Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Hier werden zwei verwandte Protokolle für die Lyse von Caenorhabditis elegans vorgestellt, um DNA für PCR-basierte Anwendungen zugänglich zu machen. PCR ist eine häufig verwendete molekulare Technik, die für viele Anwendungen verwendet wird, einschließlich der Genotypisierung und Amplifikation von DNA-Fragmenten zum Klonen und Sequenzieren, unter anderem. Der kleine (1 mm), freilebende Spulwurm C. elegans ist ein beliebtes Tiersystem für die biologische Forschung. Die Gewinnung geeigneter genomischer DNA von einem einzelnen Tier oder einigen wenigen Tieren reicht aus, um die Sequenz durch PCR zu amplifizieren. Späte L4-Larven und Erwachsene enthalten nur ~ 1.000 somatische Zellen (einschließlich einiger multinuklearer, polyploider Zellen), Keimzellen und (wenn das Tier ein gravider Hermaphrodit ist) Nachkommen in utero¹. Diese Tiere sind jedoch durch eine Kutikula geschützt, die gestört werden muss, um die genomische DNA² zu extrahieren. Standardmethoden zur Vorbereitung der genomischen DNA-Vorlage für Nematoden für die PCR umfassen mehrere Schritte und dauern mehrere Stunden. Die Tiere werden zunächst in Wurmlysepuffer eingefroren, der Proteinase K (−70 °C oder weniger) für mindestens 15-45 min enthält (längere wird von einigen Protokollen empfohlen⁾3,4,5,6. Dieser Schritt reißt die Tiere auf.

Nach dem Einfrieren werden die Tiere für 1 h bei 60-65 °C inkubiert, damit die Proteinase K funktioniert, dann wird das Enzym für 15-30 min bei 95 °C inaktiviert. Die Proteinase K zerstört die Nukleasen, die DNA abbauen. Die Inaktivierung der Proteinase K vor der PCR ist wichtig, um zu verhindern, dass die Proteinase K die DNA-Polymerase abbaut. Die beiden hier beschriebenen Kit-basierten Protokolle sind schnelle, zuverlässige und kostengünstige Methoden, um genomische DNA aus einem einzelnen Tier oder einigen Nematoden für alltägliche Forschungs- und Lehrlaboranwendungen zu extrahieren. Das verwendete Kit wurde ursprünglich vom Hersteller optimiert, um DNA aus tierischem Gewebe, Speichel und Haaren zu extrahieren⁷. Es verwendet eine proprietäre Gewebepräparationslösung und Extraktionslösung, um Zellen zu lysieren und genomische DNA zugänglich zu machen. Eine proprietäre Neutralisationslösung neutralisiert dann die Komponenten, die die PCR hemmen können (z. B. Salze, Ionen und Mg²⁺-bindende Moleküle).

Bei der Genotypisierung kann ein einzelnes Tier getestet werden. Bei der Bestimmung, ob ein Stamm homozygot ist, gibt das Testen von sechs oder mehr Nachkommen eines einzelnen Tieres eine hohe Sicherheit, dass eine Linie homozygot ist oder nicht (es besteht eine Wahrscheinlichkeit von 0,02%, dass zufällig sechs homozygote mutierte Nachkommen von einem heterozygoten Elternteil ausgewählt werden [(1/4)⁶ × 100% = 0,02%]). Diese Methode 1) ist einfach, mit weniger Schritten als die Proteinase K-Methode, und 2) verringert die Vorlagenvorbereitungszeit auf 15 min. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das entwickelte Protokoll robust bei der Extraktion genomischer DNA aus einzelnen oder wenigen Würmern funktioniert, die zuverlässig für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden kann, die keine hochgereinigte DNA benötigen, einschließlich PCR.

1. C. elegans Wartung

HINWEIS: N2 (Wildtyp) und blmp-1(tm548) C. elegans Stämme wurden auf Standard-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) -Platten bei 20 ° C gehalten.

