Method Article

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

DOI:

10.3791/63791

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June 16th, 2022

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1University of California Los Angeles

In This Article

Summary

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Abstract

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Zell-Matrix-Interaktionen vermitteln komplexe physiologische Prozesse durch biochemische, mechanische und geometrische Hinweise und beeinflussen pathologische Veränderungen und therapeutische Reaktionen. Es wird erwartet, dass die Berücksichtigung von Matrixeffekten zu einem früheren Zeitpunkt in der Arzneimittelentwicklungspipeline die Wahrscheinlichkeit des klinischen Erfolgs neuartiger Therapeutika erhöhen wird. Es gibt auf Biomaterialien basierende Strategien, die spezifische Gewebemikroumgebungen in 3D-Zellkultur rekapitulieren, aber die Integration dieser mit den 2D-Kulturmethoden, die hauptsächlich für das Drogenscreening verwendet werden, war eine Herausforderung. Daher beschreibt das hier vorgestellte Protokoll die Entwicklung von Methoden für die 3D-Kultur in miniaturisierten Biomaterialmatrizen in einem Multi-Well-Plattenformat, um die Integration in bestehende Wirkstoff-Screening-Pipelines und konventionelle Assays für die Zelllebensfähigkeit zu erleichtern. Da von den Matrixmerkmalen, die für die Erhaltung klinisch relevanter Phänotypen in kultivierten Zellen entscheidend sind, ein hochgradig gewebe- und krankheitsspezifisches Screening erwartet wird, wird ein kombinatorisches Screening von Matrixparametern erforderlich sein, um geeignete Bedingungen für spezifische Anwendungen zu identifizieren. Die hier beschriebenen Methoden verwenden ein miniaturisiertes Kulturformat, um die Reaktionen von Krebszellen auf orthogonale Variation der Matrixmechanik und der Ligandenpräsentation zu bewerten. Insbesondere zeigt diese Studie die Verwendung dieser Plattform, um die Auswirkungen von Matrixparametern auf die Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen (GBM) auf die Chemotherapie zu untersuchen.

Introduction

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Die erwarteten Kosten für die Entwicklung eines neuen Medikaments sind in den letzten zehn Jahren stetig gestiegen, mit über 1 Milliarde US-Dollar in aktuellen Schätzungen1. Ein Teil dieser Kosten ist die hohe Ausfallrate von Medikamenten, die in klinische Studien aufgenommen werden. Etwa 12% der Arzneimittelkandidaten erhalten schließlich im Jahr 2019 die Zulassung der US-amerikanischen Food & Drug Administration (FDA). Viele Medikamente versagen in Phase I aufgrund unvorhergesehener Toxizität2, während andere, die Sicherheitsstudien bestehen, aufgrund mangelnder Wirksamkeitscheitern können 3. Di....

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Protocol

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Von Patienten abgeleitete GBM-Zelllinien (GS122 und GS304) wurden von Professor David Nathanson (unserem Mitarbeiter) zur Verfügung gestellt, der diese Linien im Rahmen eines vom UCLA Institutional Review Board genehmigten Protokolls (IRB # 10-000655) entwickelte. Zellen wurden de-identifiziert zur Verfügung gestellt, so dass die Zelllinien nicht mit den einzelnen Patienten in Verbindung gebracht werden konnten.

1. Herstellung von Hydrogellösung

  1. Bereiten Sie HEPES-gepufferte Lösung vor, indem Sie HEPES-Pulver bei 20 mM in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert nach vollständiger Sol....

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Results

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AFM-Messungen bestätigten die präzise Kontrolle der Hydrogelmechanik in Abhängigkeit von der UV-Bestrahlungsstärke (mW/cm2) während der Fotovernetzung mit einem speziell angefertigten, Arduino-gesteuerten LED-Array (Abbildung 2A). Die in diesem Protokoll verwendete Hydrogelformulierung ist in Tabelle 2 aufgeführt. Der Abstand der LEDs auf der mitgelieferten Schablone stimmt mit dem Abstand für jede andere Vertiefung einer 384-Well-Platte überein, wodurch die Bildu.......

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Discussion

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Die aktuelle Arbeit präsentiert Methoden zur Erzeugung von 3D-, miniaturisierten Kulturen innerhalb von HA-basierten bei gleichzeitiger Veränderung der Matrixsteifigkeit und der für das Integrin-Engagement verfügbaren Peptide. Diese Technik ermöglicht die systematische Untersuchung, wie Matrixparameter zelluläre Phänotypen (z. B. die Lebensfähigkeit von Krebszellen, die einer Chemotherapie ausgesetzt sind) mit erhöhtem Durchsatz beeinflussen. Frühere Ansätze, einschließlich der hier vorgestellten, haben die Hydrogelsteif.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Die Autoren möchten Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore und Itay Solomon ausdrücklich für ihre Beiträge zu früheren Iterationen des Photogelationsschemas danken. Die Zelllinien GS122 und GS304 wurden großzügig von David Nathanson zur Verfügung gestellt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Kerneinrichtungen der UCLA, die Molecular Screening Shared Resources und das Nano and Pico Characterization Laboratory waren maßgeblich an der Arbeit beteiligt. Chen Chia-Chun wurde von der UCLA Eli und dem Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program unterstützt. Grigor Varuzhanyan wurde durch ein Tumor Cell Biology Traini....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,1 kOhm Widerstände, 6 WDigikey35601k1ft
1,7 mL MikrozentrifugenröhrchenGenesse Scientific21-108
15 mL konisches RöhrchenFisher Scientific14-959-70C
365 nm LEDDigikeyltpl-c034uvh365
384 Well PlatteBio Greiner One781090
40 µ m ZellensiebMTC bioC4040
4-armiges Thiol-terminiertes Polyethylenglykol (20 kDa)Laysan Bio4arm-PEG-SH-20K-1g
6 NPN BJTsDigikey2n5550ta
80 Ohm Widerstände, 0,125 WDigikeyerjj-6enf80r6v
8-armiges Norbornen-terminiertes Polyethylenglykol (20 kDa)Jenkem TechnologyA7025-1
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104500  Dissoziation der Zellen 
Reagenz-AFM-SondenNovascan0,01 N/m Nennfederkonstante, 2,5 & Mikro; m SiO2 Partikel
Arduino IDEArduino1.8.19
Arduino NanoMakerfireMini Nano V3.0 ATmega328P Mikrocontroller Board
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CCK8Abcamab228554
ZentrifugeThermowissenschaftlicheSorvall Legende xtr
CP100STGilsonF148415Pipettenspitzen für Verdrängerpipetten
Cubis Semi-Micro BalanceSartoriusMSA225S100DI
DMEM - F12 (50-50)Life Technologies113300571x
DMSOFisher ScientificBP231-100
DPBS Ca (-) Mg (-)Genesse Scientific25-508
EGFPeprotechAF100-1550 ng/ml
Ethanol, wasserfreiFisher ScientificA405PDI-Wasser hinzufügen, um es auf 70 % zu verdünnenFisherbrand
Klasse B Braunglas-Fläschchen mit GewindeFisher Scientific03-339-23C
Fisherbrand WägepapierFisher Scientific09-898-12B
G21 ErgänzungGemini Bio400-16050x
Hanks Balanced Salt SolutionThermo Fisher Scientific14175095
HCl, ACS, 12MSigma AldrichS25838ADI-Wasser zur Verdünnung auf 1 M
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut des Schweinshinzufügen Sigma AldrichH3149-100Ku25 & micro; g/mL
HEPESSigma AldrichH7006-100G
HeißluftpistoleWagnerHT1000
Integrin-bindendes Sialoprotein (IBSP) PeptidGenscriptCustom OrderGCGYGGGGNGEPRGDTYRAY
Lithiumphenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinat (LAP) , >95%Sigma Aldrich900889-1G
Magnetische RührplatteThermo ScientificSP194715
MikrozentrifugeThermo ScientificSorvall Legend Micro 21R
Microman E EinkanalpipetteGilsonFD10004Direktverdrängerpipette
MikropipettenspitzenVerschiedene HerstellerVerschiedene Größen
mLine MikropipetteSartorious
N-Acetyl CysteinSigma AldrichA7250-10G
Nanowizard 4BrukerAFM Mikroskop
NaOHFisher Scientificss255-1DI-Wasser hinzufügen, um es auf 1 M zu verdünnen
NormoicinInvivogenant-nr-1500x
Osteopontin PeptidGenscriptCustom OrderGCGYGTVDVPDGRGDSLAYG
PipettenhilfeDrummond4000102
Einfache ObjektträgerGlobe Scientific1301
Press-to-Seal Silikon-Isolator, 12-4,5 mm Durchmesser x 2 mm tiefGrace Bio Labs664201-ASchneiden Sie so, dass 8 einzelne Formen aus einem einzigen Blatt hergestellt werden
Verarbeitung Verarbeitung3.5.4
Repeater M4Eppendorf4982000322
Repeater PipettenspitzenSartorious300894301 mL Größen
RGD PeptidGenscriptGCGYGRGDSPG
Scoth Tape
Serologische PipettenGenesse Scientific12-102,12-1045,10 mL Pipetten
LötpasteDigikey315-NC191LT15T5-ND
Lötdraht
Gerade PräparierzangeVWR Scientific82027-408
Synergy H1 Plate ReaderBiotek
T-75 Zellkulturbehandelte FlascheGenesee Scientific25-209
TemozolomidSigma AldrichT2577Typischerweise verwendet von 10 & Mikro; M bis 100 &Mikro; M
Tenascin-C PeptidGenscriptGCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR
GV
Thiolierte Hyaluronsäure (700 kDa), 6-8% modifiziertLifecore BiomedicalHA700K5
VWR Spinbar, Floh MicroVWR58948-375

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
  2. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug....

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Hydrogel Arrays3D Tumor ModelsMatrix ComponentsDrug ScreeningCell Matrix InteractionsGlioblastoma CellsMiniaturized 3D CultureMatrix MechanicsCell Viability AssayPhoto Cross Linking

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