltes Wasser | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digitalkamera, Fluoreszenzmikroskop | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 Embryomedium | hergestellt im Labor | N/A | 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 |
| Formamid | Invitrogen | AM9342 | |
| Ziegenserum | Sigma | G9023 | |
| Heparin-Natriumsalz | J& K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 & micro; g/mL Heparin-Natriumsalz, 100 µ g/mL Ribonukleinsäure Diethylaminoethanol Salz |
| Immunhistochemische Nassbox | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Leica Klingen mit niedrigem Profil | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | hergestellt im Labor | N/A | 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, 0,02 % Tween-20, pH 7,5 |
| Maleinsäure | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J& K Scientific | 116481 | |
| Methylenblau | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP | pen Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyd, 4% | Abbexa | abx082483 | hergestellt im Labor in 1x PBS |
| PBST (1x) | hergestellt im Labor | N/A | 1x PBS plus 0,1% Tween-20 |
| Phenylthioharnstoff | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | hergestellt im Labor | N/A | 50 % Formamid, 5x SSC, 9,2 mM Zitronensäure (pH 6,0), 0,1 % Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonukleinsäure, Diethylaminoethanolsalz | Sigma | R3629 | |
| RNasefreie 1,5 mL Röhrchen | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0,2x) | hergestellt im Labor | N/A | 0,2x SSC plus 0,1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | hergestellt im Labor | N/A | 1x SSC plus 0,1% Tween-20 |
| Saccharose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafisch | Labortierzentrum der Universität Nantong | N/A |
Referenzen
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology
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Nachdrucke und Genehmigungen