1. Bereiten Sie NGM-Platten vor, indem Sie 23,005 g NGM-Pulver in 973 ml Wasser in einem 2-Liter-Kolben auflösen. Decken Sie die Kolbenöffnung mit Aluminiumfolie (oder einer autoklavierbaren Kappe, die eine Belüftung ermöglicht) ab und sichern Sie die Abdeckung mit Autoklavband. Autoklav zum Auflösen des Pulvers und Sterilisieren des Inhalts mit einem Sterilisationszyklus von mindestens 30 min.
2. Das Medium in einem Wasserbad auf 60 °C abkühlen.
3. Zu dem abgekühlten Medium werden 25 ml steriler 1 M Phosphatpuffer (KH₂PO₄), pH 6,0, zugegeben; 1 ml 1 M Calciumchloridlösung; und 1 ml 1 M Magnesiumsulfatlösung.
4. Rühren Sie das Medium auf einer magnetischen Rührplatte um, um eine homogene Mischung zu erhalten und eine ungleichmäßige Abkühlung und Erstarrung zu verhindern (~5 min). Stellen Sie sicher, dass sich der Rührstab schnell genug dreht, um einen Wirbel zu erzeugen, aber nicht so schnell, dass Blasen eingeführt werden (~ 250-300 U / min).
5. Gießen Sie ~ 25 ml des Mediums in jede 10 cm Petriplatte (~ 40 Platten insgesamt). Trocknen Sie die Platten bei Raumtemperatur über Nacht (typischerweise 16-25 °C).
6. Züchten Sie eine Kolonie Escherichia coli OP50 in 30-50 ml LB-Brühe über Nacht bei 37 ° C.
7. Jede Platte mit 500 μL E. coli OP50-Kultur aussaat und vor Gebrauch bei Raumtemperatur trocknen lassen (typischerweise 16-25 °C)⁸. Lagern Sie die Platten bei 4 °C für bis zu 3 Wochen.
8. C. elegans mit einer Drahtpickel oder einer anderen Methode auf ausgesäte Platten übertragen und sie bei der für den Stamm erforderlichen Temperatur auf L4 oder das Erwachsenenstadium wachsen lassen (typischerweise 16-25 °C, 1-2 Tage, wenn Tiere als Dauers verhungert wurden, 3-4 Tage, wenn Tiere als Embryonen plattiert wurden)⁸.

2. Einzelwurm-DNA-Extraktion

HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einem einzelnen Wurm (ein Wurm in 1,8 μL Gesamtvolumen) zu extrahieren. Ein Master-Mix kann erstellt werden, wenn mehrere Würmer gleichzeitig lysiert werden.

1. Programmieren Sie einen Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).
2. Aliquot 0,8 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 mL PCR-Röhrchens auf Eis. 0,2 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.
3. Identifizieren Sie ein L4 oder ein erwachsenes Tier unter einem Seziermikroskop⁹. Um L4-Hermaphroditen zu identifizieren, suchen Sie nach einer charakteristischen Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Identifizieren Sie erwachsene Hermaphroditen, indem Sie nach den größten Tieren auf dem Teller suchen, die ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben können.
4. Übertragen Sie das ausgewählte Tier mit einem Platin-Drahtbesteck in die Lösung¹⁰.
5. Zentrieren Sie das Rohr kurz (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g) bei Raumtemperatur, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.
6. Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das in Schritt 2.1 eingestellte Lyseprogramm aus.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 0,8 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).
9. Verwenden Sie das Lysat direkt für die PCR oder lagern Sie es bei 4 °C oder -20 °C für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil⁷.

3. DNA-Extraktion einiger weniger Individuen

HINWEIS: Diese Methode ist nützlich, um DNA aus einigen Würmern zu extrahieren. Ein Master-Mix kann hergestellt werden, wenn mehrere Stämme gleichzeitig lysiert werden.

