Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kombinere humane organoider og organ-on-a-chip-teknologi for å modellere tarmregionspesifikk funksjonalitet

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Biopsi-avledede tarmorganoider og organ-on-a-chips-teknologier kombineres til en mikrofysiologisk plattform for å rekapitulere regionspesifikk tarmfunksjonalitet.

Abstract

Tarmslimhinnen er en kompleks fysisk og biokjemisk barriere som oppfyller et mylder av viktige funksjoner. Det muliggjør transport, absorpsjon og metabolisme av næringsstoffer og xenobiotika samtidig som det letter et symbiotisk forhold til mikrobiota og begrenser invasjonen av mikroorganismer. Funksjonell interaksjon mellom ulike celletyper og deres fysiske og biokjemiske miljø er avgjørende for å etablere og opprettholde intestinal vevshomeostase. Modellering av disse komplekse interaksjonene og integrert tarmfysiologi in vitro er et formidabelt mål med potensial til å forandre måten nye terapeutiske mål og legemiddelkandidater oppdages og utvikles på.

Organoider og Organ-on-a-Chip-teknologier har nylig blitt kombinert for å generere human-relevante tarmbrikker som er egnet for å studere de funksjonelle aspektene ved tarmfysiologi og patofysiologi in vitro. Organoider avledet fra biopsiene i den lille (tolvfingertarmen) og tykktarmen blir sådd inn i det øverste rommet av en organbrikke og deretter vellykket utvidet som monolag samtidig som de opprettholder de distinkte cellulære, molekylære og funksjonelle egenskapene til hver tarmregion. Humane tarmvevsspesifikke mikrovaskulære endotelceller inkorporeres i bunnrommet av organbrikken for å gjenskape epitel-endotelgrensesnittet. Denne nye plattformen letter luminal eksponering for næringsstoffer, stoffer og mikroorganismer, noe som muliggjør studier av tarmtransport, permeabilitet og vert-mikrobe-interaksjoner.

Her er det gitt en detaljert protokoll for etablering av tarmflis som representerer det humane tolvfingertarmen (tolvfingertarmbrikke) og kolon (kolonbrikke), og deres påfølgende kultur under kontinuerlig strømning og peristaltikklignende deformasjoner. Vi demonstrerer metoder for å vurdere legemiddelmetabolisme og CYP3A4-induksjon i tolvfingertarmbrikke ved bruk av prototypiske induktorer og substrater. Til slutt gir vi en trinnvis prosedyre for in vitro-modellering av interferon gamma (IFNγ)-mediert barriereforstyrrelse (lekk tarm syndrom) i en tykktarmsbrikke, inkludert metoder for å evaluere endring av paracellulær permeabilitet, endringer i cytokinsekresjon og transkriptomisk profilering av cellene i brikken.

Introduction

Tykktarmen er et komplekst og multitasking organ som er i stand til selvregenerering. Det er delt inn i tynn- og tyktarmen. Tynntarmens primære funksjon er å fordøye maten som kommer fra magen, absorbere alle næringsstoffene og sende resten videre til tyktarmen, som gjenoppretter vannet og elektrolyttene. Tynntarmen er videre delt inn i flere anatomisk distinkte regioner: tolvfingertarmen, jejunum og ileum, som hver er tilpasset for å utføre spesifikke funksjoner. For eksempel bidrar tolvfingertarmen til å bryte ned chymen (mageinnholdet) for å muliggjøre riktig absorpsjon av næringsstoffer som involverer proteiner, karbohydrater, vitaminer og mineraler i jejunum. Denne proksimale delen av tynntarmen er også hovedstedet for intestinal legemiddelabsorpsjon og metabolisme, og den er preget av det høyere uttrykket av legemiddelmetaboliserende enzymer (f.eks. CYP3A4) sammenlignet med deres uttrykk i ileum og kolon1. I tillegg til hovedrollen i å fordøye og absorbere næringsstoffer, er tarmen også en effektiv barriere mot potensielt skadelig luminalt innhold, som patogene mikroorganismer, mikrobielle metabolitter, diettantigener og toksiner 2,3. Det er bemerkelsesverdig at den menneskelige tykktarmen er bebodd av et stort antall mikroorganismer, som langt overstiger det totale celler i menneskekroppen, noe som gir mange fordeler for ernæring, metabolisme og immunitet. Derfor er vedlikehold av integriteten til slimhinnebarrieren dannet av tarmepitelceller avgjørende for å tillate det symbiotiske forholdet mellom tarmmikrobiotaen og vertscellene ved fysisk å skille dem for å unngå unødvendig immuncelleaktivering2. I tillegg spiller programmert tarmcelledød en viktig rolle som en selvbeskyttende mekanisme som hindrer infiserte celler i å vedvare eller proliferere - og dermed spre potensielle patogener3 - mens kontinuerlig selvfornyelse av tarmepitel hver fjerde til syv dager kompenserer for celletapet som sikrer barriereintegritet og vevshomeostase. Svekkelser av beskrevne tarmfunksjoner, inkludert næringsopptak, barriereintegritet eller ubalanse i tarmcelledød og selvfornyelse, kan føre til utvikling av en rekke gastrointestinale sykdommer, inkludert underernæring og inflammatorisk tarmsykdom (IBD)2,3.

Tidligere har dyremodeller og transformerte kreftavledede tarmcellelinjer blitt brukt til å studere de fysiologiske og patofysiologiske funksjonene til humant tarmvev. Imidlertid fremhevet stadig mer fremtredende bekymringer om oversettbarheten av dyreforsøk til mennesker, forårsaket av tilstedeværelsen av betydelige forskjeller mellom de to artene, et behov for menneskerelevante alternative metoder4. De mest brukte in vitro tarmcellelinjene inkluderer T84, Caco-2 og HT29 celler. Mens de etterligner visse aspekter av tarmbarrierefunksjonen og membrantransporten, er de preget av et endret uttrykk for legemiddelmetaboliserende enzymer5, overflatereseptorer og transportører4. I tillegg mangler de tarmsegmentspesifisitet og klarer ikke å rekapitulere kompleksiteten til tarmepitelet, med hver modell som bare inneholder en av de fem epitelcelletypene som er tilstede i tarmen6.

Nylig ble humane intestinale organoidkulturer etablert fra ferske biopsier i tynntarmen og kolon 7,8 eller induserte pluripotente stamceller (iPSC)9 introdusert som alternative eksperimentelle modeller med potensial til å utfylle, redusere og kanskje erstatte dyreforsøk i fremtiden. Mens iPSCs kan oppnås på en ikke-invasiv måte, krever etablering av organoider fra iPSCs bruk av komplekse og lange protokoller (med flere eksperimentelle trinn) og genererer kulturer som ligner menneskelig fostervev. I motsetning til dette er biopsi-avledede organoider svært skalerbare, da de kan utnytte den iboende fornyelseskapasiteten til tarmvev og kan passeres på ubestemt tid og forplantes in vitro. Det er viktig at biopsi-avledede organoider opprettholder sykdommen og tarmregionspesifikke egenskaper av det primære vevet som de ble utviklet fra og etterligner det cellulære mangfoldet i tarmepitelet. Organoider kan brukes som pasientspesifikke avatarer in vitro for å avdekke biologien og patogenesen til ulike gastrointestinale sykdommer og forbedre deres terapeutiske behandling. Selv om tarmorganoider har oppnådd en imponerende grad av fysiologisk funksjonalitet, klarer de fortsatt ikke å reprodusere kompleksiteten til de innfødte organene på grunn av deres mangel på kritiske stromale komponenter - inkludert blodkar, bindevev, perifere nerver og immunceller - samt mekanisk stimulering. Mekaniske parametere, som strømning, skjærspenning, strekk og trykk, er kjent for å påvirke vevsmorfogenese og homeostase in vivo og ble tidligere vist å forbedre modning av celler in vitro 10,11,12,13. En ekstra viktig ulempe ved organoidsystemer er utilgjengeligheten av lumen og dermed til den apikale siden av epitelet. Dette gir en utfordring for å undersøke ulike mekanismer knyttet til det polariserte uttrykket av ion- og legemiddeltransportører, vertsmikrobiom-interaksjoner og farmasøytisk toksisitetstesting. Til slutt lider organoidkulturer av betydelig variasjon i størrelse, morfologi og funksjon, på grunn av den stokastiske naturen til in vitro selvorganiseringsprosessen og celleskjebnevalgene. Derfor, for å realisere det fulle potensialet til tarmorganoider i sykdomsmodellering, narkotikascreening og regenerativ medisin, er det nødvendig å utforske nye strategier som reduserer variasjonen i organoidutvikling, forbedrer tilgangen til luminalrommet og innlemmer manglende celle-celle-interaksjoner.

