Methodenartikel

Wirkung von Hyaluronsäure 35 kDa auf ein In-vitro-Modell der vorzeitigen Dünndarmverletzung und Heilung unter Verwendung enteroid-abgeleiteter Monoschichten

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DOI:

10.3791/63758

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28. Juli 2022

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Neonatal-Perinatal Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erstellung und Durchführung eines Kratzwundtests an zweidimensionalen (2D) Monoschichten, die aus dreidimensionalen (3D) Enteroiden abgeleitet sind, die aus nichtmenschlichem Primatenileum isoliert wurden.

Zusammenfassung

In-vitro-Kratzwund-Assays werden häufig verwendet, um die Mechanismen und Eigenschaften der Epithelheilung in einer Vielzahl von Gewebetypen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung einer zweidimensionalen (2D) Monoschicht aus dreidimensionalen (3D) nichtmenschlichen Primatenenteroiden, die aus Darmkrypten des terminalen Ileums stammen. Diese enteroid-abgeleiteten Monoschichten wurden dann in einem In-vitro-Kratzwund-Assay verwendet, um die Fähigkeit von Hyaluron 35 kDa (HA35), einer menschlichen Milch-HA-Nachahmung, zu testen, Zellmigration und -proliferation entlang der epithelialen Wundkante zu fördern. Nachdem die Monolagen bis zum Konfluenzen gewachsen waren, wurden sie manuell zerkratzt und mit HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder Kontrolle (PBS) behandelt. Die Zellmigration und -proliferation in die Lücke wurde mit einem Durchlichtmikroskop abgebildet, das für die Bildgebung lebender Zellen ausgestattet war. Der Wundverschluss wurde mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin in ImageJ als prozentuale Wundheilung quantifiziert. Die Kratzfläche und die Rate der Zellmigration sowie der Prozentsatz des Wundverschlusses wurden über 24 h gemessen. HA35 beschleunigt in vitro die Wundheilung in Dünndarm-Enteroid-Monoschichten, wahrscheinlich durch eine Kombination aus Zellproliferation am Wundrand und Migration in den Wundbereich. Diese Methoden können möglicherweise als Modell verwendet werden, um die Darmregeneration im Frühdarm des menschlichen Dünndarms zu untersuchen.

Einleitung

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist einer der häufigsten gastrointestinalen Notfälle bei Frühgeborenen1. Die Krankheit ist durch eine schwere Darmentzündung gekennzeichnet, die sich schnell zu Darmnekrose, Sepsis und möglicherweise zum Tod verschlechtern kann. Obwohl die Ätiologie unklar ist, deuten Hinweise darauf hin, dass NEC multifaktoriell ist und das Ergebnis einer komplexen Wechselwirkung von Fütterung, abnormaler bakterieller Besiedlung und einem unreifen Darmepithelist 2,3. Frühgeborene haben eine erhöhte Darmpermeabilität, eine abnormale bakterielle Besiedlung und eine niedrige Enterozytenregenerationskapazität4,5, was ihr Risiko für Darmbarrierestörungen, bakterielle Translokation und NEC-Entwicklung erhöht. Daher ist die Identifizierung von Strategien oder Interventionen zur Beschleunigung der Darmepithelreifung und zur Förderung der Regeneration oder Heilung des Darmepithels entscheidend für die Verhinderung dieser tödlichen Krankheit.

Studien haben gezeigt, dass Muttermilch (HM) bei Frühgeborenen 6,7,8,9,10,11 vor NEC schützt. Sowohl Human- als auch Tierstudien haben gezeigt, dass die Formel auf Rinderbasis die Darmpermeabilität erhöht und direkt toxisch für Darmepithelzellen ist 2,12. Obwohl nicht vollständig aufgeklärt, deuten Beweise darauf hin, dass die schützende Wirkung von HM durch bioaktive Komponenten wie Lactoferrin, Immunglobulin A (IgA) und HM-Oligosaccharide vermitteltwird 13. HM ist auch reich an Hyaluron (HA), einem einzigartigen sulfatfreien Glykosaminoglykan mit wiederholter D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamindisaccharide14,15. Wichtig ist, dass wir gezeigt haben, dass orale 35 kDa HA (HA35), eine HM HA-Nachahmung, die Schwere der Darmverletzung abschwächt, bakterielle Translokation verhindert und die Mortalität in einem murinen NEC-ähnlichen Darmverletzungsmodell verringert16,17.