1. Programmieren Sie den Thermocycler für einen Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten, gefolgt von 95 °C für 3 min (Lyseprogramm).
2. Aliquot 2,0 μL der Extraktionslösung aus dem Kit auf die Innenwand eines 0,2 ml PCR-Röhrchens auf Eis. 0,5 μL der Gewebepräparationslösung aus dem Kit in das Tröpfchen der Extraktionslösung geben. Mischen durch Pipettieren.
3. Identifizieren Sie L4 oder erwachsene Tiere unter einem Seziermikroskop⁹. L4-Hermaphroditen haben eine charakteristische Vulva, die als blasser Halbkreis in der Mitte des Tieres sichtbar ist. Erwachsene Hermaphroditen sind die größten Tiere auf dem Teller und können ovale Embryonen in ihrer Gebärmutter sichtbar haben.
4. Übertragen Sie mit einem Platin-Drahtbecher einige Tiere in die Lösung: 9 Tiere ergeben 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA pro 0,5 μL Lysat und 16 Tiere erhalten ~ 1 tierisches Äquivalent genomischer DNA in 0,25 μL (3,5 Nematoden/μL)¹⁰.
   HINWEIS: Es ist schwierig, mehr als 16 Tiere in diesen Band zu übertragen.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U / min / 2.000 × g).
6. Legen Sie das Rohr in den Thermocycler und führen Sie das Lyseprogramm aus, das in Schritt 3.1 eingestellt ist.
7. Wenn das Programm abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz und legen Sie es auf Eis. 2 μL der Neutralisationslösung aus dem Kit in die Mischung geben. Mischen durch Pipettieren.
8. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz bei Raumtemperatur (2-3 s, ≤6.000 U/min/2.000 × g).
9. Verwenden Sie die Lyse direkt für die PCR oder lagern Sie sie bei 4 °C oder −20 °C für die zukünftige Verwendung.
   HINWEIS: Die extrahierte DNA ist bei 4 °C oder -20 °C für mindestens 6 Monate stabil⁷.

4. PCR-Reaktion

HINWEIS: Eine nachgelagerte Anwendung dieser Wurmlysetechnik, die eine Deletionsmutation mit einer schnellen Polymerase nachweist, wird beschrieben. Die Wirksamkeit der beiden Wurmlyseprotokolle bei der Herstellung genomischer Vorlagen-DNA für eine erfolgreiche PCR bei Verdünnungen auf 1/50^eines Wurms pro Reaktion ist ebenfalls nachgewiesen.

1. Extrahieren Sie DNA aus einem einzelnen Wurm und 16 Würmern unter Verwendung von Wildtyp-N2- und Mutantenstämmen, wie oben in Schritt 2 und Schritt 3 beschrieben.
2. Bereiten Sie 2-, 10-, 20- und 50-fache Verdünnungen von Single-Worm-DNA von Wildtyp-N2-Tieren vor.
3. Richten Sie PCR-Reaktionen nach dem Protokoll des Herstellers unter Verwendung von Primern ein, die für die interessierende Sequenz und den Hot-Start-PCR-Master-Mix spezifisch sind (Tabelle 1 und Tabelle 2). Verwenden Sie 1 μL unverdünnte DNA oder 2 μL verdünnte DNA als Vorlage für jede Reaktion.
4. Bestätigen Sie die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese und Bildgebung¹¹.

Genomische DNA von einem einzelnen oder wenigen Wildtyp-Erwachsenen wurde mit dem kommerziellen Kit oder dem traditionellen Lyseprotokoll extrahiert, um die Wirksamkeit dieser beiden Methoden zu vergleichen. Diese Lysate wurden dann als Vorlagen für die PCR verwendet, um entweder ein größeres Ziel von ~ 2.100 bp (Kodierung von blmp-1) oder ein kleineres Ziel von ~ 500 bp (Kodierung eines Teils von sma-10) zu verstärken. Beide Methoden lieferten erfolgreich geeignete PCR-Produkte (Abbildung 1A).