Organ-on-a-Chip-teknologi har introdusert mange teknikker for inkorporering av mekaniske krefter og væskestrøm til tarmcellekulturer in vitro. Men siden de fleste av de første proof-of-concept-studiene har brukt kreftavledede cellelinjer som ikke viste tilstrekkelig cellulært mangfold, har relevansen av disse systemene blitt stilt spørsmålstegn ved. Nylig har vi synergistisk kombinerte tarmorganoider og organ-on-a-chip-teknologi for å innlemme de beste funksjonene i hver tilnærming i ett in vitro-system 14,15,16. Den resulterende tarmbrikken rekapitulerer den multicellulære arkitekturen til tarmepitel, tilstedeværelsen av epitel-endotelvevsgrensesnitt og de mekaniske kreftene til væskestrøm og strekk, noe som muliggjør emulering av organnivåfunksjoner in vitro. I tillegg øker bruken av primære vevsavledede organoider (som kan samples fra forskjellige regioner i menneskets tarm) som utgangsmateriale denne modellens allsidighet, da sjetonger som representerer human tolvfingertarm, jejunum, ileum og kolon kan etableres etter lignende såings- og kulturprosedyrer. Det er viktig at Intestine-Chips muliggjør sanntidsvurdering av: tarmbarriereintegriteten; aktivitet av børstegrensen og stoffskifteenzymer; produksjon av muciner; sekresjon av cytokiner; og interaksjon av tarmceller med patogene og kommensale mikroorganismer, som vist i de tidligere publiserte rapportene. Spesielt når tarmflis ble etablert ved hjelp av organoider generert fra forskjellige individers vev, fanget disse modellene den forventede interdonorvariabiliteten i funksjonelle responser på ulike legemidler og behandlinger. Til sammen åpner sammenslåing av organoider med Organ-on-a-Chip-teknologi døren for mer avanserte, personlige, in vivo-relevante modeller som kan forbedre den fysiologiske relevansen og nøyaktigheten av in vitro-funnene, samt deres ekstrapolering til mennesker. Her presenteres en detaljert protokoll for å etablere tarmbrikken og dens anvendelse i studiene av fysiologiske funksjoner i de to tarmsegmentene: tolvfingertarm og kolon. For det første beskrives metodene for å vurdere aktiviteten til det legemiddelmetaboliserende enzymet CYP3A4 i tolvfingertarmbrikken, samt dets induksjon av prototypiske forbindelser som rifampicin og vitamin D3. For det andre er trinnene som kreves for å modellere "lekk tarm" i kolonbrikken skissert i protokollen, med forstyrrelsen av epitelbarrieren som utføres ved bruk av kjennetegncytokiner som er involvert i patogenesen til IBD. Kort fortalt blir organoider avledet fra humane biopsier forplantet in vitro, utsatt for enzymatisk fordøyelse og introdusert i den øverste kanalen av brikken. I nærvær av kontinuerlig perfusjon med vekstfaktorberikede medier utvikler de seg til et sammenflytende epitelmonolag med 3D-arkitektur og en lett tilgjengelig apikal celleoverflate. Det nederste,"vaskulære" chiprommet er sådd med mikrovaskulære endotelceller isolert fra tynn- eller tyktarmen. Epitelet og endotelet separeres av en porøs strekkbar membran, som letter de parakrine interaksjonene mellom de to vevene, og når de blir utsatt for sykliske deformasjoner, emulerer peristaltikklignende bevegelser av menneskets tarm. Samkulturen opprettholdes under de dynamiske strømningsforholdene som genereres av luminal og vaskulær perfusjon med passende cellekulturmedier. Til slutt beskriver vi mange typer analyser og endepunktanalyser som kan utføres direkte på chip eller fra samplede cellekulturavløp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle cellekulturer skal håndteres med riktig aseptisk teknikk.

De humane tarmorganoidene som ble brukt i denne studien ble hentet fra Johns Hopkins University, og alle metoder ble utført i samsvar med godkjente retningslinjer og forskrifter. Alle eksperimentelle protokoller ble godkjent av Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).

1. Fremstilling av cellekulturreagensene

  1. Forbered det humane organoid vekstmediet etter produsentens instruksjoner (materialtabell) og suppler det med 100 μg / ml primocin.
  2. Forbered humant mikrovaskulært endotelcellevekstmedium etter produsentens instruksjoner (materialtabell) og suppler med 1:20 vol / vol FBS og 50 μg / ml i stedet for 100 μg / ml primocin.
  3. Resuspend Y-27632 (Rho-kinase Inhibitor) i steril 0,1% BSA i DPBS for å forberede en 10 mM lagerløsning. Aliquot i sterile mikrorør og lagre ved -20 ° C i opptil 6 måneder.
  4. Resuspend CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor) i sterilt dimetylsulfoksid (DMSO) for å fremstille en 5 mM stamløsning. Aliquot i sterile mikrorør og lagre ved -20 ° C i opptil 6 måneder.
  5. Forbered den humane organoid fordøyelsesløsningen ved å blande en 1: 1 vol / vol organoids dissosiasjonsløsning (materialtabell) med DPBS-løsning (materialtabell) og supplere den med 10 μM stamløsning av Y-27632. Dette reagenset må gjøres friskt for hver bruk.

2. Kultur av humane intestinale mikrovaskulære endotelceller (HIMECs)

  1. Start HIMEC-kulturen (Materialtabell) 7 dager før du sår den på brikken. Bare HIMEC ved passasje 1-6 kan brukes til chipsåing.
  2. Tilsett 5 ml av festefaktorløsningen (materialtabell) til en T150-kolbe; rug ved 37 °C i 1 min og kast oppløsningen.
  3. Tilsett 19 ml endotelcellevekstmedium forvarmet ved romtemperatur (se trinn 1.2) i kolben.
  4. Tine et frosset hetteglass med HIMEC (2 millioner celler/hetteglass) i et 37 °C vannbad.
  5. Overfør innholdet i hetteglasset til kolben og vugg kolben forsiktig for å fordele cellene jevnt. Plasser kolben i en 37 °C inkubator over natten for å la endotelcellene feste seg.
  6. Erstatt mediet med 20 ml endotelcellevekstmedium forvarmet ved romtemperatur neste dag og deretter hver 3. dag. Kulturer bør nå 90% av samløpet på dagen for cellehøsting for chipeksperimenter.

3. Mikrofabrikasjon og klargjøring av brikken

  1. Få sjetonger fra en kommersiell leverandør (Materialtabell). Pakk ut sjetongene og plasser dem i chipholderen plassert i en firkantet petriskål (materialtabell). Merk forsiden av hver brikkebærer med de eksperimentelle forholdene (figur 1A).
    MERK: Mens den presenterte protokollen er avhengig av bruk av en bestemt kommersielt tilgjengelig chip og instrumentering, er det flere mikrofluidiske enheter som tilbys gjennom forskjellige leverandører, som kan tilby alternative fordeler, men mangler muligheten til å innlemme strekk. I tillegg kan mikrofabrikasjon av Organs-on-Chips utføres "internt" etter prosedyrene beskrevet i Huh et al.21.