Hier werden die Wirkungen von HA35 auf die Darmheilung und Regeneration in vitro weiter untersucht. Derzeit ist der am weitesten verbreitete In-vitro-Assay für Darmverletzung und -reparatur ein Kratzwundtest, der in Darmkrebszellmonoschichten (CRC) durchgeführt wird. Die physiologische Relevanz eines solchen Modells für den Frühgeborenendarm ist begrenzt, da die Wundreparatur von Darmkrebszellen stark von der hochgradig proliferativen Natur von Krebszellen und nicht von stammzellgesteuerten Reparaturprozessen abhängt18. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird hier die Etablierung eines enteroiden 2D-Kratzwundmodells beschrieben, einschließlich des Verfahrens zur Isolierung und Aufrechterhaltung primärer Stammzell-abgeleiteter Dünndarmenteroide von Frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten (NHP). Da vorzeitige NEC am häufigsten im distalen Dünndarm berichtet wird, liefert die Verwendung von primären Epithelzellorganoiden in einem Modell der Darmschädigung und -reparatur ein physiologisch besser übersetzbares In-vitro-Modell im Vergleich zu bestehenden Modellen, die traditionelle kolorektale Monoschichten verwenden18,19.

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Protokoll

Alle Tierverfahren in dieser Studie wurden vom University of Oklahoma Health Sciences Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Nach institutioneller Zulassung wurden fetale Dünndarmproben von einem frühgeborenen nichtmenschlichen Primaten (NHP, 90% Trächtigkeit, Olivenpavian, Papio anubis) nach Euthanasie für eine separate Studie gewonnen (Protokoll #101523-16-039-I)20.