Als nächstes wurde die Fähigkeit der Kit-extrahierten genomischen DNA demonstriert, als Vorlage für eine Vielzahl von DNA-Polymerasen zu dienen. Die extrahierte genomische DNA wurde als Vorlage für die Amplifikation eines 0,5 kb-Produkts unter Verwendung von vier Polymerasen verwendet, die unterschiedliche Fähigkeiten besitzen (einschließlich Geschwindigkeit, Wiedergabetreue und Produktgröße). Produkte der erwarteten Größe wurden durch diese Polymerasen unter Verwendung von Schablonen aus einer Lyse bei Einzelerwachsenen oder einer Lyse bei neun Erwachsenen erzeugt (Abbildung 1B). Die Template-Sequenz und Treue der PCR-Polymerasen zur korrekten Amplifikation der Template-Sequenz kann durch Sequenzierung bestätigt werden (Supplemental Figure S1). Dieses Ergebnis zeigt, dass die aus den Kit-Protokollen extrahierte genomische DNA eine geeignete Vorlage für eine Reihe von Polymerasen liefert.

Die PCR-Wirksamkeit wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen der genomischen DNA getestet, die mit dem kommerziellen Kit von einem einzelnen Tier extrahiert wurden. Die DNA wurde um das 2-, 10-, 20- oder 50-fache verdünnt, und das Äquivalent von etwa der Hälfte, einem Zehntel, einem Zwanzigstel und einem Fünfzigstel eines Wurms pro Reaktion wurde für PCRs verwendet. Diese DNA-Template-Konzentrationen unterstützten die Amplifikation entweder eines größeren Targets von ~2,1 kb oder eines kleineren Targets von ~0,5 kb (Abbildung 1C)12. Während eine DNA-konzentrationsabhängige Ausbeute des 0,5 kb PCR-Produkts beobachtet wurde, erschien die 2,1 kb PCR-Produktausbeute in allen Reaktionen äquivalent.

Um zu zeigen, dass diese Protokolle genomische DNA aus C. elegans produzieren, die für die PCR-Genotypisierung geeignet ist, wurde genomische DNA aus einzelnen und 16 Wildtyp- und blmp-1-Funktionsverlustmutanten extrahiert (blmp-1 (tm548)). Das blmp-1-Gen kodiert für einen Transkriptionsfaktor mit wichtigen Rollen bei der Migration von distalen Spitzenzellen, der Körpergröße und der Entwicklung 12,13,14,15,16. Die blmp-1-Mutante hat eine 810-bp-Löschung, die Teile von Exon 3 und Intron 315 entfernt. Es wurden Primer entwickelt, die zu einem 2.134-bp-Produkt führen, wenn die Wildtyp-DNA-Vorlage verwendet wird, und zu einem 1.324-bp-Produkt, wenn blmp-1 (-) DNA verwendet wird. PCR-Produkte der entsprechenden Größen wurden unter Verwendung von 1 μL entweder Einzelwurm (etwa 0,5 Würmer pro Reaktion) oder 16-Wurm-Lyse von L4-stapierten Tieren (3,5 Würmer pro Reaktion) nachgewiesen (Abbildung 1D). Dieses Ergebnis zeigt, dass Kit-extrahierte genomische DNA, die eines der beiden Protokolle verwendet, gleichermaßen wirksame Vorlagen für die PCR wie für Genotyplinien liefert.

Diese Ergebnisse zeigen, dass C. elegans genomische DNA-Präparate mit einem kommerziellen Gewebe-DNA-Extraktionskit von einzelnen und mehreren Tieren zuverlässig als Vorlagen für die PCR verwendet werden können.