4. Aktivering og ECM-belegg av membranen

  1. Fremstilling av aktiveringsløsningen
    1. Ta ER-1- og ER-2-reagensene (materialtabellen) til romtemperatur for å balansere før bruk. ER-1 er lysfølsom og må håndteres i mørket.
    2. Rekonstituer ER-1 i 10 ml ER-2-reagens for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,5 mg/ml og bekreft at ER-1 er fullstendig oppløst.
  2. Aktivering av surface
    1. Skyv forsiktig 50 μL av ER-1-løsningen gjennom begge kanalene på brikken (figur 1A).
    2. Fjern overflødig ER-1-løsning fra overflaten av brikken ved hjelp av en aspirator.
    3. Inspiser sjetongene for å sikre at alle sjetongene har mottatt ER-1-løsningen. Ved luftbobler, introduser mer ER-1-løsning til boblene er helt fjernet.
    4. Inkuber sjetongene inne i UV-lampekammeret (Materialtabell) i 15 minutter. Bekreft at UV-lampen er satt til konsekvent innstilling.
    5. Ta med ER-1-aktiverte brikker tilbake til biosikkerhetsskapet (BSC). Aspirer ER-1-løsningen fra begge kanalene. Vask eventuelle rester av ER-1-løsningen med 200 μL ER-2.
    6. Skyv 200 μL steril Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DBPS) gjennom kanalene (Materialtabell) og la DBPS være i kanalene til neste trinn.
  3. Fremstilling av ekstracellulær matriks (ECM) og membranbelegg
    1. Fremstilling av stamløsninger av ECM-komponenter
      1. Rekonstituer kollagen IV (materialtabell) og fibronektin (materialtabell) ved bruk av vann av steril cellekulturkvalitet (materialtabell) til en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml. Forbered aliquots og oppbevar dem ved -20 ° C til bruk.
    2. Fremstilling av ECM arbeidsløsning for membranbelegg
      1. Klargjør 1,5 ml av hver ECM-løsning for topp- og bunnkanalen for hver 12 spon som skal belegges. ECM-oppløsningen skal alltid tilberedes rett før bruk.
      2. For den øverste kanalen, bland kollagen IV og solubilisert kjellermembranmatrise (BMM) (Materialtabell) i steril kald DBPS ved henholdsvis 200 μg / ml og 100 μg / ml. For bunnkanalen blandes kollagen IV og fibronektin i steril kald DPBS ved henholdsvis 200 μg / ml og 30 μg / ml.
    3. ECM belegg av sjetongene
      1. Aspirer DBPS fra begge kanalene til sjetongene og erstatt med riktig ECM-arbeidsløsning for hver kanal (figur 1A).
      2. Inspiser hver brikke for å sikre at den har mottatt beleggløsningen. I tilfelle luftbobler, skyv gjennom mer beleggløsning til alle boblene er helt fjernet.
      3. Tilsett steril DPBS i sokkelen og legg petriskålen som inneholder chipsen i en inkubator på 37 °C. Inkubere over natten for å la ECM-proteinene danne ioniske bindinger med den aktiverte PDMS-membranen. Om ønskelig kan celler sås når som helst mellom 2 timer og 1 dag etter belegging av sjetongene. Alternativt kan belagte sjetonger lagres ved 4 ° C over natten, etterfulgt av inkubering over natten ved 37 ° C og flissåing.

5. Såing av intestinale mikrovaskulære endotelceller (HIMEC) i bunnen av brikken

MERK: Små intestinale og coloniske HIMECs er seedet i den nederste kanalen i henholdsvis tolvfingertarmen og kolonbrikken.

  1. Forbered sjetonger
    1. Overfør de ECM-belagte sjetongene til BSC. Aspirer forsiktig ECM-belegget fra begge kanalene til sjetongene, og vask deretter begge kanalene med henholdsvis 200 μL organoid vekstmedium og endotelcellevekstmedium.
    2. Oppbevar de vaskede flisene i en 37 °C inkubator til du fortsetter med såing av endotelceller.
  2. Høst endotelcellene
    1. Ta med HIMEC-kulturkolben til BSC og vask med steril DPBS.
    2. Tilsett 3 ml dissosiasjonsløsning til kolben og legg den i 37 ° C inkubatoren i 2 minutter for å tillate fullstendig celleløsning.
    3. Samle cellene i et 15 ml konisk rør og tilsett endotelcellevekstmedier til det når 10 ml. Prøve 15-20 μL av cellesuspensjonen for celletelling. Sentrifuge ved 150 x g i 5 min.
    4. Aspirer supernatanten forsiktig og stopp HIMEC-ene til en tetthet på 8-10 x 106 celler / ml i endotelcellevekstmedier.
  3. Frø endotelceller inn i bunnen av brikken
    1. Ta petriskålen som inneholder chipsene til BSC og fjern forsiktig alt mediet fra bunnkanalen ved hjelp av en pipette på 1000 μL.
    2. Introduser 10-15 μL av HIMEC-fjæringen i bunnen av brikken. Inspiser brikken rett etter såing for å sikre optimal såtetthet (80% -90% av dekningen) og homogen cellefordeling i kanalen (figur 1D). Hvis såtettheten er høyere eller lavere enn forventet eller ujevn, vask kanalen 2x med 200 μL endotelcellevekstmedier og gjenta såprosedyren.
    3. Snu petriskålen umiddelbart etter sådd hver batch med seks sjetonger for å tillate endotelcellefeste til undersiden av PDMS-membranen. Plasser petriskålen i inkubatoren på 37 °C i 30 minutter til 1 time, eller til HIMEC-ene i den nederste kanalen er festet til membranen (figur 1D).
  4. Vask sjetongene
    1. Skyv forsiktig 200 μL endotelcellevekstmedier gjennom bunnkanalinnløpet for å fjerne eventuelle ufestede celler og fylle opp næringsstoffene i media.
    2. Vask bort cellene som ikke festet seg i toppkanalen med 200 μL organoid vekstmedium supplert med 5 μM CHIR99021 og 10 μM Y-27632.
    3. Plasser sjetongene i inkubatoren på 37 °C til du fortsetter til epitelcellesåingen.

6. Såing av organoidfragmenter i den øverste kanalen på brikken

MERK: Organoider isolert fra biopsier fra forskjellige tarmregioner kan dyrkes i tarmbrikken7. Følg prosedyrene beskrevet i Fujii og medarbeidere for isolering av menneskelige tarmkrypter og etablering av organoidkulturer22. Her brukes duodenale og kolonorganoider til å generere henholdsvis tolvfingertarmen og kolonflisene. Gitt den høye batch-til-batch og donor-til-donor-variasjonen i organoiddannelse og vekst, foreslås det å utføre en pilotevaluering av celletettheten i organoid suspensjonskulturen (24-brønns plateformat) for å oppnå optimal såtetthet på 8 millioner celler / ml.

