Engineering und Charakterisierung eines optogenetischen Modells des humanen neuromuskulären Übergangs

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein reproduzierbares, automatisiertes und unvoreingenommenes Bildgebungssystem zur Charakterisierung der neuromuskulären Verbindungsfunktion unter Verwendung von menschlichem Skelettmuskelgewebe und optogenetischen Motoneuronen. Dieses System ermöglicht die funktionelle Quantifizierung der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit und erkennt eine verminderte neuromuskuläre Funktion, die durch Neurotoxine und Myasthenia gravis Patientenserum verursacht wird.

Zusammenfassung

Viele neuromuskuläre Erkrankungen, wie Myasthenia gravis (MG), sind mit einer Dysfunktion der neuromuskulären Verbindung (NMJ) verbunden, die in Tiermodellen aufgrund physiologischer Unterschiede zwischen Tieren und Menschen schwer zu charakterisieren ist. Tissue Engineering bietet Möglichkeiten, In-vitro-Modelle funktioneller menschlicher NMJs bereitzustellen, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Durch den Einbau optogenetischer Proteine in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) erzeugten wir Neuronen, die mit bestimmten Wellenlängen des Lichts stimuliert werden können. Wenn das NMJ gesund und funktionell ist, führt ein neurochemisches Signal des Motoneurons zu einer Muskelkontraktion. Durch die Integration von Optogenetik und Mikrofabrikation mit Tissue Engineering haben wir eine unvoreingenommene und automatisierte Methodik zur Charakterisierung der NMJ-Funktion mittels Videoanalyse etabliert. Es wurde ein standardisiertes Protokoll für die NMJ-Bildung, die optische Stimulation mit gleichzeitiger Videoaufzeichnung und die Videoanalyse der Gewebekontraktilität entwickelt. Die Stimulation optogenetischer Motoneuronen durch Licht zur Induktion von Kontraktionen der Skelettmuskulatur rekapituliert die menschliche NMJ-Physiologie und ermöglicht wiederholte funktionelle Messungen von NMJ im Laufe der Zeit und als Reaktion auf verschiedene Eingaben. Wir demonstrieren die Fähigkeit dieser Plattform, funktionelle Verbesserungen der neuromuskulären Konnektivität im Laufe der Zeit zu zeigen und die schädlichen Auswirkungen von MG-Antikörpern oder Neurotoxinen von Patienten auf die NMJ-Funktion zu charakterisieren.

Einleitung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die chemische Synapse zwischen Motoneuronen (MNs) und Skelettmuskelzellen (SkM), die eine Muskelkontraktion ermöglicht. Toxine wie Neurotoxin α-Bungarotoxin (BTX) oder neuromuskuläre Erkrankungen (NMD) wie Myasthenia gravis (MG) können zu einer Degeneration des NMJ und einer Verringerung der Muskelkontrolle^{führen 1}. Biotechnologisch hergestellte menschliche Gewebemodelle rekapitulieren die funktionellen und physiologischen Mechanismen menschlicher NMJs besser und bieten ein größeres translationales Potenzial als Tiermodelle.

Während Tiermodelle das Verständnis der Bildung und Funktion des NMJ vorangebracht haben, gibt es signifikante Unterschiede zwischen menschlichen und tierischen Synapsen, die die Übersetzung der Ergebnisse auf den Menschen beschränken und die In-vivo-Charakterisierung des NMJ zu einer Herausforderung machen ^2,3,4. Studien haben deutliche physiologische Unterschiede zwischen Maus- und menschlichen NMJs gezeigt. Mäuse haben im Vergleich zu menschlichen NMJs größere NMJs und kleinere aktive Zonendichten⁴. Darüber hinaus spiegeln Arzneimittelstudien, die in Tiermodellen durchgeführt werden, nicht immer die Wirkungen wider, die in klinischen Studien am Menschen gefunden wurden. Technisch hergestellte menschliche Gewebemodelle bieten die Möglichkeit, die gesunde Entwicklung des NMJ und die Pathologie neuromuskulärer Erkrankungen zu untersuchen und medikamentöse Screenings zu ermöglichen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs)⁵ können in eine Vielzahl von Zelltypen differenziert werden, einschließlich Skelettmuskelzellen^6,7 und Motoneuronen ^8,9. hiPS-Zellen können leicht aus Patientenzellen generiert werden, was eine bessere Krankheitsmodellierung 10 und ein Arzneimittelscreening^11,12 durch patientenspezifische Gewebemodelle ermöglicht.