Abbildung 1: DNA-Präparate mit einem kommerziellen Kit aus einzelnen Nematoden und mehreren Nematoden ermöglichen eine robuste Amplifikation durch PCR. PCR-Produkte wurden auf 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer (5 μL (A,B) oder 10 μL (C,D) geladen und mit 90-100 V für 30 min bis 2 h betrieben. Für alle Gele wurde eine 2-log-DNA-Leiter verwendet. (A) Vergleich der DNA-Lyse nach Kit mit traditionellen Proteinase-K-Methoden, um eine Vorlage unter Verwendung von zwei Primer-Sets zu erstellen. Wildtyp-Erwachsene wurden lysiert, und das Äquivalent eines Tieres wurde als Vorlage für alle Reaktionen verwendet. Bahnen 1-4, 2.1 kb Produkt. Lane 1, PCR aus Einzelwurmlyse durch Proteinase K. Lane 2, PCR aus Einzelwurmlyse nach der Kit-Methode. Lane 3, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse durch Proteinase K. Lane 4, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse nach der Kit-Methode. Bahnen 5-8, 0,5 kb Produkt. Lane 5, PCR aus Einzelwurmlyse durch Proteinase K. Lane 6, PCR aus Einzelwurmlyse nach der Kit-Methode. Lane 7, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse durch Proteinase K. Lane 8, PCR aus Neun-Wurm-Wurmlyse nach der Kit-Methode. (B) Die Kit-Methode für die DNA-Lyse bietet eine geeignete Vorlage für die PCR durch mehrere Polymerasen. Wildtyp-Erwachsene wurden mit der Kit-Methode lysiert, und das Äquivalent einer Hälfte eines Tieres wurde als PCR-Vorlage für ein 0,5 kb-Produkt verwendet. Einzelheiten zur Polymerase finden Sie in der Materialtabelle . Lane 1, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeitspolymerase. Lane 2, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeitspolymerase. Lane 3, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer Taq-Polymerase . Lane 4, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer Taq-Polymerase . Lane 5, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer High-Fidelity-Polymerase. Lane 6, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer High-Fidelity-Polymerase. Lane 7, PCR aus einer Single-Worm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeits-High-Fidelity-Polymerase. Lane 8, PCR aus einer Neun-Wurm-Lyse mit einer Hochgeschwindigkeits-High-Fidelity-Polymerase. (C) Verdünnungen einer Wildtyp-L4-Wurmlyse liefern eine Vorlage für die PCR. Bahnen 1-5, 2.1 kb Produkt. Bahnen 6-10, 0,5 kb Ziel. Bahn 1 und Bahn 6, unverdünnte DNA. Bahn 2 und Bahn 7, 2-fach verdünnte DNA. Bahn 3 und Bahn 8, 10-fach verdünnte DNA. Bahn 4 und Bahn 9, 20-fach verdünnte DNA. Bahn 5 und Bahn 10, 50-fach verdünnte DNA. (D) Genotypisierung des blmp-1-Locus mittels PCR unter Verwendung von 1 μL Einzel- und 16-Wurm-DNA-Präparaten als Vorlage. Lane 1, PCR aus Wildtyp-Single-Worm-Lyse. Lane 2, PCR aus blmp-1(-) Single-Worm-Lyse . Lane 3, PCR aus Wildtyp-16-Wurm-Lyse. Lane 4, PCR von blmp-1(-) 16-worm lysis. Abkürzungen: prep = Zubereitungsmethode; kb = Kilobasis; St. = Nematodenstadium; dil. = Verdünnung der DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Liste der Primer

Tabelle 2: PCR-Reaktionskomponenten.

Ergänzende Abbildung S1: Sequenzierung zur Bestätigung der Qualität genomischer DNA, die mit einem kommerziellen Kit hergestellt wurde. Die Ergebnisse von zwei Sequenzierungsreaktionen stimmen vollständig mit der erwarteten Sequenz von über 1.600 DNA-Nukleotiden überein, die durch eine Hochgeschwindigkeits-High-Fidelity-Polymerase (Pol E) aus einer 16-Wurm-Lyse amplifiziert wurden (Tabelle 1, Tabelle 2A und Tabelle 2D). Sequenzierungsleseenden wurden getrimmt, um Basislesevorgänge von geringer Qualität zu entfernen. Die Ausrichtung erfolgte mit dem EMBL-EBI Multiple Sequence Alignment Tool MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.