  1. Pilotevaluering av celletall/brønn for statisk organoidkultur.
    MERK: Følgende prosedyre er utelukkende for å bestemme antall brønner av organoid suspensjonskultur som kreves for chipsåing. De resulterende enkeltcellene skal ikke brukes til chipsåing.
    1. Aspirer supernatanten forsiktig fra tre brønner på organoidkulturplaten. Tilsett 500 μL iskald BMM-dissosiasjonsløsning (materialtabell) til hver brønn og bruk en plastskrape for å løsne den oppløsede BMM fra plasten.
    2. Samle organoidsuspensjonen i et sterilt konisk rør med lav proteinbinding ved hjelp av en iskald 1000 μL pipette. Rug på is i 60 minutter, bland hvert 15. minutt ved å riste forsiktig på tuben. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    3. Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml Trypsin. Inkubere ved 37 ° C i 30 minutter for å fordøye organoider til enkeltcellenivå og tilsett 10 ml komplett organoid vekstmedium for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    4. Resuspender cellepelleten i 1 ml komplett organoid vekstmedium og tell totalt antall celler ved hjelp av et hematocytometer i henhold til standardmetoder.
  2. Fremstilling av organoidfragmenter og deres såing i brikken
    MERK: Følgende prosedyrer kan brukes til å frø duodenale eller kolonorganoider i den øverste kanalen av brikken. Etableringen av et epitelialt monolag med en in vivo relevant 3D-cytoarkitektur er betinget av tilstedeværelsen av strømning15,23 og vellykket såing av organoidfragmenter.
    1. Aspirer mediet forsiktig fra antall brønner i den statiske organoidkulturen, som er tilstrekkelig, som bestemt i trinn 6.1, for å oppnå endelig såtetthet på 8 millioner celler/ml. Tilsett 500 μL iskald BMM dissosiasjonsløsning til hver brønn.
    2. Løsne den solubiliserte BMM fra overflaten av brønnene ved hjelp av en plastskrape eller 1000 μL pipette. Samle suspensjonen i et 15 ml konisk rør med lav proteinbinding.
    3. Oppbevar suspensjonen på is i 60 minutter, bland hvert 15. minutt ved å riste forsiktig på røret. Fortsett til sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. En veldefinert organoidpellets skal være synlig etter sentrifugering. Hvis et gjennomsiktig gellag observeres over cellepelleten (rester av solubilisert BMM) (figur 1B), fortsett med følgende trinn.
      1. Bland supernatanten og cellepelleten og tilsett et likt volum BMM-dissosiasjonsløsning i røret. Bland forsiktig og oppbevar på is i ytterligere 10 minutter, og fortsett til sentrifugering ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      2. Gjenta om nødvendig trinn 6.2.3.1 til det ikke foreligger solubiliserte BMM-rester.
    4. Kast supernatanten og resuspender organoidpelleten med organoid fordøyelsesløsning (se trinn 1.5). Bruk et tilstrekkelig volum organoid fordøyelsesløsning for å sikre fullstendig nedsenking av pelleten. 2 ml oppløsning er egnet for ca. 2 400-12 000 mellomstore organoider (figur 1D, ettersåing). Rug ved 37 °C i 1-3 min.
    5. Legg avansert DMEM / F-12 til røret for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Bruk fire ganger volumet av fordøyelsesløsningen som brukes. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Aspirer supernatanten og resuspender organoidfragmentene i et komplett organoid vekstmedium supplert med 5 μM CHIR99021 og 10 μM Y-27632 for å oppnå 8 millioner celler / ml. Klargjør 360 μL aliquots av suspensjonen i sterile 1,5 ml rør med lav proteinbinding for å forhindre reduksjon av celletetthet på grunn av festing på veggene.
    7. Fjern mediet fra den øverste kanalen til de belagte sjetongene. Tilsett 30 μL cellesuspensjon i toppkanalen til hver brikke. Inkuber sjetongene over natten i en 37 ° C inkubator for å la organoidfragmentene feste seg til den ECM-belagte membranen (figur 1D).

7. Dynamisk kultur av tarmbrikke - initiering og vedlikehold av strømning og peristaltikklignende bevegelser

  1. Medieforberedelse og avgassing
    1. For å opprettholde konstant laminær strømning gjennom brikken, la medietemperaturen likevektes til romtemperatur, og utsett den deretter for vakuumdrevet filtrering i 10 minutter ved hjelp av en vakuumpumpe og PVDF-filterkoniske rør (medieavgassing).
  2. Grunning av bærbare moduler
    MERK: Bærbare moduler er reservoarer som fungerer som et grensesnitt mellom sjetongene og kulturmodulen, noe som muliggjør gjentatt prøvetaking og dosering av media.
    1. Åpne de bærbare modulene, i BSC, og plasser dem på kulturmodulbrettene, som er spesialiserte beholdere for justering av de bærbare modulene.
    2. Tilsett 3 ml ferdig organoid vekstmedium supplert med 5 μM CHIR99021 og 10 μM Y-27632 til det øverste innløpsreservoaret og 3 ml pre-likevektet endotelcellevekstmedium i det nederste innløpsreservoaret (figur 1C). Tilsett 300 μL av samme medium i de respektive utløpsreservoarene.
    3. Ta skuffene med til inkubatoren på 37 °C og skyv dem inn i kulturmodulen (figur 1C). Bruk kontroller på skjermen til kulturmodulen for å kjøre "Prime Cycle" (1 min lang). Når statuslinjen indikerer "Klar", er Prime Cycle fullført. Gjenta Prime Cycle for å sikre at det har dannet seg tilstrekkelige dråper for vellykket tilkobling av sjetongene.
    4. Forsikre deg om at alle bærbare moduler er primet og har synlige mediedråper.
  3. Innføring av flyt
    MERK: Strømning initieres vanligvis 24 timer etter sådd av organoidfragmenter for å tillate tarmepitelceller å feste seg fast til membranen.
    1. Vask begge kanalene til de seedede sjetongene med 200 μL av det respektive mediet for å fjerne bobler eller celleavfall. La små dråper med media ligge på portene etter vasken. Skyv brikkebæreren inn i den bærbare modulen (figur 1C).
    2. Plasser de bærbare modulene på skuffene, og deretter inn i kulturmodulen. Bruk kontrollene på skjermen til kulturmodulen for å programmere passende organbrikkekulturforhold (strømningshastighet og strekk).
      MERK: For standard tolvfingertarm og kolonbrikkekulturforhold, sett strømningshastigheten til henholdsvis 30 μL / t15 og 60 μL / t16 , for både topp- og bunnkanalene. Strømningshastighetene for hver kanal styres imidlertid uavhengig og kan stilles inn mellom 0-1000 μL/t. Sprøyte eller peristaltiske pumper kan brukes, i stedet for kulturmoduler som presenteres her, for å introdusere laminær strømning til mikrofluidiske chips. Etablering av pålitelige fluidiske forbindelser mellom spon og pumper ved hjelp av rør og kontakter kan imidlertid være teknisk utfordrende når samtidig perfusjon av flere brikker er nødvendig.
    3. Start "Regulate Cycle" (2 timer lang) som presser kulturmediet i bærbar modul og chip for å forhindre kjernedannelse av luftboblene. Programmerte forhold vil gjenopptas etter at reguleringssyklusen er fullført.
  4. Medieendring
    1. Forbered ferske medier for begge kanalene og fyll dem hver 48. time ved å tilsette 2 ml ferskt medium til innløpsreservoarene (figur 1C).
    2. Sett kulturmodulene på pause og ta skuffene med til BSC. Aspirer media i alle reservoarene og fyll på med ferske medier. Ta skuffene tilbake og start strømmen på nytt.
  5. Innføring av strekk
    MERK: La cellene vokse til 100% sammenløp før påføring av syklisk belastning. Stretch er vanligvis introdusert 3 dager etter såing eller 48 timer etter initiering av fluidisk kultur. 2% syklisk belastning ved frekvensen 0, 2 eller 0, 15 Hz, for henholdsvis tolvfingertarmen11 og kolon24 tarmbrikke, påføres for de første 24 timene. Det økes deretter ytterligere til 10 % for den gjenværende varigheten av tarmbrikkekulturen for å ligne den sykliske stammen som oppleves av tarmepitelceller in vivo (figur 1D)25. Kulturmodulen kan støtte bruk av 2% -12% syklisk belastning og frekvens på opptil 0,4 Hz.
    1. For å introdusere strekk til den pågående fluidiske kulturen, pause kulturmodulen. Bruk kontroller på skjermen til å endre strekkinnstillingene til 2 % strekkfrekvens, frekvens på 0,2 eller 0,15 Hz, og start kulturmodulen på nytt.
    2. Etter 24 timer gjentar du trinn 7.5.1 for å bruke en 10 % strekkfrekvens, 0,2 eller 0,15 Hz.

8. CYP450-induksjon ved bruk av prototypiske CYP-induktorer i tolvfingertarmen

MERK: Cytokrom P450 (CYP450)-induksjonsanalysen gjør det mulig å vurdere om testforbindelsen øker mRNA-nivåene og/eller katalytisk aktivitet av spesifikke CYP450-enzymer. Her beskriver vi protokollen for evaluering av CYP3A4-induksjon etter industristandard og regulator anbefalte in vitro CYP-induktorer, Rifampicin (RIF) og 1,2-dihydroksyvitamin D3 (VD3). Den presenterte metoden kan brukes til å identifisere potensialet til forskjellige testforbindelser for å indusere forskjellige isoformer av CYP450 i humant tarmvev. Spesifikke sett med primere og sondesubstrat må velges for hver enzymisoform som skal evalueres.