1. Etablierung von frühgeborenen nicht-menschlichen Primaten 3D Darmenteroide

  1. Medienvorbereitung
    HINWEIS: Medien können bis zu 1 Woche vor der Kryptenisolierung nach aseptischer Standardtechnik vorbereitet werden. Penicillin / Streptomycin (Endkonzentration 1%) kann auf Wunsch anstelle der Breitbandantibiotika für Primärzellen verwendet werden.
    1. Bereiten Sie humanes Organoid-Wachstumsmedium + Y-27632 (HOGMY) vor, indem Sie 50 ml Organoid-Wachstumsmedium humanes Basalmedium mit 50 ml Organoid-Ergänzung mischen (Materialtabelle). Fügen Sie 200 μL der Breitbandantibiotika (Endkonzentration 100 μg/ml) (Tabelle der Materialien) und Y-27632 (zu einer Endkonzentration von 10 μM) hinzu. Auf der Tischplatte auf Raumtemperatur erwärmen.
    2. Bereiten Sie humanes Organoid-Wachstumsmedium (HOGM) vor, indem Sie 50 ml Organoid-Wachstumsmedium menschliches Basalmedium mit 50 ml Organoid-Ergänzung mischen. Fügen Sie 200 μL der Breitbandantibiotika (100 μg / ml) hinzu. Auf der Tischplatte auf Raumtemperatur erwärmen.
      HINWEIS: HOGM wird verwendet, wenn Medien über die ersten 2-3 Tage nach der Passage hinaus gewechselt werden.
    3. 100 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium eiskalt kühlen.
    4. Bereiten Sie 50 ml Waschpuffer vor, indem Sie 1x PBS ohne Kalzium oder Magnesium mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) kombinieren. Kühlen Sie es, bis es eiskalt ist.
    5. Bereiten Sie den DMEM-F12-Waschpuffer vor, indem Sie 1 ml der Breitbandantibiotika (100 μg/ml) zu 500 ml DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-Puffer) hinzufügen. Halten Sie es eiskalt.
  2. Crypt-Isolierung und -Beschichtung
    HINWEIS: Hydrogel auf Basis der extrazellulären Matrix (ECM) muss während des gesamten Verfahrens auf dem Eis verbleiben. Dieses Verfahren setzt genügend Gewebe voraus, um sechs ECM-basierte Hydrogelkuppeln zu besiedeln. Wenn eine andere Dichte von Krypten geerntet wird, sollte die Domnummer entsprechend geändert werden.
    1. 150 μL Wachstumsfaktor-reduzierter (GFR) Basalmembranextrakt (BME) (phenolrotfrei) über Nacht auf dem Eis bei 2-8 °C auftauen.
    2. Inkubieren Sie eine mit 24 Vertiefungen behandelte Polystyrolplatte mit flachem Boden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 für mindestens 30 Minuten vor Gebrauch.
    3. Nach NHP-Euthanasie und Gewebeentnahme spülen Sie das Ileumsegment der Trümmer mit einer 1.000 μL Pipettenspitze mit eiskaltem 1x PBS in einer Einweg-Petrischale.
      HINWEIS: Frisches Gewebe muss schnell geerntet und eiskalt gehalten werden, um gesunde Enteroide zu ernten.
    4. Das Ileum längs entlang des gesamten Darms schneiden und mit eiskaltem PBS 3x waschen. Zerkleinern Sie das Gewebe in kleine Fragmente (ca. 2 mm Länge) mit einer sterilen Schere über einem 50 ml konischen Röhrchen, das 15 ml eiskaltes PBS enthält, beginnend mit dem Teil des Ileumsegments, der dem Röhrchen am nächsten ist.
    5. Verwenden Sie eine serologische 10-ml-Pipette, um die Krypten zu stören, indem Sie 5-10x auf und ab pipettieren. Lassen Sie die Gewebesegmente auf dem Boden des Röhrchens absetzen, entfernen Sie dann den Überstand und ersetzen Sie ihn durch frisches, eiskaltes PBS. Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens 7x-10x, bis der Überstand klar und frei von Ablagerungen ist.
    6. Sobald Sie klar sind, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Krypten in 25 ml Zelldissoziationsreagenz. Stellen Sie das Rohr bei 20 U/min für 15 min bei Raumtemperatur auf eine Schaukelplattform.
    7. Entfernen Sie den Schlauch aus der Wippe, lassen Sie die Zellen etwa 30 s bis 1 Minute ruhen und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 10 ml eiskalten Waschpuffer hinzu. Pipettieren Sie mit einer p1000-Pipette auf und ab, um weiter in einzelne Krypten zu dissoziieren.
    8. Filtern Sie das Gewebe durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Röhrchen. Spülen Sie den originalen 50-ml-Konikusschlauch mit 10 ml eiskaltem Waschpuffer ab und filtern Sie durch das 70-μm-Sieb, um sicherzustellen, dass alle Krypten aus dem Originalröhrchen entfernt wurden. Wiederholen Sie dieses Waschen des Taschentuchs für insgesamt 4x Spülungen.