Zweidimensionalen (2D) Monolayer-Co-Kulturen von SkMs und MNs fehlen die Morphologie, der Phänotyp, die Organisation und das funktionelle Verhalten physiologischer NMJs. NMJs bilden sich zufällig in einer 2D-Kultur, die die Isolierung motorischer Einheiten für die Analyse hemmt, genaue funktionelle Messungen einschränkt und ihre Verwendung für wiederholte, systematische Experimente verhindert¹³ . Dreidimensionale (3D) Gewebemodelle von NMJs überwinden viele dieser Einschränkungen und rekapitulieren die morphologischen und funktionellen Eigenschaften physiologischer NMJs 7,14,15,16,17. Unter Verwendung dieses Modells werden die beiden Gewebetypen separat entwickelt und dann integriert, indem das axonale Wachstum gesteuert wird, so dass sich im Vergleich zu 2D-Kultursystemen besser organisierte NMJs entwickeln können.

Unsere frühere Studie zeigte, dass die Kombination von Optogenetik mit Tissue Engineering eine genaue nicht-invasive Stimulation und Bewertung der NMJ-Funktion^{ermöglichen kann 18,19}. Durch die Gentechnik können lichtempfindliche Proteine in das Genom von hiPSCs integriert werden. Die Integration von Kanalrhodopsin-2 (ChR2), einem Ionenkanal, der sich als Reaktion auf blaues Licht öffnet, in die Membran erregbarer Zellen wie Neuronen ermöglicht eine berührungslose raumzeitliche Kontrolle über die Zellaktivierung^20,21,22. hiPSCs, die ChR2 tragen, können in optogenetische Motoneuronen unterschieden werden, die für blaues Licht empfindlich sind, wodurch die Notwendigkeit typischer invasiver Elektroden, die Neuronen stimulieren, entfällt und eine unerwünschte Stimulation der Muskelzellen durch Elektroden^{vermieden wird 23}. Dieses System verwendet optogenetische Motoneuronen, um Kontraktionen in nicht-optogenetischen Skelettmuskelzellen zu stimulieren. Durch die Kombination von Videoerfassung und kontrollierter Blaulichtbeleuchtung können die gemeinsam kultivierten Gewebe gleichzeitig stimuliert und für die NMJ-Funktion aufgezeichnet werden.

MG wird durch Autoantikörper verursacht, die auf nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AChR) abzielen, was zu einer verminderten NMJ-Funktion und Muskelschwäche führt²⁴. Es wird auf der Grundlage der vorgestellten Symptome, der Elektrodiagnose und des Nachweises von Autoantikörpern durch serologische Bluttests diagnostiziert. Es wurden jedoch nicht alle an MG beteiligten Autoantikörper identifiziert, und bei einigen seronegativen Patienten wird MG diagnostiziert, aber ohne anerkannte Antikörper^25,26. Unser System ermöglicht eine wiederholte funktionelle Beurteilung des NMJ vor und nach der Zugabe von Serum von MG-Patienten und liefert unschätzbare Einblicke in die funktionellen und biochemischen Veränderungen, die durch die MG-Antikörper verursacht^{werden 18}. Unser Protokoll veranschaulicht, wie 3D-In-vitro-Modelle von funktionellem menschlichem NMJ erstellt werden können, die zur Diagnose und Untersuchung von NMJ-Pathologien und zum Testen potenzieller Therapeutika verwendet werden können. Wir demonstrieren die Vielseitigkeit des Systems in zwei Plattformen, einem mikrofluidischen Gerät und einer größeren Open-Well-Bioreaktorplattform.

Protokoll

Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet.