  1. Eksponering for CYP-induktorer
    1. Forbered lagerløsninger på 20 mM RIF, 100 mM VD3 og 200 mM testosteron (materialtabell) ved bruk av steril DMSO.
      FORSIKTIG: Testosteron er et Schedule III kontrollert stoff. Følg regulatoriske prosedyrer under håndtering.
    2. Klargjør doseringsmedier med CYP-induktorer ved å fortynne stamløsningene i komplett organoid vekstmedium og endotelcellevekstmedium for å oppnå 20 μM RIF, 100 nmol/l VD3. Forbered kjøretøykontroll ved å fortynne DMSO i de respektive mediene for å oppnå 0.1% av DMSO.
    3. Sett kulturmodulen på pause og sett skuffene til BSC. Bytt ut mediet i alle innløpsreservoarene med 2 ml doseringsmedier med induktorer eller kjøretøykontroll. Returner de bærbare modulene tilbake til kulturmodulen og start strømmen på nytt ved 30 μL/t.
    4. Etter 24 timer bytter du ut mediet med induserende oppløsning og gjentar trinn 8.1.2-8.1.3. Induserende løsninger bør tilberedes fersk daglig og etterfylles hver 24. time i løpet av forsøket, som vanligvis er 48-72 timer lang.
  2. Inkubasjon med et prototypisk substrat (testosteron)
    1. På innhøstingsdagen klargjør du probesubstratløsningen av testosteron sammen med tilsvarende induktorer i Advanced DMEM/F12 for å gi en endelig konsentrasjon på 200 μM. Utelat tilsetningen av serumet til media, da dette kan forstyrre LCMS-analysen.
    2. Ta brettene til BSC, og aspirer doseringsmediet fra alle reservoarene. Vask og erstatt topp- og bunninnløpsreservoarene med varmt henholdsvis avansert DMEM/F12 medium og endotelcellevekstmedium.
    3. Fjern vaskemediet fra reservoarene og erstatt det med 1 ml sondesubstratløsning, fremstilt i trinn 8.2.1. Perfuser sjetongene med en høy strømningshastighet på 1000 μL / t i 5 minutter og aspirer både topp- og bunnutløpsreservoarer. Returner sjetongene til kulturmodulen og inkuber i 1 time under konstant strømning på 300 μL / t.
  3. Analyse av data
    1. Eksempelsamling for LCMS-analyse
      1. Aliquot 200 μL stoppoppløsning inneholdende acetonitril med 0,1 % maursyre i forhåndsmerkede 1,5 ml rør og legg dem på is. Sammensetningen av LCMS stoppløsning kan variere basert på substratet som må analyseres.
      2. Etter at 1 time behandling er fullført, stopp strømmen og bring skuffene tilbake til BSC. Samle 100 μL avløp fra det øverste utløpsreservoaret, og legg det til det tilsvarende røret som inneholder stoppoppløsningen (figur 2A). Plasser rørene umiddelbart på tørris. Oppbevar prøvene ved -80 °C før du går videre til analyse.
      3. Ekstraher og analyser prøver ved hjelp av enten HPLC eller LC-MS / MS teknikker, overvåke dannelsen av metabolitt-6β-hydroksytestosteron (6β-OH-T). CYP-enzymaktivitet kan uttrykkes som pmol/min/mg protein der pmol refererer til mengden metabolitt (6β-OH-T) dannet under reaksjonen. Totalt proteininnhold per brikke (protein; mg) bestemmes ved å utføre en Bradford-analyse beskrevet i trinn 8.3.2.
        Equation 1
        Foldeinduksjonsaktiviteten beregnes ved: CYP-aktivitet (indusert) / CYP-aktivitet (kjøretøy).
      4. Hvis du samler prøver for mRNA-analyse, se trinn 8.3.3.
    2. Lysis av cellene for proteinuttrykksanalyse
      MERK: Proteinekstraksjon fra celler på brikken utføres ved hjelp av en proteinlysebuffer, supplert med protease- og fosfatasehemmere (Materialtabell). Ekstrahert protein kvantifiseres deretter ved hjelp av Bradford-analysen og brukes i nedstrømsanalyse.
      1. Løsne sjetongene fra bærbare moduler og legg dem i en petriskål. Vask begge kanalene med 200 μL steril DPBS.
      2. Blokker bunnkanaluttaket med en pipettespiss på 200 μL filter. Fyll 50 μL av dissosiasjonsoppløsningen gjennom bunnkanalen og inkuber i 2 minutter ved romtemperatur.
      3. Inspiser for å bekrefte fullstendig løsrivelse av endotelceller. Pipette opp og ned 1-2 ganger og fjern dissosiasjonsoppløsningen fra kanalen. Gjenta vasken.
      4. Blokker toppkanaluttaket med en pipettespiss på 200 μL filter. Tilfør 75 μL proteinlysebuffer gjennom toppkanalen. La pipettespissen sitte inn for å blokkere det øverste kanalinnløpet og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Pipette opp og ned 5-10 ganger og samle cellelysatene i et forhåndsmerket 1,5 ml rør.
      5. Gjenta trinn 8.3.2.4. til fullstendig løsrivelse av celler blir observert. Samle cellelysatene i det samme 1,5 ml røret og oppbevar dem ved -80 °C til analyse.
      6. Trekk ut proteinfraksjonen i henhold til standardmetoder og kvantifiser totalt protein ved hjelp av Bradford-analysen (Materialtabell).
    3. Lysis av cellene for genuttrykksanalyse
      MERK: On-chip cellelyse for RNA-ekstraksjon kan oppnås ved bruk av en RNA-lysisbuffer, supplert med 0,1% 2-merkaptoetanol (Materialtabell). Alternativt kan en fenolbasert RNA-lysisbuffer brukes hvis det kreves høye utbytter av høykvalitets RNA egnet for NGS- og mikromatriseanalyse.
      1. Følg trinn 8.3.2.1 til 8.3.2.2 for å forberede tarmbrikken for lysis.
      2. Blokker utløpet til toppkanalen ved hjelp av en pipettespiss på 200 μL filter. Tilfør 150 μL RNA-lysisbuffer gjennom toppkanalen. La pipettespissen være satt inn for å blokkere innløpet til den øverste kanalen. Rug i 2 minutter ved romtemperatur. For lysis ved bruk av en fenolbasert RNA-lysisbuffer, bruk 350 μL av reagenset.
      3. Pipetter opp og ned 5-10 ganger og samle cellelysatene i et forhåndsmerket 1,5 ml rør. Gjenta trinnet med en annen 150 μL RNA-lysisbuffer og samle. Oppbevar cellelysatene ved -80 °C inntil analyse. Ved påfølgende RNA-sekvenseringsanalyse, fortsett med analysen innen 1 måned etter lysing.
      4. Trekk ut totalt RNA fra cellelysatene ved hjelp av et RNA-rensesett.
      5. Omvendt transkribering til cDNA ved hjelp av et revers transkriptasesett og utfør PCR i sanntid ved hjelp av en sanntids PCR-syklist og passende primere og buffer. Kvantifiser resultatene ved hjelp av 2-ΔΔCt-metoden .

9. Forstyrrelse av epitelbarrieren ved bruk av proinflammatoriske cytokiner i tykktarmsbrikke

MERK: Denne protokollen beskriver forstyrrelse av tarmepitelbarrieren av cytokininterferon gamma (IFNγ)26,27,28,29. Cytokinet doseres i den nederste kanalen av tykktarmsbrikken gitt det basolaterale uttrykket av IFNγ-reseptoren på tarmepitelceller.  Den proinflammatoriske stimulansen innføres i brikken på dag 5 av kulturen, så snartP-appen er stabilisert under 0,5 x 10-6 cm/s. Et lignende doseringsregime kan brukes til andre proinflammatoriske cytokiner og barriereforstyrrende midler.