    9. Das Filtrat bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Fügen Sie 600 μL HOGMY hinzu und zerbrechen Sie das Pellet, indem Sie mit einer 200 μL Pipette auf und ab pipettieren. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Lösung eiskalt wird.
      HINWEIS: Wenn die Lösung nicht eiskalt ist, behält die Kuppel nicht die richtige Struktur, wenn sie beschichtet ist. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen beim Pipettieren von ECM-basierten Hydrogelkuppeln, da Blasen ein ordnungsgemäßes Anhaften am Plattenboden verhindern.
    10. Fügen Sie 600 μL eiskaltes Hydrogel auf ECM-Basis hinzu, um das Zellpellet zu suspendieren, und mischen Sie es gut mit einer 200 μL Pipette.
    11. Nehmen Sie die 24-Well-Platte aus dem Inkubator und legen Sie sie auf einen 37 °C heißen Plattenwärmer. 50 μL eiskaltes Hydrogelgemisch auf HOGMY/ECM-Basis werden in die Mitte von 24 Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte (50 μL pro Kuppel) pipettiert.
    12. Nach der Beschichtung lassen Sie die Kuppeln 1 Minute lang auf einem 37 °C warmen Plattenwärmer sitzen, damit sie am Boden der Platte haften bleiben. Drehen Sie die Platte vorsichtig um, stellen Sie sicher, dass sich kein Kondenswasser auf der Unterseite der Platte angesammelt hat, und legen Sie die umgekehrte Platte bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.
    13. Drehen Sie die Platte nach 15 Minuten mit der rechten Seite nach oben und pipettieren Sie 750 μL HOGMY bei Raumtemperatur in jede Vertiefung.
      HINWEIS: Pipetten Sie Medien langsam auf die Seitenwand von Vertiefungen, achten Sie darauf, die neu gebildete 3D-ECM-basierte Hydrogelkuppel nicht zu stören.
    14. Sobald alle Vertiefungen mit Medien gefüllt sind, legen Sie die Platte in den Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage mit 750 μL HOGM. Passage Enteroide alle 7-10 Tage.
  3. Intestinale enteroide Passaging
    HINWEIS: Das folgende Protokoll gilt für eine 24-Well-Kulturplatte, die NHP-Enteroide mit einer Splitrate von 1:2 enthält.
    1. Entfernen Sie die enteroiden Medien aus jeder Vertiefung, achten Sie darauf, die ECM-Kuppel, die Enteroide enthält, nicht zu stören, geben Sie 500 μL eiskaltes Zelldissoziationsreagenz mit einer 1.000 μL Pipette in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Minute.
    2. Unterbrechen Sie die ECM manuell, indem Sie 8-12x auf und ab pipettieren. Den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein konisches 15-ml-Rohr überführen.
    3. Sobald die gesamte Lösung von der 24-Well-Kulturplatte gesammelt wurde, fügen Sie 250 μL Zellaufschlussreagenz zu jeder Vertiefung hinzu, um sicherzustellen, dass alle NHP-Enteroide aus jeder Vertiefung entfernt wurden, und fügen Sie diese letzte Spülung zu den vorhandenen 15-ml-konischen Röhrchen hinzu.
    4. Auf eine Schaukelplattform bei 40 U/min für 15 min bei Raumtemperatur (20 °C) stellen. Alternativ können Sie die Röhrchen 15 min bei Raumtemperatur manuell schütteln.
    5. Nach 15 min bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand aus den 15-ml-Röhrchen, bis nur noch das Pellet übrig ist.
    6. Fügen Sie 8 ml eiskaltes DMEM + Breitbandantibiotika in ein 15 ml konisches Röhrchen hinzu und stellen Sie sicher, dass das Pellet ausreichend gestört ist. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
    7. Fügen Sie 600 μL HOGMY hinzu und brechen Sie das Pellet auf, indem Sie mit einer 1.000 μL Pipette auf und ab pipettieren. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis die Lösung eiskalt wird. Sobald die Lösung eiskalt ist, fügen Sie 600 μL eiskaltes ECM hinzu, um das Zellpellet aufzuhängen und gut mit einer 1.000 μL Pipette zu mischen. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2.-1.3.7. für die restlichen 12 Bohrungen.
      1. Die restlichen Schritte finden Sie in den Schritten 1.2.11.-1.2.16.

2. Etablierung eines enteroiden Monolayer- und Kratzwundtests

  1. Medien- und Behandlungsvorbereitung
    1. Kühlen Sie 5 ml PBS ohne Kalzium oder Magnesium eiskalt.
    2. Bereiten Sie den DMEM-F12-Waschpuffer vor, indem Sie 1 ml der Breitbandantibiotika (100 μg/ml) zu 500 ml DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F12 + 15 mM HEPES-Puffer) hinzufügen. Eis kalt halten.
    3. Bereiten Sie 100 ml HOGMY vor, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben, und erwärmen Sie es auf dem Tisch, um Raumtemperatur zu erreichen.
    4. 25 ml 0,25% Trypsin-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einem 37 °C warmen Wasserbad.
    5. Bereiten Sie 50 μg/ml, 100 μg/ml und 200 μg/ml HA35 für die Zellbehandlung unter Verwendung von sterilem PBS ohne Kalzium oder Magnesium als Lösungsmittel vor. Bei der endgültigen Verdünnung von HA35 wird HOMGY als Lösungsmittel verwendet.
      HINWEIS: HA35-Präparation kann mehrere Verdünnungen erfordern, da HA35 oft in einer Konzentration von mehr als 5 mg / ml aus der Lösung kommt.
  2. Enteroide Monoschichtbildung
    HINWEIS: Das folgende Verfahren liefert Volumina, die für die Erzeugung einer 24-Well-Platte enteroider Monoschichten ausreichen. Stellen Sie die Lautstärken für die gewünschte Anzahl von Monolayern ein.
    1. 96 μL ECM-basiertes Hydrogel BME (phenolrotfrei) über Nacht auf Eis bei 2-8 °C auftauen. Verdünntes Hydrogel auf ECM-Basis in eiskaltem PBS ohne Calcium oder Magnesium im Verhältnis 1:50. Beschichten Sie jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 200 μL eiskalt verdünntem Hydrogel auf ECM-Basis.
    2. Die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte für mindestens 1 h bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren. Aspirieren Sie Medien aus der 24-Well-Kulturplatte, die die für Monoschichten bestimmten 3D-Enteroide enthalten, und ersetzen Sie sie durch 500 μL Zelldissoziationsreagenz / Well.
    3. Stören Sie ECM-basierte Hydrogelkuppeln manuell, indem Sie 8x-12x auf und ab pipettieren und den Inhalt von 12 Vertiefungen in ein 15-ml-konisches Röhrchen übertragen.
    4. Waschen Sie die 12 leeren Vertiefungen mit 250 μL Zelldissoziationsreagenz, um sicherzustellen, dass alle Enteroide entfernt wurden, und geben Sie den Inhalt in ein 15-ml-konisches Röhrchen. Wiederholen Sie Schritt 2.2.5. und Schritt 2.2.6. für die restlichen 12 Vertiefungen mit einem zweiten 15-ml-konischen Rohr.
    5. Die konischen Röhrchen bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Fügen Sie 10 mL eiskalten DMEM-F12-Waschpuffer in 15 ml konische Röhrchen hinzu und suspendieren Sie die enteroiden Pellets durch Inverdrehen der Röhrchen. Bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in 12 ml 37 °C Trypsin-EDTA. Legen Sie die Röhrchen für 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad oder bis die Zellen löslich erscheinen. Fügen Sie jedem Röhrchen 3 ml DMEM-F12-Waschpuffer hinzu, um Trypsin-EDTA zu verdünnen, mischen Sie es durch Invertieren der Röhrchen und legen Sie es auf Eis.
    7. Filtern Sie die dissoziierten Enteroide durch ein 37 μM Mesh-Zellsieb und sammeln Sie den Inhalt in sauberen 15 ml konischen Röhrchen. Die Röhrchen bei 300 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    8. Während die Zellen in der Zentrifuge pelletieren, entfernen Sie die ECM-basierte Hydrogel-beschichtete Platte aus dem Inkubator und saugen Sie überschüssige ECM-basierte Hydrogellösung ab, ohne die beschichtete Oberfläche zu zerkratzen oder die Platte vollständig trocknen zu lassen.
    9. Entfernen Sie den Überstand aus den konischen Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellpellets mit 6 mL HOMGY. Geben Sie 500 μL der kombinierten 12-ml-HOMGY-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Platte, die mit ECM-basiertem Hydrogel beschichtet ist, bei einer Seeding-Dichte von etwa 3 x 105 Zellen/Well. Schwenken Sie die Platte mit einem Deckel, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