1. Vorbereitung des Bioreaktors

1. Bioreaktorformen herstellen
   1. Laden Sie eine Bioreaktor-CAD-Datei aus der ergänzenden CAD-Datei herunter oder erstellen Sie ein benutzerdefiniertes eigenes Design.
   2. Generieren Sie mit der CAM-Software einen CNC-Werkzeugweg aus dem 3D-Modell.
   3. Bearbeiten Sie Acetalformen mit einer CNC-Fräsmaschine.
2. Herstellung von Bioreaktoren
   1. Mischen Sie eine 10:1-Base zu einem Härtergemisch aus Polydimethylsiloxan (PDMS, 77 g Mischung pro 4 Plattformen/Formen).
   2. Legen Sie das Gemisch in eine Vakuumkammer, schließen Sie alle Ventile, schalten Sie das Vakuum ein und entgasen Sie das Gemisch für mindestens 30 Minuten, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind. Gießen Sie das Gemisch in Formen und entgasen Sie die Formen in der Vakuumkammer für 1 h.
   3. Schließen Sie die Formen mit der oberen Hälfte der Form in der richtigen Ausrichtung. Legen Sie eine sechseckige Stahlstange über die Mitte und klemmen Sie sie auf beiden Seiten.
   4. Füllen Sie die Oberseite mit PDMS auf.
   5. Die Schimmelpilze in einem 65 °C Ofen für mindestens 4 h aushärten.
   6. Entfernen Sie die Plattformen aus den Formen, nachdem Sie auf Raumtemperatur abgekühlt sind.
   7. Reinigen Sie die Geräte in einem Ultraschallbad mit 1-stündigen Zyklen Spülmittel, 400 ml 100% Isopropanol und destilliertem Wasser.
   8. Über Nacht bei 65 °C trocknen.
   9. Glasabdeckungen 30 min in 1% nichtionischem Tensidpolyol einweichen und sicherstellen, dass sich die Deckgläser nicht stapeln, damit sie alle ordnungsgemäß beschichtet sind.
   10. Mit destilliertem Wasser gut abspülen und über Nacht bei 65 °C trocknen.
   11. Verwenden Sie einen Plasmareiniger auf hoher Höhe mit 6 l / min Sauerstoff für 1-2 Minuten, um Glasabdeckungen und PDMS-Plattform zu behandeln. Nach der Behandlung verbinden Sie die beiden miteinander, indem Sie das PDMS mindestens 30 Sekunden lang auf das Deckglas drücken.
   12. Autoklavieren Sie die gebundenen Geräte, bevor Sie Zellen hinzufügen.

2. Aufbau eines optischen Stimulations-Setups

1. Befestigen Sie mit einem 30-mm-Käfigwürfelsystem einen dichroitischen 573-nm-Spiegel in der Mitte. Kombinieren Sie eine rote 627-nm-LED mit einem 594-nm-Longpass-Erregungsfilter und befestigen Sie sie an der Oberseite des Würfels, wobei die LED dem Spiegel zugewandt ist. Befestigen Sie dann eine blaue 488-nm-LED mit einem 546-nm-Kurzpass-Erregungsfilter an der angrenzenden Seite des Würfels, wobei die LED dem Spiegel zugewandt ist, wie im Schaltplan in Abbildung 3A dargestellt.
2. Befestigen Sie eine ringbetätigte Irismembran an der Unterseite des Käfigwürfels, um die Größe der beleuchteten Fläche zu steuern.
3. Versorgen Sie jede LED über einen T-Cube-LED-Treiber mit Strom und steuern Sie sie über ein Arduino Uno Rev3-Board. Schließen Sie den seitlichen Eingang des LED-Treibers an einen Stromquellenstecker an, schließen Sie den mittleren Ausgang an den Arduino an und schließen Sie den seitlichen Ausgang direkt an die LEDs an.
4. Verbinden Sie den Arduino Uno über ein USB-Kabel mit einem PC.
5. Laden Sie Dateien vom GitHub-Link (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) herunter.
6. Öffnen Sie die Datei "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" aus dem Ordner GitHub.
7. Startparameter festlegen: Schritte = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Stellen Sie sicher, dass der Pinausgang 4 dem blauen LED-Treiber und der Pinausgang 2 dem roten LED-Treiber zugewiesen ist. Überprüfen Sie, ob die mittleren Drähte des LED-Treibers mit der Masse und dem jeweiligen Pin-Ausgang verbunden sind.
9. Kompilieren und laden Sie das Programm "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" nach Arduino.
10. Schließen Sie jeden LED-Treiber an den entsprechenden Kanal an.

3. Aufbau der Zellkultur (Tag -21-0)

1. Primäre Skelettmuskelzellen
   1. Auftauen und erweitern Sie primäre Skelettmyoblasten (erhalten aus Cook Myosite) für maximal sechs Passagen mit myotonem Wachstumsmedium (+ Ergänzung). Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 °C und 5 % CO₂ eingestellt ist.
   2. Wechseln Sie die Medien alle 2 Tage.
   3. Sobald die Zellen zu etwa 60% konfluent sind, passieren Sie sie mit 0,05% Trypsin-EDTA (1x, für 5 min bei 37 °C). Sammeln Sie die dissoziierten Zellen und fügen Sie frische Medien hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
   4. Drehen Sie die Zellen mit 300 x g nach unten und saugen Sie den Überstand über dem Zellpellet ab.
   5. Resuspendieren Sie die Zellen mit MGM und Samen 1:3 mit 60 ml pro Dreischichtkolben.
2. ChR2-hiPSC
   HINWEIS: Alle Zelllinien für diese Arbeit wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien der Columbia University, NY, USA, erstellt und verwendet. In diesem Protokoll wurden ChR2-exprimierende HiPS-Zellen durch CRISPR-Cas9-Genom-Editierung unter Verwendung der zuvor beschriebenen Methoden¹⁸ erzeugt, aber alle stabilen optogenetischen Zelllinien (lentiviral, piggyBac usw.) können auf die gleiche Weise verwendet werden. Konstitutive Promotoren, die sowohl in iPSCs als auch in Motoneuronen exprimiert werden, wurden ausgewählt (CAG). Es wurde festgestellt, dass die Zellen einen gesunden Karyotyp aufweisen, wie in früheren Veröffentlichungen^18,19 erwähnt.
   1. Beschichten Sie 6-Well-Platten mit 1 ml/Well solubilisierter Basalmembranmatrix, verdünnt in DMEM/F12 (1:80) und inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 1 h.
   2. Saatierung von iPSCs auf beschichteten 6-Well-Platten mit 2 ml feederfreiem Zellkulturmedium (iPSC-Medien), Austausch von 2 ml Medien jeden zweiten Tag und Durchgang alle 5-7 Tage. Pflegen Sie die Zellen in einem Inkubator, der auf 37 ^{°C und 5 % CO}₂ eingestellt ist.
   3. Weitergabe
      1. Dissoziieren Sie die Stammzellen, indem Sie mit 1 ml enzymfreiem Stammzellfreisetzungsreagenz für 4 min inkubieren und mechanisch mit einer breiten P1000-Pipette scheren.
      2. Samenzellen im Verhältnis 1:24 oder 1:48 in iPSC-Medien mit 2 μM Y-27632-Dihydrochlorid in 2 ml/Well auf beschichteten 6-Well-Platten.

4. Skelettmuskelgewebe-Seeding (Tag -3)

1. Isolieren und zählen Sie 30 x 10⁶ Myoblasten mit einem automatisierten Zellzähler.
2. Resuspendieren Sie die Myoblasten in einer 4: 1-Mischung aus 3 mg / ml Kollagen I und gelöster Basalmembranmatrix (800 μL Kollagenmischung + 200 μL Basalmembranmatrix, um ein Endvolumen von 1 ml zu erreichen). Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel (9:1-Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) hinzu und verdünnen Sie die Mischung mit 1x PBS, um ein Volumen von 800 μL zu erreichen.
3. Fügen Sie 15 μL Zell-Kollagen-Suspension zu jeder Muskelkammer des Bioreaktors hinzu und achten Sie darauf, die Suspension mit der Pipettenspitze auf beide Säulen zu verteilen (Abbildung 2).
4. Lassen Sie das Zell-Gel-Gemisch bei 37 °C für 30 min polymerisieren und füllen Sie dann jeden Bioreaktor gut mit 450 μL myotonen Wachstumsmedien.
5. Nach 3 Tagen (sobald sich das Gel verdichtet hat) beginnt die Myotube-Differenzierung.

5. Myotube-Differenzierung (Tage 0-14)

1. Beginnen Sie mit der Myotube-Infusion, indem Sie das Gewebe für 7 Tage auf 450 μL fusionsinduzierende Medien (FS, Tabelle 1) umstellen und das Medium jeden zweiten Tag wechseln.
   HINWEIS: Versuchen Sie, die Myotube-Differenzierung am selben Tag wie die Motoneuron-Differenzierung von hiPSCs zu beginnen, um Motoneuronen am Ende der Differenzierungspläne beider Zelltypen zu säen.
2. Am Tag 7 wechseln Sie das Medium auf 450 μL Reifungsmedium Ia (MMIa, Tabelle 1).
3. Wechseln Sie am 9. Tag auf 450 μL Reifungsmedium Ib (MMIb, Tabelle 1).
4. Wechseln Sie am 11. Tag auf 450 μL NbActiv4. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage, bis die Motoneuronen ausgesät sind (Schritt 7).

6. Motoneuron-Differenzierung (Tage 0-14)

HINWEIS: Unser Motoneuron-Differenzierungsprotokoll wurde von Maury et al⁸ übernommen.

1. Übertragen Sie am 0. Tag 4 x 10⁶ ChR2-hiPSCs in eine Petrischale mit extrem niedriger Befestigung und 15 ml Motoneuron-Suspensionskulturmedium (MSCM, Tabelle 1). Ergänzen Sie MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 5 μM Y-27632 Dihydrochlorid.
2. Isolieren Sie an Tag 2 die Neurosphären (NS) mit einem 37 μM reversiblen Sieb und einer Neuplatte in 15 ml MSCM mit 3 μM CHIR99021, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 Hydrat und 0,1 μM Retinsäure. NS sollte nach Tag 2 ohne Verwendung eines Mikroskops in der Petrischale sichtbar sein.
3. Übertragen Sie die Zellen und Medien an Tag 4 in eine 50-ml-Röhre und lassen Sie die Neurosphären auf dem Boden absetzen (5 min). Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 0,5 μM SAG, 0,2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 und 0,1 μM Retinsäure.
4. Wiederholen Sie an Tag 7 Schritt 6.3. aber die Zellen in 15 ml MSCM resuspendieren, ergänzt mit 0,5 μM SAG und 0,1 μM Retinsäure.
5. Wiederholen Sie an Tag 9 Schritt 6.3. aber resuspendierte Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 10 μM DAPT.
6. Wiederholen Sie an Tag 11 Schritt 6.3. aber resuspendieren die Zellen in 15 ml MSCM, ergänzt mit 20 ng / ml BDNF und 10 ng / ml GDNF.
7. Samen Sie am 14. Tag die Motoneuronen in die Plattform.

7. Aussaat von Motoneuronenaggregaten im Bioreaktor (Tag 14)

1. Bereiten Sie eine 4:1-Gelmischung aus 2 mg/ml Kollagen I und Matrigel (800 μL Kollagenmischung + 200 μL Matrigel zu einem Endvolumen von 1 ml) vor. Für die Kollagenkomponente fügen Sie das begleitende Neutralisationsmittel (9:1-Mischung aus Kollagen zu Neutralisationsmittel) hinzu und verdünnen Sie das Gemisch mit 1x PBS, um ein Endvolumen von 800 μL zu erreichen.
2. Verwenden Sie ein 400-nm-Zellsieb, um große Neurosphären auszuwählen und in der Gelmischung zu resuspendieren.
3. Aspirieren Sie Medien aus dem Reservoir und vorsichtig aus der Neurosphärenvertiefung (Abbildung 2).
4. Fügen Sie 15 μL Gelmischung in den Neurosphärenkanal hinzu.
5. Laden Sie eine 10 μL Pipette mit 10 μL Gel und wählen Sie dann eine Neurosphäre.
6. Deponieren Sie die NS in den Neurosphärenkanal und stellen Sie sicher, dass sich die NS in der Kammer befindet. Heben Sie die Pipette langsam an, während Sie das verbleibende Gel freisetzen, sobald das NS abgeschieden ist. Wenn Sie nicht sicher sind, ob der NS korrekt hinterlegt wurde, überprüfen Sie seinen Standort mit einem Mikroskop.
7. Lassen Sie das Gel 30 min bei 37 °C polymerisieren.
8. 450 μL NbActiv4 ergänzt mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/mL GDNF in die Reservoirs geben.
9. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, um ein axonales Wachstum von NS zu Muskelgewebe zu ermöglichen.

8. Gleichzeitige optische Stimulation und Videoaufzeichnung der NMJ-Funktion (Tag 24+)

1. Verwenden Sie für die Bildgebung ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einer wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleiter-Kamera (sCMOS).
2. Stellen Sie das Binning der Kamerasoftware auf 2x2, die Belichtung auf 20 ms, den Rolling-Shutter-EIN, die Ausleserate auf 540 MHz, den Dynamikbereich: 12-Bit & Gain 1 und den Sensormodus: Überlappung.
3. Verwenden Sie ein 2-faches Objektiv auf dem Mikroskop, um das Mikrogewebe abzubilden.
4. Befestigen Sie eine Lebendzellkammer (37 °C, 5% CO₂) an der Mikroskopstufe.
5. Wählen Sie die Region of Interest (ROI) aus, die das innervierte Skelettgewebe enthält, um die Dateigröße und die Verarbeitungszeit zu minimieren.
6. Platzieren Sie einen 594-nm-Langpass-Emissionsfilter zwischen der Probe und dem abbildenden Objektiv, um blaue Lichtimpulse aus der Kamera herauszufiltern.
7. Legen Sie eine rechteckige 4-Well-Platte mit 4 Bioreaktoren (24 Gewebe) in die Lebendzellkammer.
8. Klicken Sie auf Live-Ansicht. Zentrieren und fokussieren Sie das Bild mit dem gewünschten ROI.
9. Laden Sie den benutzerdefinierten Makrocode aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) hoch, um die Bühnenposition, das Arduino-Board und die Videoaufnahme zu steuern.
10. Legen Sie den Ausgabefilm wie folgt fest: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Führen Sie den Makrocode mit den gewünschten X,Y-Koordinaten auf der Bühne aus und erfassen Sie einen schnellen Zeitraffer mit 1700 Bildern bei 50 Bildern/s.
12. Ersetzen Sie das Medium nach der Bildgebung und bringen Sie die Proben zurück in den Inkubator. Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen den Bildaufnahmesitzungen, um eine Ermüdung des Gewebes zu vermeiden.

9. Stapelverarbeitung und Analyse (Tag 24+)

1. Filmverarbeitung
   1. Verwenden Sie den benutzerdefinierten MATLAB-Code, um die Videos in der Batch-Analyse zu verarbeiten. Die Dateien können aus dem GitHub-Ordner (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) heruntergeladen werden. Die Funktionen sind in Tabelle 2 aufgelistet und erläutert.
      HINWEIS: Der Code ist mit den Formaten .nd2 und .czi kompatibel. Es erfordert die parallele Verarbeitung, die in MATLAB aktiviert werden muss, und benötigt das Bioformatpaket.
   2. Führen Sie das Skript recursiveOSAnalysis aus, um die Filme durch parallele Verarbeitung zu analysieren. Halten Sie alle erworbenen Videos im selben Ordner und wählen Sie diesen Ordner aus, wenn Sie den Code ausführen.
   3. Passen Sie die Parameter nach der Analyse nach Bedarf an.
      1. Ändern Sie baselineTime (Option 1), wenn zu Beginn der Aufzeichnung eine spontane Kontraktion aufgenommen wird. Dies zeigt einen anfänglichen Messwert weit über 0 an und erfordert, dass der Frame verschoben wird, um dies zu kompensieren.
      2. Ändern Sie peakThreshold (Option 2), wenn die Kontraktionen nicht registriert werden. Der Code erkennt standardmäßig Kontraktionen, die über 25 % des höchsten Peaks liegen, sodass dieser Wert geändert werden kann.
      3. Ändern Sie minMinProminence und minMinWidth , um die Empfindlichkeit anzupassen, wenn der Beginn jedes Peaks erkannt wird.
   4. Generieren Sie Video- und Diagrammausgaben.
      1. Führen Sie recursiveOSMovie aus, um für jedes Gewebe eine Videodatei mit seiner jeweiligen Kontraktilitätsspur zu generieren.

10. Störung der NMJ-Funktion (Tag 24+)

1. Bereiten Sie die Behandlungsmedien vor, indem Sie den Basalmedien von NbActiv4 einen externen Effektor hinzufügen, der mit 20 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF ergänzt wird.
   1. Verwenden Sie für das MG-Sera-Experiment 20% MG-Patientenseren in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
   2. Verwenden Sie für das BTX-Experiment 5 μg / ml BTX in NbActiv4 + BDNF + GDNF.
2. Stimulieren/Bild mit Schritt 3.2. , um die Baseline aufzuzeichnen.
3. Ersetzen Sie die Medien im Gewebe durch Behandlungsmedien (450 μL/Gewebe).
4. Inkubieren für die gewünschte Zeit (48 h für Patientenseren, 20 min für BTX).
5. Stimulieren/Bild erneut mit Schritt 3.2. um die Funktion nach der Behandlung aufzuzeichnen.
6. Entfernen Sie die Behandlungsmedien und lassen Sie das Gewebe für die gewünschte Zeit ruhen (48 h nach Serenentfernung)
   HINWEIS: Erlauben Sie mindestens 24 Stunden zwischen Stimulation und Bildgebung, um Gewebeermüdung zu vermeiden

Ergebnisse

Neuromuskuläre Verbindungen wurden durch Kokultivierung optogenetischer HiPSC-abgeleiteter Motoneuronen mit nicht-optogenetischem Skelettmuskelgewebe erzeugt. Menschliche primäre Skelettmyoblasten (SkM) wurden in die Plattformen eingesät und unter Verwendung des 2-Wochen-Protokolls in mehrkernige Myotubes differenziert. Die optogenetischen Motoneuronen wurden separat, aber parallel zur Myotube-Differenzierung, differenziert und dann in die Plattform eingesät (Abbildung 1). Die Gewebe beganne...

Diskussion

Dieses System ist ein entwickeltes 3D-Modell für menschliches Gewebe, das Optogenetik und Videoverarbeitung kombiniert, um eine automatisierte und unvoreingenommene Bewertung der NMJ-Funktion zu ermöglichen. Mit einem standardisierten Protokoll haben wir die Fähigkeit nachgewiesen, Veränderungen der NMJ-Funktion während der physiologischen Entwicklung zu messen und die schädlichen Auswirkungen von Pathologien wie Neurotoxinexposition und Myasthenia gravis Patientenseren zu charakterisieren.

Fr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Medien und Nahrungsergänzungsmittel
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Rinderserumalbuminlösung	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selektives Antibiotikum (G418 Sulfat) (50 mg/ml)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, rekombinante humane	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stammzelltechnologien	100-0276
MyoTonic Growth Media	Kit Koch Myosit	MK-4444
N-2 Nahrungsergänzungsmittel	ThermoFisher Scientific	17502-048
NbActiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasales Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872<
strong>Plasticware
30 mm Cage Cube System	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 und ER2-P4
37 µ m Reversibles Sieb, groß	Stem Cell Technologies	27250
546 nm Kurzpass-Anregungsfilter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroitischer Spiegel	Semrock	FF573-Di01– 25x36
594 nm Langpass-Emissionsfilter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm Langpass-Anregungsfilter	Semrock	BLP01-594R-25
Blau (470nm) Rebel LED auf einem SinkPAD-II 10mm quadratischer Sockel - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optik - Integrierte Beine	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Kulturschale	Corning	3261
Kühlkörper	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µ m, 25er Pack, steril	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µ m, 25er Pack, steril	PluriSelect	43-50500-03
Rote (627nm) Rebel LED auf einem SinkPAD-II 10mm quadratischer Sockel - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ringbetätigte Irisblende	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED-Treiber	ThorLabs	LEDD1B, KPS101<
strong>Molds
Sechskant-Abstandshalter mit Innengewinde  3 1/2" 10-32, Teilgewinde 1/2"	MCMASTER	91920A046
Low-Profile  C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosin 3′,5′-cyclisches Monophosphat	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R& D Systems	2634/10
Human CNTF, Forschungsqualität, 5 & Mikro; g	Miltenyl Biotec	130-096-336
Humanes Vitronectin-Protein, CF	R& D Systems	2349-VN-100
Humanes Vitronektin-Protein, CF	F& D Systems	2349-VN-100
IGF1 Rekombinantes humanes Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin-Mausprotein, natürliches	ThermoFisher Scientific	23017015
rekombinantes humanes Agrin-Protein	R& D Systems	6624-AG-050
Rekombinantes humanes GDNF-Protein, CF 50ug	R& D Systems	212-GD-050/CF
Rekombinantes humanes Neurotrophin 3  100 ug	Zellwissenschaften	CRN500D
Rekombinant Human Neurotrophin-4	Zellwissenschaften	CRN501B
Rekombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R& D Systems	1845-SH-100
Rekombinanter Mensch/Maus/Ratte BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinsäure, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Geglätteter Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stammzelltechnologien	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin aus humanem Plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 Dihydrochlorid	Tocris	1254
Antikörper
α-Actinin mAb (Maus IgG1)	Abcam	ab9465
Cholin-Acetyltransferase (ChAT) (Ziege)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Maus IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Maus IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automatisierter Tisch	Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung	MS- 2000 XYZ
Expandierter Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001 ( 115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal	Scientific I-CACC
IX-81 Inverses Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX-ILL100LH
Serie Stage Top Inkubator System	Tokai Hit	STX TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Kamera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard