Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.
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Methodenartikel
Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge, die schwere landwirtschaftliche Verluste verursachen. Um die Biologie solcher Schädlingsmotten zu verstehen, waren grundlegende Techniken sehr gefragt. Hier werden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekulare Studien mit zwei Teetortrix, Homona magnanima und Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae), entwickelt. Insekten wurden mit in Scheiben geschnittener künstlicher Nahrung massenhaft gezüchtet und durch Inzucht über 100 Generationen unter Berücksichtigung ihrer biologischen Eigenschaften aufrechterhalten. Insekten haben verschiedene Geschlechtsdimorphismen; Daher ist es schwierig, das Geschlecht während der Entwicklungsstadien zu unterscheiden, die nachfolgende Assays verhindert haben. Die vorliegende Arbeit hob hervor, dass das Geschlecht von Tortricidenlarven durch die Beobachtung von Hoden oder Milch-Essigsäure-Orcein-Färbung bestimmt werden konnte, um das frauenspezifische W-Chromosom zu visualisieren. Darüber hinaus ermöglichte die vorliegende Studie unter Verwendung der Geschlechtsbestimmungsmethoden Nukleinsäureextraktionen aus geschlechtsbestimmten Embryonen und die Anwendung auf Hochdurchsatzsequenzierung. Diese Tipps sind für andere Schadinsekten anwendbar und erleichtern weitere morphologische und genetische Studien.
Einleitung
Lepidoptera-Insekten machen mehr als 10% aller beschriebenen lebenden Artenaus 1, und bestimmte Taxaarten verursachen schwere Schäden an Pflanzen und schwere landwirtschaftliche Verluste 2,3. Obwohl molekulare und genetische Studien mit Modellinsekten wie der Seidenraupe Bombyx mori4,5 entwickelt wurden, bleiben Schädlingsinsekten unerforscht, teilweise wegen der Schwierigkeiten bei der Aufzucht und Handhabung 6,7. Daher sind grundlegende Studien und Techniken n....
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Protokoll
1. Insektensammlung und Massenaufzucht
- Sammeln Sie tortricide Insekten von Feldern nach zuvor veröffentlichten Referenzen 8,12.
HINWEIS: H. magnanima und A. honmai Larven werden aus beschädigten Teeblättern gesammelt (Abbildung 1A); Erwachsene werden mit tragbarem 4-W-UV-Licht (365 nm Wellenlänge, siehe Materialtabelle, Abbildung 1B) angezogen. - Züchten Sie die gesammelten Larven (Abbildung 1C, D) einzeln mit einem Stück künstlicher Diät in einer 1/2-Unzen-Tasse....
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Ergebnisse
Einrichtung von Wirtsstrecken und deren Instandhaltung
Die Lebensfähigkeit von Feldsammellarven wird unterschiedlich dem Standort des Feldes, den Jahreszeiten und den Aufzuchtbedingungen zugeschrieben (z. B. 90% der Lebensfähigkeit in Taiwan, Taoyuan, wie in Arai et al.12 gezeigt). Ungefähr 30% -50% der Paare werden wie gewohnt die nächste Generation erzeugen. Für H. magnanima und A. honmai werden Matriline seit über 100 Generationen durch Inzucht aufrechterha.......
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Diskussion
Tortricid umfasst mehrere land- und forstwirtschaftliche Schädlinge; Die vorliegende Studie präsentierte Methoden zur Aufzucht von Tortrix über Generationen, zur Beobachtung der Embryogenese und des Geschlechts der Insekten und zur Durchführung molekularer Analysen mit reifen Embryonen.
Eines der Hindernisse für die Schädlingsinsektenforschung ist die Etablierung von Aufzuchtmethoden. Vor allem Inzucht wirkt sich manchmal negativ auf die Fitness der Art aus. Die Fitnessverringerung durch die I.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren danken der Unterstützung durch die Forschungsstipendien der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) für junge Wissenschaftler [Fördernummer 19J13123 und 21J00895].
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1/2 Unze Tasse | FP CHUPA | CP070009 | Insektenzucht; |
| https://www.askul.co.jp/p/6010417/ 1/2 Unze Becherdeckel | FP CHUPA | CP070011 | Insektenzucht; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99,7% Essigsäure | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalysator | Agilent Technologies | nicht dargestellt | Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 Nanokit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| Benzalkoniumchlorid-Lösung | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | Nr.4987123116046 | Sterilisation; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | Insektenzucht; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI-Lösung | Dojindo, Tokio, Japan | 340-07971 | Färbungen; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Dinatriumhydrogenphosphat | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS-Quantifizierungskit | Invitrogen | Q33231 | Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II-Säule | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA-Extraktion; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylendiamin-N,N,N',N'-Tetraessigsäure Tetranatriumsalztetrahydrat (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Zelllysepuffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Pergaminpapier | HEIKO | 2100010 | die Insektenzucht; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc& utm_source= Adw |
| Heizblock WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokio, Japan | 4002620 | Inkubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptan | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | nicht gezeigt | Künstliche Nahrung; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA-Extraktion; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| Isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | Extraktion von 4.98748E+12 | Nukleinsäuren; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Milchsäure | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Färbemittel; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| Methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 Vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex Mischer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | nicht gezeigt | Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natürliches Rudel breit | Inomata Chemikalie | 1859 | Insektenzucht; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3% 82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit für Illumina | New England BioLabs | E7770S | Bibliotheksvorbereitung; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| Orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Flecken; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyd | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | Fixierung; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonolaurat | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Tragbares UV-Schwarzlicht (4W, 365nm Wellenlänge) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | nicht gezeigt | Insektensammlung; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Kaliumchlorid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Kaliumdihydrogenphosphat | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Eindeckmittel | Invitrogen, MA, USA | P36965 | Antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Lösung | Merck | 71049-4CN | DNA-Extraktion; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| Proteinfällungslösung | Qiagen | 158912 | DNA-Extraktion; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| Rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilisation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS-Quantifizierungskit | Invitrogen | Q32855 | Quantifizierung von Nukleinsäuren; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase-Lösung | Nippon Gene | 313-01461 | RNA-Extraktion; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | nicht gezeigt | Künstliche Ernährung; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Natriumchlorid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Natriumdodecylsulfat | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Zelllysepuffer (SDS); |
| wässrige Natriumhypochloritlösung | https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Trennung von Eiern; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracyclinhydrochlorid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilisation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Puffer für die Zelllyse; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| hochreines destilliertes Wasser | Invitrogen | RNA-Extraktion; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
Referenzen
- Gaston, K. J. The magnitude of global insect species richness. Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).
- Pogue, M. A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae). Memoirs of the American Entomological Society<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