    10. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5% CO 2und wechseln Sie die HOMGY-Medien alle 2 Tage, bis die Monoschichten >90% Konfluenz erreichen.
  3. Monolayer-Behandlung und Kratzwundtest
    1. Sobald die Monoschichten >90% Konfluenz erreicht haben, saugen Sie Medien ab, um alle Zellen zu entfernen, die sich nicht anhaften. Behandeln Sie Zellen mit 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder PBS, gelöst in HOMGY, für 24 h.
    2. Entfernen Sie nach 24 h das Medium und achten Sie darauf, die Oberfläche der Monoschicht nicht zu stören. Machen Sie mit einer 200-μL-Pipettenspitze einen linearen Kratzer über den gesamten Oberflächendurchmesser der Monoschicht in jeder Vertiefung und achten Sie darauf, die Monoschichten nicht trocknen zu lassen.
    3. Waschen Sie die zerkratzten Monolagen 1x mit 500 μL 1x PBS. 500 μL HA35 (50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml) oder PBS gelöst in HOMGY und Transfer der Platte in das Lebendzellenanalysegerät (Table of Materials) innerhalb eines 37 °C und 5% CO2-Inkubators.
    4. Klicken Sie unter dem Symbol Zeitplan in der Live-Cell-Analysesoftware (Materialverzeichnis) auf das Symbol Assistent zum Hinzufügen neuer Schiffe starten und legen Sie die Scanhäufigkeit so fest, dass nach einem Zeitplan gescannt wird. Erstellen Sie unter Scantyp ein neues Whole Well-Gefäß, geben Sie die Scaneinstellungen an (z. B. Phase für Bildkanäle und 4x für Objektiv) und klicken Sie auf Weiter.
    5. Wählen Sie den Plattenhersteller und die Katalognummer aus der bereitgestellten Liste aus. Wählen Sie unter dem Symbol Zeitplan das Plus-Symbol aus, an dem die Platte im Analysegerät für lebende Zellen platziert wird. Wählen Sie das gewünschte Scanmuster aus, und erstellen Sie dann eine Plattenzuordnung, indem Sie auf der Seite Plattenlayout "+" auswählen. Wählen Sie Analyse auf später verschieben aus, legen Sie dann den Scanzeitplan für alle 4 Stunden für 24 Stunden fest und überprüfen Sie die Erfassungseinstellungen auf der Seite Zusammenfassung des Schiffsassistenten. Wählen Sie abschließend Zum Zeitplan hinzufügen aus.
    6. Sobald der 24-Test abgeschlossen ist, doppelklicken Sie unter dem Symbol Ansicht auf Schiffsname und exportieren Sie Bilder und Filme. Wählen Sie Vertiefungen und eine Reihe von Bildern aus, die angezeigt und als JPEG exportiert werden sollen. Analysieren Sie Bilder auf prozentuale Wundheilung mit dem Wundheilungsgrößen-Plugin für ImageJ21 gemäß Schritt 2.4. unter.
  4. Kratzwundanalyse
    1. Öffnen Sie die ImageJ-Software. Laden Sie die Kratzwund-Assay-Bilder hoch (. TIFF oder .JPG).
    2. Wählen Sie Bild > Geben Sie > 8-Bit ein, um das Bild von 24-Bit-RGB in 8-Bit zu ändern. Installieren Sie das Wundheilungsgrößen-Plugin, indem Sie Plugins > Makros auswählen > > Wundheilungsgrößen-Plugin installieren.
    3. Drehen Sie das Bild so, dass der Kratzer vertikal ist, und initialisieren Sie das Wundheilungsgrößentool-Plugin.
    4. Wählen Sie die Plugin-Parameter im Dialogfeld aus, um die Kratzwunde optimal anzupassen. Legen Sie den Wert der Parameter für die Größenoptionen für die Wundheilung wie folgt fest: Varianzfensterradius bei 20, Schwellenwert bei 100 und Prozentsatz gesättigter Pixel bei 0,001, und wählen Sie Ja für Globale Skalierung festlegen aus. Schließen Sie die Auswahl ab, indem Sie auf die Schaltfläche OK klicken. Überprüfen Sie, ob der ausgewählte Bereich der Wundbereich ist. Die oben genannten Parameter erfordern möglicherweise eine Standardisierung von Labor zu Labor.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.4.2.-2.4.4. für die verbleibenden Zeitpunkte für jeden Kratzer.
    6. Berechnen Sie den Prozentsatz der Wundheilung im Kratzbereich von wandernden oder proliferierenden Zellen über 24 h wie folgt:
      % Wundheilung = figure-protocol-1
      wobei T 0 = % Fläche zum Zeitpunkt 0 h und Tc = % Fläche bei 0 h, 4 h, 12 h oder 24 h ist.

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Ergebnisse

Die Auswirkungen von HA auf die Gewebereparatur und Wundheilung in verschiedenen Geweben und Organen sind gut dokumentiert; Die spezifischen Wirkungen von HA mit einem Molekulargewicht von 35 kDa auf die fetale oder neonatale Dünndarmheilung und -regeneration sind derzeit jedoch nicht bekannt. Um die Fähigkeit von HA35 zu testen, die Wundheilung in einem Modell des fetalen oder neonatalen Dünndarms zu fördern, erzeugten wir 3D-Darmenteroide aus NHP-Ileumgewebe und dissoziierten dieses Gewebe weiter in einzelne Zellen, um...

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Diskussion

Der Magen-Darm-Trakt eines Frühgeborenen steht unter ständigem regenerativem Druck durch wiederholte Exposition gegenüber Umwelteinflüssen im Zusammenhang mit Dysbiose, entzündlichen bakteriellen Metaboliten und Toxinen und intermittierender Hypoxie23,24. Leider ist das Darmepithel des Frühgeborenen nicht in der Lage, schnell funktionelle Integrität herzustellen23, was zu Barrierestörungen, erhöhter Darmpermeabilität und in schweren Fällen...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen und keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. HC wird durch den Zuschuss P20GM134973 der National Institutes of Health unterstützt. KB wird durch einen Zuschuss der Children's Hospital Foundation (CHF) und der Presbyterian Health Foundation (PHF) unterstützt. Lebendzellbildgebungsdienste, die vom Kern der Cancer Functional Genomics bereitgestellt werden, wurden teilweise durch den National Institute of General Medical Sciences Grant P20GM103639 und den National Cancer Institute Grant P30CA225520 der National Institutes of Health unterstützt, die an das Stephenson Cancer Center der University of Oklahoma Health Sciences Center vergeben wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL Serologische PipetteFisher Scientific13-675-49
100x21mm Schale, Nunclon DeltaThermoFisher Scientific172931
15 mL Konisches RöhrchenVWR89039-666
24-Well, TC-behandelt, flache BodenplatteCorning3524
37 & micro; M Reversibles ZellsiebSTEMCELL Technologies27215
50 mL Konisches RöhrchenVWR89039-658
70 µ m Sterile ZellsiebeFisher ScientificFB22-363-548
Albumin, Rind (BSA)VWR0332-100G
CellTiter-Glo 3D-ZellviabilitätsassayPromegaG9681
Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium/Nährschinken-Gemisch F-12 (DMEM-F12) mit 15 mM HEPES-PufferSTEMCELL Technologies36254
Gentle Cell DissoziationsreagenzSTEMCELL Technologies100-0485
ImageJNIHimagej.nih.gov/ij/
Incucyte S3 Live-Cell Analysis InstrumentSartorius4647
Incucyte Scratch Wound Analysis Software ModuleSartorius9600-0012
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010Das ist HOGMY, aber ohne das Y-27632 oder Antibiotika. Wird auch als Basis für HOGM verwendet, aber dann fehlen nur noch die Antibiotika.
Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O111:B4, gereinigt durch GelfiltrationschromatographieMillipore SigmaL3012-10MG
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembranmatrix, phenolrotfreiesCorning356231
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon deltabehandelte Mikroplatte mit flachem BodenThermoFisher Scientific136101
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), 1X [-] Kalzium, Magnesium, pH 7,4Corning21-040-CM
PrimocinInvivogenant-pm-1Dies ist ein Breitband-Antibiotika
Natriumhyaluronat, Forschungsqualität, HA20KLifecore BiomedicalHA20K-1
TC20 Automatisierter ZellzählerUnternehmen: Bio-Rad1450102
Trypsin-EDTA 1X, 0,25% TrypsinFisherScientific MT25053CI
Y-27632STEMCELL Technologies72302

Referenzen

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