  1. Stimulering med IFNγ
    1. Klargjør en 100 μg / ml stamløsning av IFNγ (materialtabell) i sterilt cellekulturvann. Oppbevar stamløsningen ved -80 °C i løpet av eksperimentet. For hvert eksperiment, bruk alltid en ny bestand av IFNγ og unngå mer enn tre fryse- og tinesykluser.
    2. Klargjør IFNγ doseringsløsning ved fortynning av stamløsning i avgasset endotelcellevekstmedium for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10-100 ng/ml.
    3. Ta skuffene til BSC og fjern mediet fra bunnkanalinntaksreservoarene og erstatt det med 3 ml av det IFNγ inneholdende mediet. Oppdater ifnγ doseringsmediet daglig.
    4. Plasser brettene i kulturmodulen og perfuser sjetongene med en høy strømningshastighet på 1000 μL / t i 5 minutter for å starte IFNγ-behandlingen. Bytt strømningshastigheten tilbake til 60 μL / t og fortsett den fluidiske kulturen.
  2. Analyse av data
    1. Vurdering av epitelbarrierefunksjonen. Den epitheliale tilsynelatende permeabiliteten (Papp), eller barrierefunksjonen, kan måles på ulike tidspunkter for kulturen etter behandling med IFNγ, i avløpsmediene til begge kanalenes innløps- og utløpsreservoarer. Den fluorescerende traceren skal legges til toppkanalorganoid vekstmedium 4 timer før vurdering avP-appen. Vanligvis brukes 3 kDa Dextran Cascade Blue som fluorescerende sporstoff og tilsettes i mediet 24 timer før.
      1. Sett kulturmodulen på pause og sett skuffene til BSC.
      2. Merk og klargjør en 96-brønns svartvegget plate med 100 μL DPBS per brønn. Bruk en 200 μL flerkanalspipette til å samle opp og tilsette 50 μL avløpsvann fra alle reservoarene til de respektive brønnene (figur 2B).
      3. For å klargjøre standardkurven, fortynn mediet som inneholder 100 μg / ml av 3 kDa dextran Cascade Blue 1: 3 i DPBS. Deretter utfører serielle fortynninger ved bruk av en tre ganger fortynning av endotelcellevekstmedium i DPBS.
      4. Les fluorescensen ved 375 nm eksitasjon og 420 nm utslipp ved hjelp av en plateleser. Bruk de målte OD-verdiene til å beregne tilsynelatende permeabilitet (P-app) på følgende måte:
        Equation 2
    2. Immunfluorescensfarging av celler på brikken
      1. Vask med 200 μL DPBS for hver kanal, tre ganger.
      2. Perfuse 200 μL av fikseringsløsningen (4% PFA i DPBS) i hver kanal. Rug i 15 minutter ved romtemperatur.
      3. Gjenta vasketrinnet 9.2.2.1. På dette stadiet kan vasket spon lagres i opptil 7 dager ved 4 °C.
      4. Permeabiliserer cellene ved hjelp av 200 μL permeabiliseringsløsning (0,1% Triton-X 100 i 10% normalt eselserum (NDS) i DPBS) for hver kanal. Rug i 30 minutter ved romtemperatur. Gjenta vasketrinnet 9.2.2.1.
      5. Blokker cellene på brikken ved å bruke 200 μL blokkeringsløsning (10% NDS i DPBS) for hver kanal. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
      6. Fortynn de primære antistoffene i antistoffoppløsning (5% NDS i DPBS) som følger: anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, epitelial tett kryssmarkør), anti-okkludin (1:100, epitelial tett kryssmarkør), anti-Claudin 4 (1:100, epitelial tett kryssmarkør), anti-E-cadherin (1:100, epitelfeste adherens junctions markør (Materialtabell). Tilsett 200 μL av den primære antistoffoppløsningen gjennom hver kanal og inkuber over natten ved 4 °C. Gjenta vasketrinnet 9.2.2.1.
      7. Fortynn de sekundære antistoffene i antistoffoppløsningen (1:300, 5% NDS i DPBS). Tilsett 200 μL av denne løsningen gjennom hver kanal og inkuber i 2 timer ved romtemperatur. Gjenta vasketrinnet 9.2.2.1. Om ønskelig kan phalloidin, en cytoskeletalmarkør, tilsettes den sekundære antistoffoppløsningen.
      8. Forbered en 50 μg / ml på 4′, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) løsning i DPBS og bruk den til å perfuse 200 μL gjennom hver kanal. Rug ved romtemperatur i 15 minutter. Gjenta vasketrinnet. På dette tidspunktet kan farget flis lagres i opptil 14 dager ved 4 °C.
    3. Vurdering av Caspase 3-spaltning
      1. Isoler og kvantifiser den totale mengden protein i epitelceller som beskrevet i trinn 8.3.2. Utelat vasketrinnet 8.3.2.1. Fortynn prøvene med DPBS til en endelig konsentrasjon på 400 mikrogram / ml.
      2. Kvantifiser nivåene av total og spaltet caspase 3 ved hjelp av caspase 3 deteksjonssett etter produsentens protokoll.
    4. Vurdering av proinflammatorisk cytokinsekresjon
      1. Bruk avløpene samlet fra utløpet av begge kanalene i kolonbrikken for å kvantifisere utskilte akuttfase proinflammatoriske cytokiner, etter protokoller levert av produsenten. Utfør en 5 ganger fortynning for V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit og en to ganger fortynning for V-PLEX Human Proinflammatory Panel II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1D oppsummerer tidslinjen for tarmbrikkekulturen og illustrerer tarmens endotelceller og organoider før og ved såing på brikken. Videre demonstrerer den de distinkte morfologiske forskjellene mellom tolvfingertarmen og kolonflisene, fremhevet av tilstedeværelsen av de villi-lignende formasjonene i tolvfingertarmbrikken og representativ for tynntarmsarkitekturen.

Figur 3A,B viser fold CYP3A4-induksjonsresponsen i tolvfingertarmbrikken fra tre forskjellige organoiddonorer. Brikkene ble eksponert for 20 μM RIF eller 100 nM VD3 i 48 timer og ble brukt til å vurdere mRNA-nivåene (A) og/eller foldekatalytisk aktivitet (B) til CYP450-enzymet. Økte nivåer av testosteronmetabolitt, 6β-hydroksytestosteron (6β-OH-T), i samsvar med forhøyet CYP3A4 mRNA-genuttrykk, ble observert i tolvfingertarmbrikken eksponert for RIF og VD3, noe som indikerer passende induksjonsrespons på tvers av alle de tre undersøkte donorene. Midlene ± SEM av n = 3 biologisk uavhengige sjetonger er vist.

Figur 4 viser de representative resultatene for modellering av lekk tarm-syndromet i tykktarmsbrikken, inkludert (A,C) endringer i epitelcellemorfologi og tett kryssintegritet, (B) reduksjon i barrierefunksjonen, (D) induksjon av apoptose og (E) økt cytokinsekresjon som respons på IFNγ-behandlingen.

Figur 4A viser representative lysfeltbilder av kontroll- og IFNγ-behandlede (50 ng/ml, 48 timer) epitelmonolag av kolonbrikken. Brikkene ble fjernet fra kulturmodulen og epitelmorfologien ble vurdert under mikroskopet daglig. Bilder ble anskaffet ved hjelp av et brightfield mikroskop og et 10x mål. Kolon chips behandlet med IFNγ viser en kompromittert celle morfologi og tap av columnar epitel.

Figur 4B viser et representativt resultat av den tilsynelatende permeabilitetsanalysen utført på kolonbrikker dyrket under baselineforhold eller ved stimulering med IFNγ. 3 kDa Dextran Cascade Blue tracer ble lagt til toppkanalreservoaret til en endelig konsentrasjon på 100 μg/ml. IFNγ ved en endelig konsentrasjon på 50 ng/ml ble dosert inn i bunnkanalen på dag 5 av kulturen. Sjetonger ble perfundert ved 60 ml/t. Deretter ble media samlet daglig (opp til dag 72 timer etter eksponering) fra innløps- og utløpsreservoarer i både topp- og bunnkanaler. 50 μL av hver prøve ble samlet inn, behandlet som beskrevet i trinn 9.2.1 i protokollen, og undersøkt for fluorescens ved 375-420 nm ved hjelp av en plateleser. En signifikant økning i epitelial paracellulær permeabilitet ble observert etter 48 timer med IFNγ-stimulering.

Figur 4C viser representative immunfluorescerende bilder av epiteltett stramt (Zonula Occludens 1 - ZO-1, Occludin, Claudin-4) og adherens (E-cadherin) kryss i kontroll og IFNγ-behandlet (50 ng / ml, 48 timer) kolonbrikke. Sjetongene ble festet med 4 % paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved romtemperatur og viderebehandlet som beskrevet i trinn 9.2.2 i protokollen. Bilder ble anskaffet ved hjelp av et konfokalt mikroskop og 20x langdistansemål og behandlet ved hjelp av Fiji versjon 2.0 i henhold til standardprotokoller. Behandling med IFNγ utløser forskyvning av ZO-1 og Claudin-4 og internalisering av okkludin og E-cadherin, som vist ved økt cytoplasmatisk signal.

Figur 4D representerer tidsforløpet for Caspase 3-spaltning i kolonbrikke som respons på 50 ng/ml IFNγ som indikerer aktivering av apoptose. Epitelceller ble tent på sjetongene og proteinprøver ble renset i henhold til standardmetoder. Det intracellulære innholdet av total og spaltet Caspase 3 ble målt som beskrevet i pkt. 9.2.3 i protokollen. IFNγ induserer aktivering av apoptose, som beskrevet tidligere29, i kolonepitelceller dyrket på brikken, etter 48 timers stimulering.

Figur 4E viser tidsforløpet av cytokinets sekresjon fra tykktarmsbrikken ved stimulering med 50 ng/ml IFNγ. 200 μL avløpsvannmedier ble samlet daglig fra utløpsreservoarene i både topp- og bunnkanaler. Avløpsvannprøver ble lagret ved -80 °C og 24 timer før analysen ble tint over natten ved 4 °C. Cytokinnivåene i chipkulturmediene ble vurdert ved hjelp av Meso Scale Discovery-teknologi som beskrevet i trinn 9.2.4 i protokollen. IFNγ induserte en polarisert sekresjon av proinflammatoriske molekyler i kolonbrikken, som vist ved den basolaterale sekresjonen av Vascular Cell Adhesion Protein 1 (VCAM-1) og Interleukin 6 (IL-6) og apikal sekresjon av Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) og Serum Amyloid protein A (SAA). Serumnivåer av de oppløselige formene av VCAM-1, ICAM-1, IL-6 og SAA brukes i kliniske laboratorier som en indikator på betennelse30,31.

Figure 1
Figur 1: Etablering avtarmbrikken 15,16. (A) Skjematisk av sponaktivering og belegg. Kort fortalt plasseres sjetongene i en brikkeholder, perfunderes med ER1-løsning og aktiveres under UV-lys. Deretter vaskes sjetongene med ER2 og DPBS. Til slutt blir sjetongene belagt med en iskald ECM-løsning, spesifikk for hver celletype, og inkubert over natten ved 37 ° C. (B) Skjematisk som viser prosessen med å introdusere organoider i brikken. Organoider overføres fra 24-brønnsplaten til et konisk rør og inkuberes på is i nærvær av BMM-dissosiasjonsløsningen for å gjenopprette organoider fra den solubiliserte BMM. Organoid suspensjon blir deretter sentrifugert og evaluert for tilstedeværelse av solubiliserte BMM-rester. Hvis et gjennomsiktig lag av BMM fortsatt er synlig over cellepelleten, bør prosessen gjentas. Hvis en veldefinert pellet observeres uten synlige gelrester, blir organoider dissosiert enzymatisk og introdusert i toppkanalen (blå) av brikken. Den nederste kanalen (magenta) av brikken er sådd med vevsspesifikke mikrovaskulære endotelceller. (C) Skjematisk som viser tilkoblingen av sjetongene til kulturmodulen, som støtter medieflyt og syklisk peristaltikklignende strekk. Grunningssyklusen muliggjør generering av cellekulturmediumdråpene over chipportene og på slutten av de bærbare modulmotstandene. Dette sikrer opprettelsen av væske-væske-grensesnittet mellom brikken og den bærbare modulen, noe som letter brikken som glir inn i modulen og deres sikre tilkobling. Til slutt plasseres de bærbare modulene i skuffer, og skuffer settes inn i kulturmodulen. (D) Eksperimentell tidslinje som fremhever de viktigste trinnene for etableringen av den biopsi-avledede tarmbrikkeplattformen, inkludert tolvfingertarm og kolonbrikke. Brightfield-bilder illustrerer endotel- og organoidavledede celler på dag 0, før og etter sådd i brikken, samt dannelsen av sammenflytende og 3D-epitelvev på dag 8 av chipkulturen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Samling av avløpsvann fra tarmbrikken. (A) Skjematisk som viser samlingen av medieavløp fra den bærbare modulen. Media samles fra utløpsreservoarene i topp- og bunnkanalen og lagres ved -80 °C inntil videre ELISA- eller LC-MS/LC-MS/MS-analyse. (B) Skjematisk visning av innsamling av avløpsprøver ved hjelp av en flerkanals pipette og overføring til en 96-brønn svartvegget plate for nedstrøms vurdering av epitelial tilsynelatende permeabilitet (Papp). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: CYP3A4-induksjon i tolvfingertarmsbrikke15. (A) Induksjon av CYP3A4 mRNA-nivåer i tolvfingertarmbrikke med 48 timers eksponering for 20 μM RIF og 100 nM VD3. Gjennomsnittlig ± SEM, N = 3 chips/condition/donor, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001 (sammenlignet på tvers av DMSO-kontroller). (B) Induksjon av CYP3A4-aktivitet i tolvfingertarmsbrikken eksponert for prototypiske induktorer vurdert ved LC-MS/MS-kvantifisering av probesubstratmetabolitt: 6β-hydroksytestosteron. En signifikant økning i CYP3A4-aktivitet ble observert i duodenumbrikken behandlet med 20 μM RIF eller 100 nM VD3 i 48 timer. Gjennomsnittlig ± SEM, N = 3 chips/condition/donor, Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Forstyrrelse av epitelbarrieren i kolonbrikken ved bruk av IFNγ16. (A) Brightfield-bilder som viser epitelcellenes morfologi under baselineforhold og ved stimulering med 50 ng/ml IFNγ i 48 timer. Skala bar: 100 μm. (B) Tilsynelatende permeabilitet av epitelbarrieren til 3 kDa Dextran i løpet av en 72 timers stimulering med 50 ng / ml IFNγ. Gjennomsnittlig ± 95 % KI, N = 5-9 chips/tilstand, toveis ANOVA, Tukeys post hoc-test, ****p < 0,0001. (C) Immunfluorescensbilder som viser forstyrrelsen av epitelets tette og adherenskryss ved stimulering med 50 ng / ml IFNγ i 48 timer. Zonula Occludens 1 (ZO-1) (rød) tette kryss, E-cadherin (rød) adherens kryss, Occludin (rød) tette kryss, Claudin-4 (rød) tette kryss, 4 ′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå) kjerner. Skala bar: 50 μm. (D) Induksjon av Caspase 3 spaltning i kolon chip ved behandling med 50 ng / ml IFNγ. Fire forskjellige tidspunkter ble vurdert over 72 timers eksponering. Gjennomsnittlig ± 95% KI, N = 3-6 chips / tilstand, Toveis ANOVA, Tukeys post hoc-test, **** p < 0,0001. (E) Økt sekresjon av cytokiner: Vascular Cell Adhesion Protein 1 (VCAM-1) og Interleukin 6 (IL-6), i den nederste kanalen, og Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) og Serum Amyloid protein A (SAA) i de øverste kanalavløpsmediene, i løpet av en 72 timers stimulering av kolonbrikken med 50 ng / ml IFNγ. Gjennomsnittlig ± 95 % KI, N = 3 chips/tilstand, Toveis ANOVA, Tukeys post hoc-test, *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombinasjonen av organ-on-a-chip-teknologi og tarmorganoider holder løftet for nøyaktig modellering av menneskelig tarmfysiologi og patofysiologi. Her gir vi en enkel og robust trinnvis protokoll (skissert i figur 1) for etablering av tarmbrikken som inneholder biopsi-avledet tynntarms- eller kolonepitel og tarmmikrovaskulære endotelceller dyrket i en mikrofluidisk enhet. Denne chipbaserte simuleringen av menneskets tarm inkorporerer fysiologisk, luminal og vaskulær strømning og peristaltikklignende bevegelser. I tillegg beskriver vi prosedyrer for vurdering av kritiske tarmfunksjoner, som legemiddelomsetning i duodenumbrikken og barrierefunksjon i tykktarmsbrikken.

For å rekapitulere epitel-endoteliale cellulære interaksjoner, som er avgjørende for vedlikehold av tarmhomeostase og dermed nøyaktig modellering av tarmvev på chip, er det avgjørende å etablere funksjonelle og intakte cellemonolag på begge sider av PDMS-membranen. Det første skrittet mot vellykket chipsåing er kjemisk aktivering av PDMS-overflaten som muliggjør utvikling av en stabil kobling mellom PDMS-overflaten og ECM-proteiner. Feil aktivering kan hindre vedlegg av celler og resultere i dannelse av ufullstendige cellulære monolag. Aktiveringsløsningen må tilberedes fersk, da den er lysfølsom og utsatt for nedbrytning. Under UV-aktivering og påfølgende ECM-belegg er det viktig å sikre en jevn fordeling av reagenser innenfor hver kanal. Den spesifikke sammensetningen og konsentrasjonen av løsninger som brukes til å belegge topp- og bunnkanalene, er optimalisert for å dekke behovene til henholdsvis epitel- og endotelceller. Hvis det kreves endringer i cellulær sammensetning av tarmbrikken, kan det hende at ECM-forholdene må optimaliseres på nytt for å oppnå optimale resultater.

Etter ECM-belegg er det viktig å frø HIMEC ved høy cellesåingstetthet (8 x 106 celler / ml) for å oppnå et komplett og homogent monolag på undersiden av PDMS-membranen. Hvis fullcellekonfluens ikke oppnås, sammenløp, anbefales det å ytterligere øke tettheten av endotelcellesuspensjonen under såingen eller å forsinke såingen av organoidfragmenter i chipens øverste kanal til HIMEC blir fullt konfluent. Bruk av fragmenterte organoider, i stedet for suspensjon av enkeltceller oppnådd gjennom enzymatisk fordøyelse av organoider, ble tidligere vist å forbedre suksessen og reproduserbarheten av tarmmonolagsdannelsen i tarmbrikken14. Derfor anbefales det sterkt å nøye overvåke organoid fordøyelsesprosessen for å sikre optimal inkubasjonstid med enzymet som resulterer i organoidfragmenter sammensatt av rundt 10-30 celler (40-100 μm i størrelse). Utilstrekkelig dissosiasjon kan resultere i reformasjon av den cystiske organoidstrukturen i mikrofluidiske chips i stedet for ønsket monolag. I tillegg er det viktig å unngå overdreven organoid dissosiasjon i enkeltceller som kan føre til redusert celleoverlevelse, gjenoppretting og manglende evne til å danne konfluent monolag i brikken.

Inkorporering av væskestrøm (skjærspenning) og syklisk belastning i tarmbrikkekulturen, støttet ved hjelp av kulturmodulen, har vist seg å forbedre dannelsen av den funksjonelle tarmbarrieren og fremme den spontane utviklingen av 3D-arkitekturen til epitelvevet13. Men når du utfører mikrofluidiske eksperimenter med bruk av Organs-on-Chips, er det viktig å forvarme og degas cellekulturmediene før bruk for å unngå dannelse av mikrobobler i kanalene som kan føre til cellulær stress eller til og med løsrivelse fra membranen.

I tillegg til de spesifikke applikasjonene som er vist her, kan tarmbrikkemodellen brukes til å løse en rekke vitenskapelige spørsmål, fra grunnleggende vitenskap til oppdagelse og testing av nye stoffer eller legemiddelleveringsteknologier. Det kan lette studier av menneskelig tarmutvikling, stamcellemodning og epitelcellefunksjon; spesielt i sammenheng med å evaluere mekanikkens rolle i vekst og homeostase av tarmvevet. Nylige funn viste at dynamisk likevekt i det sunne tarmepitelet er avhengig av dets evne til nøyaktig å koordinere ulike krefter som definerer krypt-villi-arkitektur, compartmentalize celletyper, direkte cellemigrasjon og regulere celleidentitet, spredning og død i rom og tid32. Tarmbrikken gir en mulighet til bedre å belyse samspillet mellom mekaniske krefter (f.eks. Spenning eller skjærstress), celleskjebne og funksjon for å svare på noen av mange fascinerende spørsmål som gjenstår i det fremvoksende feltet tarmmekanobiologi. Videre kan det tillate studier av sensing og tarmtransportprosesser, takket være tilstedeværelsen av hormonutskillende enteroendokrine celler og korrekt lokalisering av ulike næringstransportører15,16. Tarmbrikkemodellen kan også modifiseres for å inkorporere immunceller så vel som kommensale eller patogene mikroorganismer for studier på tarminflammatoriske lidelser, vertspatogen og vertsmikrobiom-interaksjoner, samt å nøyaktig forutsi off-target toksisitet av immuno-onkologiske produkter, som tidligere vist 17,20,33,34,35.

I tillegg kan bruk av kliniske biopsiprøver fra personer med spesifikke genotypiske og fenotypiske egenskaper muliggjøre analyse av pasientspesifikke sykdomsmekanismer samt respons på terapier, og dermed bidra til å fremme personlig medisin i fremtiden.

Den største begrensningen av denne metoden er at fragmenter fra et stort antall organoider (~ 60-80) kreves for å danne et sammenflytende tarmepitel på hver chip. Dette skyldes at organoidfragmenter krever såing med høy tetthet for å sikre at et tilstrekkelig antall intestinale stamceller er tilstede for å støtte den proliferative utvidelsen av monolaget og etableringen av en 3D-vevsarkitektur. Et fullt differensiert tarmepitel på en brikke har alle de viktigste tarmepitelcelletypene (absorberende enterocytter, Paneth-celler, begerceller og enteroendokrine celler) og transkripsjonsprofil som ligner den in vivo-motparten . Imidlertid mangler den nåværende modellen fortsatt andre viktige komponenter i den levende tarmen, inkludert tarmfibroblaster, bosatte immunceller (f.eks. Makrofager, intraepiteliale lymfocytter og dendrittiske celler) og det enteriske nervesystemet.

Selv om disse er potensielle ulemper, har tidligere studier vist at kraften i Organ-on-a-Chip-teknologitilnærmingen ligger i dens evne til å etterligne den strukturelle og funksjonelle kompleksiteten til menneskelige organer ved gradvis å integrere ulike komponenter av in vivo vev og deres mikromiljø en etter en36,37. Denne syntetiske biologiske tilnærmingen til in vitro vevsteknikk gir en måte å studere bidraget fra individuelle cellulære og molekylære komponenter til fysiologiske og patofysiologiske responser på organnivå på varierende nivåer av systemkompleksitet. Videre tillater det at biokjemiske, genetiske og mikroskopiske analyser av de samvirkende vevene utføres individuelt og i sanntid, og får innsikt i hvordan intercellulære signaler og vev-vev-interaksjoner bidrar til spesifikk organnivåadferd. En annen bemerkelsesverdig egenskap ved tarmbrikketeknologi er allsidighet. Presis kontroll over mikromiljøelementer muliggjør finjustering av mediestrømningshastigheter og belastningsparametere for å reprodusere naturlige krefter som oppleves av celler i menneskekroppen, for eksempel skjærspenningen som registreres av endotelcellene som er utsatt for blodstrøm og de sykliske peristaltiske bevegelsene i tarmvevet. Videre muliggjør synergistisk prosjektering av organoider og organer-på-chips opprettelse av vaskulariserte organer-on-chips som representerer ulike regioner av tarmvev som kan være fluidisk forbundet med hverandre for å studere fysiologiske interaksjoner mellom små og store tarmer. Dermed tror vi at tarmbrikken representerer en overlegen modell av tarmepitelet og kan bidra til å implementere 3Rs (Reduction, Refinement, and Replacement) -prinsippet i grunnvitenskap så vel som i det prekliniske og regulatoriske oppsettet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi og Magdalena Kasendra er nåværende eller tidligere ansatte i Emulate Inc., og kan ha egenkapital. Emulate Inc er selskapet som produserer orgelbrikkeenhetene og har publisert patenter som er relevante for arbeidet som er angitt i denne artikkelen.

Acknowledgments

Vi takker professor Donowitz for å gi tarmbiopsi-avledede organoider og Brett Clair for å designe de vitenskapelige illustrasjonene av chip-, bærbar- og kulturmodulen. Resten av de vitenskapelige illustrasjonene ble generert ved hjelp av BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135 (2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106 (2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Tags

Bioteknologi utgave 183
Kombinere humane organoider og organ-on-a-chip-teknologi for å modellere tarmregionspesifikk funksjonalitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter