Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Zusammenfassung

Strukturelle Botanik ist eine unverzichtbare Perspektive, um die Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen vollständig zu verstehen. Bei der Erforschung mykoheterotropher Pflanzen (d.h. Pflanzen, die Kohlenstoff aus Pilzen gewinnen) können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und ihre Beziehungen zu Hyphen, der Quelle von Nährstoffen, aufklären. Eine weitere wichtige Rolle symbiotischer Pilze hängt mit der Keimung von Orchideensamen zusammen; Alle Orchidaceae-Arten sind während der Keimung und des Keimlingsstadiums (anfängliche Mykoheterotrophie) mykoheterotroph, auch diejenigen, die in erwachsenen Stadien Photosynthese betreiben. Aufgrund des Mangels an Nahrungsreserven in Orchideensamen sind Pilzsymbionten unerlässlich, um Substrate bereitzustellen und die Keimung zu ermöglichen. Die Analyse der Keimungsstadien nach strukturellen Perspektiven kann auch wichtige Fragen zur Interaktion der Pilze mit den Samen beantworten. Verschiedene bildgebende Verfahren können angewendet werden, um Pilzendophyten in Pflanzengeweben zu enthüllen, wie in diesem Artikel vorgeschlagen. Freihändige und dünne Schnitte von Pflanzenorganen können gefärbt und anschließend lichtmikroskopisch beobachtet werden. Ein mit Weizenkeimagglutinin konjugiertes Fluorochrom kann auf die Pilze aufgetragen und mit Calcofluor White co-inkubiert werden, um Pflanzenzellwände in der konfokalen Mikroskopie hervorzuheben. Darüber hinaus werden die Methoden der Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für mykoheterotrophe Orchideen detailliert beschrieben und die Möglichkeiten der Anwendung solcher Protokolle in verwandten Pflanzen untersucht. Die symbiotische Keimung von Orchideensamen (d.h. in Gegenwart von Mykorrhizapilzen) wird im Protokoll ausführlich beschrieben, ebenso wie Möglichkeiten, die aus verschiedenen Keimungsstadien erhaltenen Strukturen für Analysen mit Licht-, Konfokal- und Elektronenmikroskopie vorzubereiten.

Einleitung

Strukturforschung in der Botanik, die Pflanzenmorphologie und Anatomie abdeckt, ist grundlegend für das Verständnis des gesamten Organismus^1,2 und bietet unverzichtbare Perspektiven, um Wissen über die Ökologie^, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen zu integrieren und dazu beizutragen³. Methoden in der Pflanzenmorphologie und Anatomie umfassen derzeit Protokolle, Geräte und Kenntnisse, die in jüngster Zeit sowie vor mehr als einem Jahrhundert entwickelt wurden². Die kontinuierliche Durchführung und Anpassung klassischer Methoden (z.B. Lichtmikroskop....

Protokoll

1. Sammeln, Reparieren und Pflegen von Mustern

ANMERKUNG: Voll-MH-Pflanzen können normalerweise im dunklen Waldunterholz 12,13 gefunden werden, hauptsächlich in feuchten und streureichen Gebieten, während MH-Pflanzen teilweise in offeneren Wäldern ^12,13 gefunden werden können. MH-Pflanzen haben in der Regel gut entwickelte unterirdische Organe in einer Vielzahl von Formen und Größen.

1. Erkunden Sie beim Sammeln von MH-Arten den Boden um die Pflanzenbasis, achten Sie darauf, die unterirdischen Organe ....

Ergebnisse

Nach den wesentlichen Stadien der Fixierung von Pflanzengewebe ergeben Zellstrukturen, die dem Lebenszustand unter Berücksichtigung der Morphologie, des Volumens und der räumlichen Organisation von Zellkomponenten und Geweben so ähnlich wie möglich sind¹⁶. Beobachten Sie solche Merkmale in den Proben nach der chemischen Fixierung (Abbildung 4). Abbildung 4C-F stellt ausreichend fixierte Proben unter Licht.......

Diskussion

Bildanalysen in der Pflanzenanatomie und -morphologie haben ein wichtiges Potenzial, Ziele zu erreichen und zum Verständnis der Beziehungen zwischen mykoheterotrophen Pflanzen und ihren unverzichtbaren Pilzendophyten beizutragen, wie Untersuchungen unterirdischer Organe^6,40, Strukturanalysen der symbiotischen Keimung von Samen³⁹ sowie Luft- und Fortpflanzungsstrukturen ⁴¹ zeigen. . Obwohl die strukturelle Botanik in.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aceton	Sigma-Aldrich	179124	(für die Montage von REM-Stubs)
Agar-Agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(für Keimungstests von Samen)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	Fluoreszenzfarbstoff (erkennt Cellulose)
Citrat Pufferlösung, 0,09 M pH 4,8	Sigma-Aldrich	C2488	(für Toluidinblau O-Färbung)
Leitfähiges doppelseitiges Kohlenstoffband	Fisher Scientific	50-285-81	(für REM)
Konfokalmikroskop	Zeiss		(jedes Modell)
Kupfergitter	Sigma-Aldrich	G4776	(für TEM)
Kritischer Punkttrockner	Balzers		(jedes Modell)
Kryostat	Leica Biosystems		(jedes Modell)
Präpariermikroskop	Leica Biosystems		(= Stereomikroskop, beliebiges Modell)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	Schnelleinbettmedium für die Mikroskopie
Ethylalkohol, rein (≥ 99,5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= Ethanol, für Dehydratisierungsprozesse)
Formaldehydlösung, 37%	Sigma-Aldrich	252549	für die Herstellung von NBF-Lösungen)
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histologisches Gewebefixiermittel
Gelatinekapseln für TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(für die Harzpolymerisation in TEM)
Gelatinelösung, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(verdünnt für die Vorbereitung von Objektträgern - OCT-Adhärenz)
Glutaraldehydlösung, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(für Karnovsky" Lösungsvorbereitung)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	Glykolmethacrylat (GMA) Einbettungskit
Jod	Sigma-Aldrich	207772	(für die Herstellung von Lugol-Lösungen)
Blei(II)-nitrat	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (für TEM-Kontrastfärbung)
Lichtmikroskop	Olympus		(beliebiges Modell)
LR Weißes Acrylharz	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophiles Acrylharz für TEM
Lugol Lösung	Sigma-Aldrich	62650	(zum Färben)
Metallstummel für Probenhalterungen	Rave Scientific		(für REM, verschiedene Modelle)
Mikrotom	Leica Biosystems		manuelles Rotationsmikrotom oder anderes Modell
Haferflocken-Agar (OMA)	Millipore	O3506	(für Keimungstests von Samen)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	Einbettungsmedium für gefrorenes Gewebe
Osmiumtetroxid	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (für TEM-Nachfixierung)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	versiegelnde thermoplastische Folie
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127	(für Karnovsky'
Poly-L-Lysin-Lösung, 0,1 % in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(für die Vorbereitung von Objektträgern - OCT-Adhärenz)
Poly-Prep Objektträger	Sigma-Aldrich	P0425	Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger
	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, zum Umhüllen von Proben in GMA-Harz)
Polyethylen-Formteil Becherschalen	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, zum Umhüllen von Proben in GMA-Harz)
Kaliumiodid	Sigma-Aldrich	221945	(für die Herstellung von Lugol-Lösungen)
Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)	Millipore	70139	(für Keimungstests von Samen)
Rasterelektronenmikroskop	Jeol		(jedes Modell)
Silan [(3-Aminopropyl)Triethoxysilan]	Sigma-Aldrich	A3648	(für die Vorbereitung von Objektträgern - OCT-Adhärenz)
Silan-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	Glasobjektträger beschichtet mit Silan
Kieselgel orange, granuliert	Supelco	10087	(für trocknungstechnische Prozesse)
Natriumcacodylattrihydrat	Sigma-Aldrich	C0250	(für Glutaraldehyd-Natriumcacodylat-Puffer)
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (für Karnovsky'
Natriumhypochloritlösung	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (für die Oberflächendesinfektion von Saatgut)
Natriumphosphat zweibasisch, wasserfrei	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (für NBF-Lösung und PB-Zubereitung)
Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4· H2O (für NBF und PB)
Sputter-Coater	Balzers		(jedes Modell)
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (für Kryoprotektion und Keimtest)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(zum Färben)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(zum Färben)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(zum Färben)
Spritze			(3 mL, beliebige Marke, für TEM-Kontrastfärbung)
Spritzenfiltereinheit, Millex-GV 0,22 µ m	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gammasterilisiert (für TEM-Kontrastfärbungen)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	flüssiger Cyanacrylat-Klebstoff, mittlere Viskosität
Toluidinblau O	Sigma-Aldrich	T3260	(zum Färben)
Transmissionselektronenmikroskop	Jeol		(jedes Modell)
Triphenyltetrazolium Chlorid	Sigma-Aldrich	T8877	(für den Tetrazolium-Test bei der Keimung von Samen)
Trinatriumcitrat-Dihydrat	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)· 2H2O (für TEM-Kontrastfärbung)
Ultramikrotom	Leica Biosystems		(jedes Modell)
Uranylacetat	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (für TEM-Kontrastfärbung)
Vakuumpumpe			(jedes Modell)
Weizenkeim-Agglutinin, Alexa Fluor 488 Konjugat	TermoFisher Scientific	W11261	Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Lektin (weist Sialinsäure und N-Acetylglucosaminyl-Rückstände nach)