Summary
يصف هذا البروتوكول منصة تجريبية لتقييم آثار الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية على استجابات العلاج الكيميائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي المشتقة من المريض في مزارع محاكاة مصفوفة 3D باستخدام جهاز إضاءة الأشعة فوق البنفسجية المصنوع خصيصا لتسهيل الربط الضوئي عالي الإنتاجية للهيدروجيل مع ميزات ميكانيكية قابلة للضبط.
Abstract
تتوسط تفاعلات مصفوفة الخلايا العمليات الفسيولوجية المعقدة من خلال الإشارات الكيميائية الحيوية والميكانيكية والهندسية ، مما يؤثر على التغيرات المرضية والاستجابات العلاجية. ومن المتوقع أن يؤدي حساب آثار المصفوفة في وقت مبكر من خط أنابيب تطوير الأدوية إلى زيادة احتمال النجاح السريري للعلاجات الجديدة. توجد استراتيجيات قائمة على المواد الحيوية تلخص بيئات دقيقة محددة للأنسجة في زراعة الخلايا 3D ولكن دمجها مع طرق زراعة 2D المستخدمة في المقام الأول لفحص الأدوية كان تحديا. وبالتالي ، فإن البروتوكول المقدم هنا يفصل تطوير طرق لزراعة 3D داخل مصفوفات المواد الحيوية المصغرة في شكل لوحة متعددة الآبار لتسهيل التكامل مع خطوط أنابيب فحص الأدوية الحالية والفحوصات التقليدية لصلاحية الخلية. وبما أنه من المتوقع أن تكون ميزات المصفوفة الحاسمة الأهمية للحفاظ على الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا في الخلايا المستزرعة خاصة بالأنسجة والأمراض، فإن الفحص التوافقي لبارامترات المصفوفة سيكون ضروريا لتحديد الظروف المناسبة لتطبيقات محددة. تستخدم الطرق الموضحة هنا تنسيق ثقافة مصغر لتقييم استجابات الخلايا السرطانية للتباين المتعامد لميكانيكا المصفوفة وعرض الرباط. على وجه التحديد ، توضح هذه الدراسة استخدام هذه المنصة للتحقيق في آثار معلمات المصفوفة على استجابات خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) المشتقة من المريض للعلاج الكيميائي.
Introduction
ارتفعت التكلفة المتوقعة لتطوير دواء جديد بشكل مطرد على مدى العقد الماضي ، مع أكثر من مليار دولار في التقديرات الحالية1. جزء من هذه النفقات هو ارتفاع معدل فشل الأدوية التي تدخل التجارب السريرية. ما يقرب من 12٪ من الأدوية المرشحة تحصل في نهاية المطاف على موافقة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) في عام 2019. تفشل العديد من الأدوية في المرحلة الأولى بسبب السمية غير المتوقعة2 ، في حين أن الأدوية الأخرى التي تجتاز تجارب السلامة قد تفشل بسبب نقص الفعالية3. يمكن تفسير هذا الاستنزاف بسبب عدم الفعالية جزئيا بحقيقة أن نماذج السرطان المستخدمة أثناء تطوير الأدوية غير تنبؤية بالفعالية السريرية4.
يمكن أن تعزى التفاوتات الوظيفية بين النماذج المختبرية ونماذج الجسم الحي إلى إزالة الخلايا السرطانية من بيئتها الدقيقة الأصلية ، بما في ذلك الخلايا غير السرطانية و ECM 5,6 المادي. عادة ، تستخدم مجموعات البحث مصفوفات استزراعية متاحة تجاريا ، مثل Matrigel (مصفوفة غشاء قبو بروتينية مشتقة من ساركوما الفئران) لتزويد الخلايا السرطانية المستزرعة ببيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد. بالمقارنة مع ثقافة 2D ، حسنت ثقافة 3D في مصفوفة الغشاء من الأهمية السريرية للنتائج في المختبر 7,8. ومع ذلك ، فإن المواد الحيوية المستزرعة من الأنسجة الخالية من الخلايا ، بما في ذلك مصفوفة الغشاء ، عادة ما تظهر تباينا من دفعة إلى أخرى قد يعرض للخطر قابلية التكاثر9. علاوة على ذلك ، قد لا توفر المصفوفات المشتقة من الأورام ذات الأصول النسيجية المختلفة عن تلك التي تمت دراستها الإشارات الفسيولوجية المناسبة10. وأخيرا، فإن السرطانات ذات الدرجات العالية من عدم التجانس داخل الفخذ لها سمات بيئية دقيقة تختلف على نطاق دون الميكرون ولا يمكن ضبط مصفوفة الغشاء لتلخيصها11.
الورم الأرومي الدبقي (GBM) ، وهو ورم دماغي قاتل بشكل موحد مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة لمدة 15 شهرا تقريبا ، هو سرطان كان تطوير العلاج له صعبا بشكل خاص12,13. يتكون المعيار الحالي لرعاية GBM من استئصال الورم الأولي ، يليه العلاج الإشعاعي ، ثم العلاج الكيميائي باستخدام temozolomide (TMZ)14. ومع ذلك ، فإن أكثر من نصف أورام GBM السريرية تظهر مقاومة للعلاج من خلال آليات مختلفة15،16،17. من الصعب للغاية التنبؤ بفعالية نظام العلاج لمريض فردي. تتكون النماذج القياسية قبل السريرية المستخدمة للتنبؤ بالنتائج الفردية من خلايا الورم المشتقة من المريض والتي يتم تطعيمها بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في حين أن xenografts المشتقة من المريض يمكن أن تلخص العديد من جوانب أورام GBM السريرية وهي ذات قيمة للنماذج قبل السريرية18 ، إلا أنها مكلفة بطبيعتها ، وإنتاجية منخفضة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وتنطوي على مخاوف أخلاقية19. مزارع الخلايا المشتقة من المريض ، على الأسطح البلاستيكية 2D أو كروية ، في الغالب تجنب هذه القضايا. في حين أن الخلايا المشتقة من المريض تحافظ على الانحرافات الجينية ، فإن ثقافاتها في 2D أو كرويات معلقة كانت إلى حد كبير تمثيلات ضعيفة للأزينوفاتات المشتقة من المريض في القوارض وأورام المرضى الأصلية20. في السابق ، أظهرنا ، ونحن ، وآخرون ، أن خلايا GBM المستزرعة في ECM 3D التي تحاكي الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية لأنسجة المخ يمكن أن تحافظ على الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية10،21،22،23.
التفاعلات بين حمض الهيالورونيك (HA) ، وهو عديد السكاريد الوفير في الدماغ ECM والمبالغة في التعبير عنه في أورام GBM ، ومستقبلات CD44 الخاصة به تعدل اكتساب مقاومة الأدوية في المختبر21،24،25،26،27. على سبيل المثال ، أدى إدراج HA ضمن ثقافات 3D الناعمة إلى زيادة قدرة خلايا GBM المشتقة من المريض على اكتساب مقاومة علاجية. كانت هذه المسؤولية الميكانيكية تعتمد على ارتباط HA بمستقبلات CD44 على خلايا GBM21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ربط integrin بالببتيدات الحاملة ل RGD ، المدمجة في مصفوفات الثقافة ثلاثية الأبعاد ، يضخم المقاومة الكيميائية بوساطة CD44 بطريقة تعتمد على الصلابة21. أبعد من HA ، يختلف التعبير عن العديد من بروتينات ECM ، التي يحتوي العديد منها على مناطق RGD ، بين أورام الدماغ الطبيعية و GBM28. على سبيل المثال ، ذكرت إحدى الدراسات أن 28 بروتينا متميزا من بروتينات ECM تم تنظيمها في أورام GBM29. ضمن هذه البيئة الدقيقة المعقدة لمصفوفة الورم ، تدمج الخلايا السرطانية الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية لإنتاج نمط ظاهري مقاوم معين ، والذي يعتمد على اختلافات صغيرة نسبيا (على سبيل المثال ، أقل من ترتيب الحجم) في معامل يونغ أو كثافة الببتيدات المرتبطة بالتكامل28،29،30.
يميز هذا البروتوكول كيف تفسر الخلايا السرطانية مجموعات فريدة من إشارات المصفوفة وتحدد البيئات الدقيقة المعقدة الخاصة بالمريض والتي تعزز مقاومة العلاج (الشكل 1A). توفر الطريقة الكيميائية الضوئية لتوليد مصفوفات مصغرة ومضبوطة بدقة لثقافة 3D مساحة متغيرة كبيرة ومتعامدة . تم دمج مجموعة مصممة خصيصا من مصابيح LED ، التي تديرها وحدة تحكم دقيقة ، في الهلاميات المائية الضوئية المتقاطعة ضمن تنسيق لوحة 384 بئر لزيادة الأتمتة وقابلية التكرار. وتباينت شدة التعرض عبر البئر لتغيير الخواص الميكانيكية الدقيقة للهيدروجيل الناتج، كما تم تقييمها باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). في حين أن هذه المخطوطة لا تركز على بناء مصفوفة الإضاءة نفسها، يتم توفير مخطط الدائرة (الشكل 1B) وقائمة الأجزاء (جدول المواد) كمساعدات لإعادة إنتاج الجهاز.
يوضح هذا التقرير التوليد السريع لمجموعة من خلايا GBM المستزرعة في بيئات دقيقة فريدة من نوعها ثلاثية الأبعاد حيث كان معامل يونغ (أربعة مستويات عبر ترتيب واحد من الحجم) ومحتوى الببتيد المرتبط بالتكامل (المشتق من أربعة بروتينات ECM مختلفة) متعامدا. ثم تم استخدام هذا النهج للتحقيق في المساهمات النسبية لميكانيكا الهيدروجيل ومشاركة الإنتينجين الخاصة ب ECM على جدوى وانتشار خلايا GBM المشتقة من المريض لأنها تكتسب مقاومة للعلاج الكيميائي temozolomide (TMZ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم توفير خطوط خلايا GBM المشتقة من المريض (GS122 و GS304) من قبل البروفيسور ديفيد ناثانسون (المتعاون معنا) ، الذي طور هذه الخطوط بموجب بروتوكول معتمد من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (IRB # 10-000655). تم توفير خلايا غير محددة الهوية بحيث لا يمكن ربط خطوط الخلايا مرة أخرى بالمرضى الفرديين.
1. إعداد محلول هيدروجيل
- قم بتحضير محلول مخزن مؤقتا ب HEPES عن طريق إذابة مسحوق HEPES عند 20 mM في محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7 بعد الذوبان الكامل.
- في المحلول المخزن ب HEPES ، قم بإذابة HA المعزولة (الوزن الجزيئي الاسمي 700 kDa ، انظر جدول المواد) ، الذي تم إعداده بعد التقرير السابق31 ، بحيث يتم تعديل 6٪ -8٪ من بقايا حمض الكربوكسيل على كل حمض جلوكورونيك باستخدام ثيول ، بتركيز 10 ملغ / مل في محلول عازل.
ملاحظة: يوصى باستخدام قارورة كهرمان لمنع أكسدة الثيول بواسطة الضوء المحيط.- يحرك المزيج باستخدام صفيحة تحريك مغناطيسية (<1000 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما، عادة حوالي 45 دقيقة.
- أثناء ذوبان حمض الهيالورونيك ، قم بإعداد محاليل منفصلة من (1) 100 ملغ / مل من 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa) ، (2) 100 mg / mL من 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa) ، (3) 4 mM من الببتيد المحتوي على السيستين أو السيستين (على سبيل المثال ، GCGYGRGDSPG) ، و (4) 4 mg / mL من LAP في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد كل من هذه الحلول الأربعة في الحل المخزن مؤقتا ب HEPES الذي تم إعداده في الخطوة 1.1. دوامة الحلول لضمان الحل الكامل لكل كاشف قبل تنفيذ الخطوة 4.
ملاحظة: في حالة اختبار العديد من الببتيدات المختلفة ، يجب أن يحتوي كل منها على سيستين أو مصدر آخر من ثيول مويتي لكيمياء الاقتران هذه. - قم بإعداد المحاليل (4 mM المتاحة ثيول) من جميع الببتيدات ليتم ربطها داخل هيدروجيل واحد في هذه المرحلة.
ملاحظة: تسلسل الببتيد وبروتينات ECM التي اشتقت منها واستخدمت في هذه الدراسة مدرجة في الجدول 1. يمكن استبدال N-acetyl cysteine (انظر جدول المواد) ، الذي لا ترتبط به الخلايا ، بالببتيد النشط بيولوجيا المحتوي على الثيول لمعايرة تركيز الببتيد اللاصق أو العمل كعنصر تحكم سلبي31.
- قم بإعداد كل من هذه الحلول الأربعة في الحل المخزن مؤقتا ب HEPES الذي تم إعداده في الخطوة 1.1. دوامة الحلول لضمان الحل الكامل لكل كاشف قبل تنفيذ الخطوة 4.
- امزج المحاليل الفردية من HA و PEG-Norbornene و PEG-thiol والببتيدات المحتوية على السيستين / الثيول (انظر جدول المواد) لتحقيق التركيزات النهائية لمصفوفات الهيدروجيل النهائية المدرجة في الجدول 2. حرك (<1000 دورة في الدقيقة) على لوحة تحريك مغناطيسية لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تمتزج تماما.
ملاحظة: تتميز حلول HA بأنها شديدة اللزوجة ومن الأفضل التعامل معها باستخدام ماصة إزاحة إيجابية (انظر جدول المواد). إذا لم تكن ماصة الإزاحة الإيجابية متوفرة ، فيمكن أيضا الاستغناء عن المحاليل اللزجة بماصة دقيقة قياسية عن طريق السحب ببطء باستخدام أطراف فتحة عريضة.
2. الإضاءة والربط الضوئي للهيدروجيل عبر صفيف LED
تنبيه: ارتد نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية وقم بتغطية مجال الإضاءة بمواد ممتصة للأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: يتكون صفيف LED الموصوف في هذا البروتوكول من ست مجموعات من ثمانية مصابيح LED موضوعة في سلسلة، كما هو موضح في مخطط الدائرة المقدم (الشكل 1A). يمكن تشغيل كل مجموعة من مصابيح LED بشكل مستقل ، مما يسمح بما يصل إلى ستة إشعاعات مختلفة لكل تشغيل. يحتوي الملف التكميلي 1 على لقطات شاشة تتوافق مع الإرشادات التالية لمزيد من الإرشادات.
- قم بتنزيل ملف جهاز الإضاءة.zip من ملفات الترميز التكميلية. يحتوي هذا الدليل على الملفات التالية: Arduino.zip (ملف الترميز التكميلي 1) ، برامج التشغيل .zip (ملف الترميز التكميلي 2) ، واجهة المستخدم الرسومية .zip (ملف الترميز التكميلي 3) ، و Holder.zip (ملف الترميز التكميلي 4).
ملاحظة: 3D طباعة الأجزاء العلوية والسفلية لتثبيت لوحة الدوائر في مكانها (انظر ملفات الترميز التكميلية للحصول على التفاصيل). - قم بتنزيل برنامج المتحكم الدقيق وتثبيته (انظر جدول المواد).
- قم بتنزيل برنامج واجهة المستخدم الرسومية وتثبيته (انظر جدول المواد). راجع الملف التكميلي 1 للحصول على إرشادات تشغيل البرنامج.
- افتح المعالجة وقم بتثبيت مكتبة controlIP5 عبر النقر فوق Sketch > استيراد المكتبة > إضافة مكتبة. ثم ابحث عن controlIP5 في المكتبات وانقر فوق تثبيت. قم بإجراء هذا لأول مرة.
- قم بتشغيل جهاز الإضاءة (انظر جدول المواد) باستخدام مصدر الطاقة 36 فولت وقم بتوصيله بجهاز كمبيوتر باستخدام كبل micro-USB.
ملاحظة: لن تقوم بعض الأجهزة بتثبيت برامج التشغيل تلقائيا للوحات Arduino nano المختلفة. يتم توفير مجموعة واحدة من برامج التشغيل في ملف zip للجهاز. - افتح الملف Arduino.ino، الموجود في المجلد Adruino.zip، باستخدام Arduino IDE.
- قم بترجمة ملف Arduino.ino بالنقر فوق الزر علامة اختيار . قم بتحميل الرمز المترجم بالنقر فوق الزر سهم .
- افتح الملف GUI.pde الموجود في المجلد GUI.zip باستخدام المعالجة.
- انقر فوق تشغيل في برنامج المعالجة لتشغيل واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في جهاز الإضاءة.
- في نافذة واجهة المستخدم الرسومية ، انقر فوق الكثافة للعمود الذي يحتوي على محلول سلائف الهيدروجيل ليتم ربطه وإدخال الكثافة المطلوبة. انقر على مربع الوقت وأدخل الوقت المطلوب. بالنسبة للحل المقدم في الجدول 2 ، سيكون هذا 15 ثانية.
ملاحظة: يحتاج المستعملون النهائيون إلى معايرة قيم الكثافة الرقمية إلى الإشعاع باستخدام مقياس إشعاعي. وترد أمثلة على الشدة النموذجية في الشكل 2 ألف. - قم بمحاذاة العينات مع جهاز الإضاءة (الشكل 2B) مع كل مصباح LED آخر في عمود واحد من قوالب السيليكون (انظر جدول المواد) أو لوحة 384 بئرا. انقر فوق إنهاء لبدء الإضاءة. كرر هذه العملية حسب الضرورة لإضاءة شرائح متعددة أو آبار أخرى للوحة 384 بئرا.
ملاحظة: تم تصميم الحامل بحيث يجلس صفيحة البئر 384 مع زاوية واحدة من الغرفة الداخلية أثناء الإضاءة.- بعد الإضاءة ، عند وضعها في زاوية واحدة ، حرك لوحة البئر إلى الزاوية التالية وكررها. لإضاءة الآبار على النصف الآخر من اللوحة ، ارفع اللوحة خارج الحامل وقم بتدوير 180 درجة.
- توليد هيدروجيل مع ميكانيكا مختلفة للتوصيف الميكانيكي باتباع الخطوات أدناه.
- نظف الشرائح الزجاجية وقوالب السيليكون باستخدام شريط لإزالة الحطام. قم بلصق قوالب السيليكون بالشريحة الزجاجية ، واضغط لأسفل لضمان ختم جيد ، وإزاحة أي فقاعات هواء.
- ماصة 80 ميكرولتر من محلول سلائف الهيدروجيل ، كما هو معد في الخطوة 1.4 ، في كل قالب سيليكون على الشريحة الزجاجية.
- ضع الشريحة الزجاجية على جهاز الإضاءة المحاذي لكل مؤشر LED آخر في عمود واحد. تعريض سلائف الهيدروجيل للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 ثانية ، كما هو موضح في الخطوة 2 ، إلى photocrosslink.
- بمجرد توقف الإضاءة ، استرجع الشرائح ، وقم بفك المواد الهلامية من القوالب عن طريق تتبع المحيط الداخلي للقالب بطرف ناعم (طرف ماصة 10 ميكرولتر ، إبرة 30 جم ، إلخ). قم بإزالة قوالب السيليكون باستخدام ملاقط / ملقط.
- انقل الهلاميات المائية المتشابكة إلى آبار فردية من صفيحة مكونة من 12 بئرا عن طريق ترطيب ملعقة ودفعها بلطف من الشريحة الزجاجية. املأ كل بئر ب 2 مل من DPBS (انظر جدول المواد) قبل إضافة الهيدروجيل. قم بنفخ المواد الهلامية في محلول DPBS لمدة 12 ساعة على الأقل (عادة بين عشية وضحاها) في درجة حرارة الغرفة (للتوصيف الميكانيكي لليوم التالي).
3. قياسات مجهر القوة الذرية (AFM)
- قم بتشغيل مجهر القوة الذرية (AFM) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). يوفر هذا البروتوكول تعليمات موجزة لاستخدام الأداة والبرامج ذات الصلة.
- قم بتثبيت مسبار AFM (انظر جدول المواد).
ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة، تم تعديل ناتئ نيتريد السيليكون المثلث مع ثابت نابض اسمي قدره 0.01 N/m بجسيم كروي من ثاني أكسيد السيليكون 2.5 ميكرومتر. - بعد التثبيت ، قم بمحاذاة الليزر إلى قمة المسبار الثلاثي ، ثم اضبط المرآة وانحراف الليزر لزيادة مجموع الإشارة إلى أقصى حد (عادة بين 1.5-2.2 فولت).
- اغمر المسبار في DPBS وانتظر لمدة تصل إلى 15 دقيقة للحصول على التوازن الحراري. انقر فوق الزر معايرة وحدد المعايرة المعتمدة على جهات الاتصال . انقر فوق الزر جمع الضبط الحراري ، وبعد جمع البيانات ، حدد الذروة حول 3 كيلو هرتز للمعايرة.
ملاحظة: قد يكون من الضروري إجراء تعديل طفيف للمرآة وانحرافات الليزر بعد الغمر في سائل بسبب تغيرات معامل الانكسار. - اقترب من سطح طبق بتري (بلاستيكي) عن طريق تعيين معلمات الاقتراب على سرعة ثابتة ، وارتفاع مستهدف يبلغ 7.5 ميكرومتر ، وسرعة اقتراب تبلغ 15 ميكرومتر / ثانية. تمكين قياس خط الأساس لكل تشغيل للنهج بحيث يعمل النهج بشكل مستمر ولا يتوقف مبكرا بسبب الانجراف في الانحراف.
- عند الاقتراب ، قم بتعيين معلمات الاستحواذ لرسم خرائط القوة إلى 4 nN ، ومسافة بادئة 2 ميكرومتر ، وسرعة 1 ميكرومتر / ثانية ، ووقت اتصال 0 ثانية. اضغط على الزر ابدأ لبدء جمع منحنى قوة على السطح البلاستيكي (على سبيل المثال، لوحة بئر).
- ارجع إلى نافذة المعايرة وحدد جزء منحنى القوة المقابل لملامسة البلاستيك والمسافة البادئة له. اقبل قيم الحساسية والصلابة المحسوبة للمسبار لإكمال المعايرة.
- بعد المعايرة ، ارفع مسبار AFM وضع عينة الهيدروجيل للاستجواب. اقترب من هيدروجيل باتباع الإعدادات الواردة في الخطوة 5.
ملاحظة: أثناء إجراء الاقتراب تجاه سطح الهيدروجيل ، قد تؤدي الوحدة عن طريق الخطأ إلى تشغيل الحالة المقتربة. للتحقق من النهج الفعلي، احصل على منحنى قوة كما في الخطوة 4.6. كرر إجراء النهج إذا كان المنحنى الناتج لا يظهر الاتصال والمسافة البادئة الناتجة. - عند نجاح نهج السطح، قم بالتبديل إلى وضع تعيين القوة واضبط معلمات الاكتساب على خريطة بحجم 8 × 8 بطول 40 ميكرومتر لكل محور. الحصول على خرائط القوة في مناطق مختلفة لتقييم توحيد قياسات الصلابة.
- تفسير منحنيات القوة باستخدام البرنامج JPK SPM Data Processing من خلال نموذج Hertz / Sneddon المناسب (المعادلات 1 و 2 ، انظر الجدول 3 لتعريف جميع المتغيرات) مع الهندسة الكروية المختارة32,33,3 4.
المعادلة 132
المعادلة 232
- تفسير منحنيات القوة باستخدام البرنامج JPK SPM Data Processing من خلال نموذج Hertz / Sneddon المناسب (المعادلات 1 و 2 ، انظر الجدول 3 لتعريف جميع المتغيرات) مع الهندسة الكروية المختارة32,33,3 4.
المعادلة 132
المعادلة 232
4. إعداد وعلاج المخدرات من الثقافات 3D ، مصفوفة جزءا لا يتجزأ من
- تحضير الخلايا المطلوبة كمحلول خلية واحدة.
ملاحظة: قد تتطلب أنواع الخلايا المختلفة طرق تمرير مختلفة. تم الإبلاغ عن بروتوكول نموذجي لتمرير ثقافة تعليق من الكرويات GBM من قارورة T-75 في المرجع31. - اجمع كرويات GBM (قطرها 150 ميكرومتر تقريبا) من مزرعة تعليق قارورة T-75 في أنبوب مخروطي 15 مل. شطف قارورة الثقافة مع 5 مل من DPBS لإزالة أي خلايا ووسائط متبقية وإضافة هذا الحجم إلى الأنبوب المخروطي.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي الذي يحتوي على خلايا عند 200 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الفائقة باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية ، وإعادة التعليق في 5 مل من DPBS.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا. قم بشفط السوبرناتانت باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية ، ثم أعد تعليق الخلايا في 2 مل من كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد).
- حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة. أضف 3 مل من الوسط الكامل (انظر جدول المواد) وماصة بلطف 3-5 مرات لتحطيم الكرويات إلى تعليق خلية واحدة31.
- قم بطرد مركزي للتعليق أحادي الخلية عند 400 × g (قد يتم نسج المعلقات أحادية الخلية بشكل أسرع لتشكيل الكريات) لمدة 5 دقائق لخلايا الكريات في درجة حرارة الغرفة. استنشاق supernatant مع ماصة مصلية 5 مل ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الكامل.
ملاحظة: إذا بقيت الخلايا في كتل ، بدلا من الخلايا المفردة في التعليق ، بعد المرور ، يمكن تمرير الخلايا عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر لتحقيق تعليق خلية واحدة. - قم بإزالة جزء من الخلايا للعد باستخدام مقياس الدم. قم بتخفيف هذا الجزء مرتين باستخدام أزرق التربان ، الذي يتخلل الخلايا ذات الجدوى المعرضة للخطر. عد فقط الخلايا الحية عديمة اللون. عادة ، ينتج T-75 البذر في 800000 خلية لكل قارورة 2-3 مليون خلية بعد أسبوع في الثقافة.
- تحديد عدد الخلايا اللازمة للتغليف. انقل كمية من الوسائط التي تحتوي على إجمالي عدد الخلايا اللازمة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.7 مل. تدور لأسفل عند 400 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: على سبيل المثال ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2.5 مليون خلية أعيد تعليقها في 1 مل من حجم الجل لتغليف الخلايا عند 2.5 مليون خلية / مل. يسمح حجم الجل البالغ 1 مل للمستخدمين بتوزيع 100 قطرة هلام ، حيث تبلغ كل قطرة هلام 10 ميكرولتر. يوصى بإعداد حجم إضافي ~ 20٪ من الخلايا المعلقة في محلول الهيدروجيل لحساب الخسارة أثناء نقل الماصة. وبالتالي ، يمكن للمرء أن يعد 3 ملايين خلية و 1.2 مل من محلول سلائف الهيدروجيل في هذا المثال. يوصى بكثافة لا تقل عن 500 ألف خلية / مل. - استنشاق supernatant مع micromatete ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلايا في محلول سلائف الهيدروجيل ، كما هو معد في الخطوة 1.4 ، واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة دقيقة سعة 1000 ميكرولتر 4-5 مرات.
- قم بتحميل الخلايا في ماصة متكررة (انظر جدول المواد) تم ضبطها لتوزيع 10 ميكرولتر. لتجنب الفقاعات والاستغناء غير المتكافئ ، قم بتجهيز الماصة المتكررة عن طريق توزيع 1-2 مرات إضافية في حاوية نفايات.
- في كل بئر من صفيحة 384 بئرا ، قم بتوزيع 10 ميكرولتر من الخلايا المعلقة في محلول هيدروجيل من الماصة المتكررة. باستخدام صفيف LED ، قم بإضاءة كل بئر يحتوي على خلايا (الخطوة 2) لمدة 15 ثانية بكثافة (نتائج المثال في الشكل 2A استخدمت كثافة 1.14 و 1.55 و 2.15 و 2.74 mW / cm2) لتحقيق الخصائص الميكانيكية المطلوبة.
ملاحظة: يقترح البدء بخمسة نسخ متماثلة لكل حالة تجريبية والتوسع لأعلى أو لأسفل اعتمادا على الإنتاجية المطلوبة وتباين فحص نقطة النهاية. - أضف 40 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى كل بئر يحتوي على الخلايا. أضف 50 ميكرولتر من DPBS إلى الآبار الجافة غير التجريبية المحيطة بالمواد الهلامية لتقليل الخسائر الناجمة عن التبخر.
- بالنسبة لخلايا GBM ، أضف 40 ميكرولتر من الدواء المحتوي على الوسائط (على سبيل المثال ، TMZ ، انظر جدول المواد) لتحقيق التركيز النهائي المطلوب (10 μM-100 μM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو السيارة (DMSO) ، وفقا لذلك ، بدءا من 3 أيام بعد التغليف.
5. اختبار انتشار CCK8
- أضف 10 ميكرولتر من كاشف CCK8 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر يحتوي على الخلايا.
ملاحظة: في حالة إجراء هذا الفحص لأول مرة، قم بتضمين آبار التحكم السلبية مثل الوسائط فقط أو الهيدروجيل الخالي من الخلايا في الوسائط. - احتضان لمدة 1-4 ساعات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: قد تختلف هذه المرة كدالة لنوع الخلية وكثافتها ، وبالتالي يجب اختبار أوقات الحضانة لكل تطبيق بحيث تقع قيم الامتصاص ضمن نطاق خطي ، وهو شرط لتطبيق قانون البيرة35. - اقرأ الامتصاص عند 450 نانومتر لجميع الآبار بعد الحضانة.
- احسب متوسط الامتصاص عند 450 نانومتر الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3 لحالة السيارة لكل مجموعة. قسم كل دواء يعالج بشكل جيد على متوسط التحكم في السيارة لكل مجموعة.
- حساب فترات الثقة عن طريق إنشاء توزيعات bootstrap (N = 10,000) من خلال طريقة النسبة المئوية36.
ملاحظة: بشكل عام ، يمكن للمرء استخدام فترات ثقة بنسبة 95٪ وتفسير الظروف التي لا تتجاوز فترات الثقة فيها 1 لتكون مهمة وتستدعي مزيدا من التحقيق. إن تحديد فترات الثقة إلى 95٪ يتوافق مع تحديد حد أهمية p = 0.05. وبالنسبة للبيانات المبينة في النتائج، هناك فائدة في التمييز بين الظروف التي تعزز أو تمنع مقاومة الأدوية بوساطة المصفوفة، مما يتطلب تحليلا ذا جانبين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أكدت قياسات AFM التحكم الدقيق في ميكانيكا الهيدروجيل كدالة للإشعاع فوق البنفسجي (mW / cm2) أثناء الربط المتقاطع للصور باستخدام صفيف LED مصمم خصيصا يتم التحكم فيه بواسطة Arduino (الشكل 2A). يمكن العثور على تركيبة الهيدروجيل المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 2. يتطابق تباعد مصابيح LED على القالب المقدم مع التباعد لكل بئر آخر لصفيحة 384 بئرا ، مما يسمح بتكوين المواد الهلامية داخل اللوحة (الشكل 2B). أظهر استجواب AFM للمناطق ذات المقياس الميكروني على أسطح الهلاميات المائية المفردة أن الهلاميات المائية ذات المتوسط الأكثر ليونة من وحدات يونغ لديها أيضا نطاقات أصغر من المودولي من الهلاميات المائية الأكثر صلابة (الشكل 2C-E).
يجب تحديد كثافات بذر الخلايا التي تزيد من الجدوى تجريبيا لكل نوع من أنواع الخلايا. توضح هذه الدراسة أن الثقافات ثلاثية الأبعاد لخلايا GS122 المزروعة بكثافات 2,500,000 خلية / مل أظهرت جدوى أعلى بكثير عند تقييمها بعد 7 أيام في الثقافة مقارنة بتلك التي زرعت بكثافات 500,000 خلية / مل (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، استخدمت خلايا GS122 و GS304 كنماذج لزراعة خلايا GBM المشتقة من المريض للتحقيق في اعتماد استجابة العلاج الكيميائي على الصلابة والتركيب الكيميائي الحيوي للبيئة الدقيقة للمصفوفة (الشكل 3B-D). تم تقييم صلاحية الخلية من خلال فحص CCK8 بعد العلاج باستخدام TMZ لمدة 4 أيام مما أدى إلى وقت استزراع إجمالي قدره 7 أيام عن طريق قياس OD450 بواسطة التحكم المقابل في السيارة وتوليد فترات ثقة بنسبة 95٪ عن طريق التمهيد (N = 10,000) باستخدام الطريقة المئوية36. مع هذه التوزيعات ، اعتبرت الظروف التي لا تتداخل فيها فترات الثقة مع قيمة 1 (خط متقطع) مهمة. بالمقارنة مع الأساليب الإحصائية الأكثر استخداما مثل اختبارات t أو ANOVA ، يفضل تقدير فترات الثقة ، باستخدام bootstrapping لتقدير التوزيعات التي ستكون موجودة لأحجام العينات الأكبر ، لفحص الفحوصات التي تهدف إلى تحديد مجموعة فرعية أصغر من الشروط لمزيد من التحقيق. إحدى الفوائد الإضافية لهذه الطريقة هي أن الظروف ذات السبريد الأصغر في فترة الثقة يمكن أن تعطى الأولوية على الظروف الأخرى ذات القيمة المتوسطة المماثلة ولكن الفارق الأعلى في فترة الثقة. أشارت هذه الدراسة إلى أن خلايا GS122 اكتسبت فوائد البقاء على قيد الحياة من التفاعلات البيئية الدقيقة (الشكل 3B). كانت فائدة البقاء على قيد الحياة هذه كبيرة في ظروف 0.8 و 1 و 4 كيلوباسكال ولكن ليس في حالة 8 كيلوباسكال لخلايا GS122. كانت خلايا GS304 غير حساسة لكل من الصلابة وعلاج TMZ.
ثم تم فحص تأثير التركيب الكيميائي الحيوي للبيئة الدقيقة للمصفوفة عن طريق تغيير إدراج الببتيدات المشتقة من ECM والملزمة بالتكامل (الجدول 1) المعروفة بأنها غير منظمة في البيئة الدقيقة للورم GBM عند صلابتين ، 0.8 kPa ، و 8 kPa. مرة أخرى ، لم تتلق خلايا GS304 أي فائدة كبيرة للبقاء على قيد الحياة من تضمين المصفوفة وكانت غير حساسة ل TMZ. ومع ذلك، أظهرت خلايا GS122 مكاسب البقاء على قيد الحياة في حالة 8 كيلوباسكال عندما تم تضمين الببتيدات المشتقة من أوستيوبونتين في المصفوفة، في حين أن دمج الببتيدات المشتقة من البروتين السيالوبروتين (IBSP) أو التيناسين سي قدم الحد الأدنى من فوائد البقاء على قيد الحياة، مثل الزراعة في المصفوفات مع الببتيد RGD العام (الشكل 3C). وعلى النقيض من ذلك، لم تمنح أي ببتيدات مكاسب للبقاء على قيد الحياة في حالة الاستزراع البالغة 0.8 كيلوباسكال (الشكل 3D). وتشير النتائج مجتمعة إلى وجود اختلافات جوهرية في كل من استجابات المصفوفة والأدوية بين خطي الخلايا المشتقين من المريض اللذين تم تقييمهما.
يمكن تصور ثقافات الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد باستخدام الفحص المجهري الضوئي القياسي لتقييم كيفية تأثر مورفولوجيا الخلايا والسلوكيات الغازية بظروف الزراعة بطريقة تعتمد على خط الخلية (الشكل 4). تنتشر كل من خلايا GS122 و GS304 عند استزراعها في مصفوفات هيدروجيل ناعمة أو قاسية بما في ذلك الببتيدات المحتوية على RGD (الشكل 4A). في حين أن الببتيدات أثرت على انتشار الخلايا ، فإن قدرة الخلية على الانتشار لم تتنبأ بالضرورة بقدرة الثقافة على اكتساب مقاومة TMZ. على سبيل المثال ، تظهر خلايا GS122 نقصا مماثلا في الانتشار في كل من 0.8 و 8 كيلو باسكال مع osteopontin. ومع ذلك ، أظهر GS122 فقط مقاومة معززة ل TMZ في حالة 8 كيلو باسكال (الشكل 4B). أخيرا ، يمكن استخدام هذه المنصة المصغرة للثقافة ثلاثية الأبعاد لزراعة الخلايا البشرية من أنواع الأورام الأخرى ، بما في ذلك المواد العضوية القابلة للحياة لخلايا سرطان البروستاتا العصبية الصماوية المتمايزة نهائيا (الشكل 4C).
الشكل 1: تصوير الرسوم المتحركة للبروتوكول. (أ) تصوير الرسوم المتحركة لعملية توليد ثقافة 3D ورصدها. (1) يتم إعداد حلول الهيدروجيل القائمة على HA. (2) ثم يتم ربط حلول الهيدروجيل مع كثافة متغيرة من خلال مصابيح LED التي تسيطر عليها وحدة تحكم أردوينو الدقيقة. (3) يتم تقييم ميكانيكا الهيدروجيل الناتجة من قبل AFM للتحقق من الفرق في ميكانيكا الهلام. (4) ثم يتم استخدام المحاليل المطابقة للتركيبة من الخطوة 1 لتغليف خلايا GBM المشتقة من المريض ومعالجتها بالدواء. (5) بعد 7 أيام ، تتم قراءة صلاحية الخلية عبر فحص قياس الألوان CCK8. (ب) مخطط الدائرة لصفيف إضاءة LED المخصص المستخدم في هذا البروتوكول. يتم سرد المكونات الفردية في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: المواد الهلامية المائية المصنعة بصلابة متفاوتة باستخدام مصابيح LED قابلة للضبط لتعديل الإشعاع. (أ) تظهر مخططات الكمان معامل يونغ المحسوب من منحنيات القوة الناتجة عن AFM عبر ثلاث مناطق سطحية ، تمتد على 40 ميكرومتر × 40 ميكرومتر ، من الهلاميات المائية الفردية. يظهر معامل يونغ لكل هيدروجيل كدالة للأشعة فوق البنفسجية أثناء الربط الضوئي. تشير الخطوط البيضاء الأفقية إلى الوسيط لكل مجموعة تجريبية. (ب) مصفوفة LED مع تباعد يطابق درجة ميل الصفائح متعددة الآبار (384 بئرا). (ج) خريطة حرارية تبين التباين الإقليمي لمعامل يونغ (المتوسط = 0.8 كيلوباسكال) لهلام نموذجي متقاطع بالتعرض ل 1.55 ميغاواط/سم 2 ل 15 ثانية. (د) خريطة حرارية تبين التباين الإقليمي لمعامل يونغ (المتوسط = 8 كيلوباسكال) لهلام نموذجي متقاطع عند التعرض ل2.74 ميغاواط/سم2 ل 15 ثانية. (ه) رسم بياني يوضح نطاق قياسات معامل يونغ عبر سطح الهلاميات المائية المبينة في C و D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يكشف العرض المتعامد للصلابة والببتيد المرتبط بالتكامل عن اختلافات بيولوجية جوهرية بين خطوط خلايا GBM . (أ) قيم الامتصاص النموذجية لخلايا GS122 المغلفة في هيدروجيل 10 ميكرولتر بكثافة 500,000 أو 2,500,00 خلية لكل مل. (ب) تصور بيانات الاستجابة للعقاقير لخطوط الخلايا GS122 وGS304 عن طريق تطبيع قيمة OD450 للآبار المعالجة بالعقاقير (N = 5) بمتوسط الآبار المعالجة بالمركبات (N = 5). ولوحظ أن الجدوى في سياق العلاج من تعاطي المخدرات تختلف اختلافا غير خطي بالنسبة لصلابة الهيدروجيل، مما يدل على التباين بين خطوط الخلايا. (ج، د) بيانات الاستجابة للأدوية لخطوط الخلايا GS122 و GS304 عندما تم تضمين نوع الببتيد المرتبط بالتكامل وكانت صلابة المصفوفة متفاوتة بشكل متعامد. تمثل جميع أشرطة الخطأ فترات الثقة بنسبة 95٪ التي تم الحصول عليها من تمهيد كل شرط بواسطة N = 10,000. يتوافق الخط المتقطع (المحور y = 1) مع الحالة التي يساوي فيها OD450 لظروف المعالجة السيارة. تم الحصول على جميع القيم التجريبية بعد 7 أيام في الثقافة. تمت إضافة TMZ بعد 3 أيام من التغليف الأولي للدراسات الدوائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الاختلافات المورفولوجية بين الخلايا المغلفة في بيئات هيدروجيل مختلفة قائمة على HA . (A) صور تباين الطور ل GS122 و GS304 ، عند استزراعها في هيدروجيل (0.8 و 8 كيلو باسكال) ، عرضت زخارف RGD. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا ذات المورفولوجيات المنتشرة. (ب) أظهرت صور الطور ل GS122 و GS304 ، عند استزراعها في هيدروجيل (0.8 و 8kPa) ، ببتيد مشتق من osteopontin. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا ذات المورفولوجيات المنتشرة. تشير الأسهم السوداء إلى خلايا ذات مورفولوجيات مستديرة. بعد 7 أيام في الثقافة ، تم التقاط الصور ، وتمت إضافة TMZ بعد 3 أيام من التغليف الأولي. (ج) صورة مرحلية لعضوي البروستاتا العصبي الصماوي المتمايز نهائيا. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (ل A ، B) ؛ 100 ميكرومتر (ل C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| بروتين | تسلسل الببتيد |
| آر جي دي | GCGYGRGDSPG |
| تيناسين-سي | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| سيالوبروتين الملزم بإنتغرين (IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| أوستيوبونتين | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
الجدول 1: بروتينات ECM وتسلسلات الببتيد المشتقة.
| الكاشف | التركيز الأولي | الحجم (ميكرولتر) | التركيز النهائي |
| حل HA-SH | 10 ملغم/مل | 2300 | 5 ملغم/مل |
| PEG-SH | 100 ملغم/مل | 503 | يختلف من تجربة إلى أخرى |
| بيج نوربورنين | 100 ملغم/مل | 443 | يختلف من تجربة إلى أخرى |
| الببتيد | 4 ميكرومتر | 288 | 0.250 ميكرومتر |
| اللفه | 4 ملغم/مل | 288 | 0.25 ملغم/مل |
| هيبس-إتش بي إس إس | غير متوفر | 798 |
الجدول 2: مكونات الصياغة النهائية النموذجية للهيدروجيل.
| متغير | البارامتر |
| F | أجبر |
| E | معامل يونغ |
| ν | نسبة بواسون |
| δ | المسافة البادئة (موضع الطرف الرأسي) |
| a | نصف قطر دائرة الاتصال |
| آرإس | نصف قطر الكرة |
الجدول 3: المتغيرات والمعلمات المقابلة لحسابات AFM.
الملف التكميلي 1: إرشادات بشأن استخدام مصفوفة LED للإضاءة والربط الضوئي للهيدروجيلات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 1: ملف Arduino لمتحكم مصفوفة LED الدقيق (Arduino.zip). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 2: برامج تشغيل الجهات الخارجية ل Arduino nano (برامج التشغيل .zip). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 3: ملف معالجة للتحكم في واجهة المستخدم الرسومية لوحدة التحكم الدقيقة في صفيف LED (GUI.zip). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 4: ملف للطباعة ثلاثية الأبعاد حامل خارجي لمتحكم مصفوفة LED الدقيق (حامل .zip). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم العمل الحالي طرقا لتوليد 3D ، ثقافات مصغرة داخل HA القائمة على تغيير صلابة المصفوفة والببتيدات المتاحة للمشاركة في Integrin. تمكن هذه التقنية من الدراسة المنهجية لكيفية تأثير معلمات المصفوفة على الأنماط الظاهرية الخلوية (على سبيل المثال ، صلاحية الخلايا السرطانية المعرضة للعلاج الكيميائي) مع زيادة الإنتاجية. وقد ضبطت الأساليب السابقة، بما في ذلك تلك المعروضة هنا، صلابة الهيدروجيل عن طريق تغيير النسبة المئوية للبوليمر الكلي في الصيغة النهائية، حيث تحتوي الهلاميات المائية الأكثر صلابة على نسبة أعلى من البوليمر21,31. ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج إعداد تركيبة هيدروجيل فريدة لكل صلابة مطلوبة ، وهي عملية تقلل الإنتاجية بشكل جوهري. هنا ، يتم ضبط صلابة الهيدروجيل عن طريق الأشعة فوق البنفسجية المختلفة أثناء الربط المتبادل بحيث يمكن الحصول على الهلاميات المائية ذات الصلابة المتعددة من محلول سلائف واحد. يمكن للممارسين المستقبليين الذين قد لا تتاح لهم الفرصة لبناء المصباح المخصص الموصوف هنا استبدال جهاز معالجة البقع بالأشعة فوق البنفسجية المتاح تجاريا وضبط الإضاءة مع علاج قطاعات مختلفة من لوحة البئر. الجانب السلبي لاستخدام جهاز معالجة موضعي تجاري هو انخفاض الإنتاجية مقارنة بالإضاءة المخصصة. أحد القيود المفروضة على الطرق الحالية هو أنه لا يزال يتعين إعداد حلول فريدة لكل حالة من حالات الببتيد. وقد استخدمت طرق مماثلة سابقا من قبل مجموعات أخرى لإنتاج هيدروجيل يحتوي على التدرج الصلابة37,38. ومع ذلك ، توضح هذه الدراسة كيف يمكن للربط الضوئي أن يمكن من تصغير العينات التجريبية وتقليل تعقيد الإعدادات التجريبية. بشكل عام ، ستسمح هذه التحسينات للباحثين بزيادة الإنتاجية التجريبية عند إجراء ثقافات 3D في المواد الحيوية المحاكية للمصفوفة ولها فائدة عبر العديد من المجالات في العلوم الطبية الحيوية خارج علم الأورام العصبي.
توضح النتائج التمثيلية كيف يمكن استخدام هذه التقنية لإعداد ثقافات مصغرة ثلاثية الأبعاد لخلايا GBM المشتقة من المريض في مصفوفات محددة ، حيث تتنوع الببتيدات والصلابة الملزمة للتكامل المتاحة ، ضمن لوحة قياسية من 384 بئرا مناسبة للعديد من الفحوصات القياسية. تقدم هذه الطريقة نتائج تمثيلية لفحص كيفية تأثير معلمات المصفوفة على الاستجابات للعلاج الكيميائي TMZ في خلايا GBM المشتقة من مريضين فريدين ، يشار إليهما باسم خلايا GS122 و GS304. من بين خطي الخلايا المشتقين من المريض اللذين تم تقييمهما هنا ، كانت استجابة خلايا GS122 لعلاج TMZ حساسة للبيئة الدقيقة للمصفوفة ، في حين أن استجابة خلايا GS304 كانت غير حساسة. فيما يتعلق بصلابة المصفوفة ، فإن خلايا GS122 المستزرعة في هيدروجيل ثلاثي الأبعاد مع معامل ضغط دقيق 4 كيلو باسكال زادت من مقاومة TMZ ، وفي ظل هذه الحالة زادت الخلايا المعالجة في العدد أكثر من الخلايا غير المعالجة على مدار دورة تجريبية مدتها 7 أيام. كان للخصائص الميكانيكية تأثيرات أكبر على مقاومة TMZ من الببتيدات المرتبطة بالتكامل المدرجة. وبالتالي، من المتوقع أن يمكن تأثير تركيزات الببتيد المتفاوتة، بمفردها ومجتمعة، من اكتشاف ظروف مصفوفة تعزز مقاومة الأدوية في المستقبل. قد يشير عدم حساسية خلايا GS304 للمصفوفة المحيطة بها إلى أن المصفوفة أكثر تأثيرا على الخلايا ، مثل خلايا GS122 ، التي تكون حساسة في الأصل ل TMZ ولكنها تكتسب مقاومة أثناء العلاج. في المقابل، فإن مدى تأثير إشارات المصفوفة على الخلايا المقاومة للعلاج بالفعل في بداية التجربة غير واضح، كما هو الحال مع خلايا GS304.
انحرفت نتائج هذه الدراسة إلى حد ما عن النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا. عززت أنعم الهلاميات المائية القائمة على HA التي تم تقييمها (معامل يونغ السائب 1 كيلوباسكال ، الذي يحاكي صلابة الدماغ الأصلي) خلايا GBM المقاومة القصوى TMZ المستمدة من أربعة أورام من مرضى مختلفين من تلك التي تم تقييمها هنا21. هناك عدة أسباب محتملة لهذا التناقض. أولا ، تم استجواب مجموعة واسعة من صلابة الهيدروجيل في الدراسة الحالية ، والتي قارنت الهلاميات المائية عبر نطاق من 0.8 كيلو باسكال إلى 8 كيلوباسكال من وحدات الضغط الجزئي ، في حين قارنت الدراسات السابقة فقط الهلاميات المائية مع 1 كيلو باسكال و 2 كيلو باسكال يونغ. بالإضافة إلى ذلك ، في الدراسات السابقة ، تم إجراء التوصيف الميكانيكي على نطاق واسع باستخدام الضغط الميكانيكي الخطي لتقدير معامل يونغ ، بينما ، في هذه الدراسة ، تم استخدام AFM لقياس معامل الضغط الدقيق. بالنسبة للباحثين الذين يسعون إلى تنفيذ الأساليب الموجودة هنا والذين لا يحتاجون إلى قياسات ميكانيكية على نطاق دقيق ، فإن وحدات المقياس السائبة ، باستخدام قياس الريومتر أو الاختبارات الميكانيكية الخطية ، هي بدائل مقبولة تماما ل AFM. والجدير بالذكر أن التحليلات الميكانيكية الدقيقة كشفت عن المعدلات غير المتجانسة عبر سطح هلام واحد. لم يتم إجراء قياسات AFM قابلة للمقارنة على الهيدروجيل الذي تمت صياغته في الدراسات السابقة ، ولكن من المتوقع أن يكون تباين الصلابة المقدمة داخل هيدروجيل واحد أكبر من تلك الموجودة في الدراسة الحالية. تم إنشاء الهلاميات المائية في الدراسات السابقة باستخدام إضافة متقاطعة من نوع مايكل تعتمد على الخلط الحركي عند 37 درجة مئوية10،21،24. في المقابل ، يسمح الربط الضوئي بالخلط الشامل لسلائف الهيدروجيل قبل التعرض للضوء ، مما يحسن التجانس داخل هيدروجيل 3D ، وبالتالي يقلل من تباين استجابات الخلايا. أخيرا ، تظهر أورام GBM سلوكا غير متجانس وغير متوقع39 ، وبالتالي ، من المعقول أن نتوقع أن الخلايا المشتقة من الأورام الفردية سيكون لها أيضا خصائص فريدة. هذا النقص في الاتساق عبر عينات المرضى يحفز الحاجة إلى منصة عالية الإنتاجية لتوضيح خصائص الورم الخاصة بالمريض.
تشمل المزالق الشائعة عند إجراء الربط الضوئي الهيدروجيل المصغر الخلط غير الكامل لسلائف الهيدروجيل ، مما يؤدي إلى ضعف قابلية التكرار ، والهلام التلقائي لمحلول HA أثناء الخلط. ويمكن التخفيف من حدة هذه المشاكل عن طريق تحريك HA-thiol لمدة لا تقل عن 45 دقيقة ومحلول السلائف الكامل لمدة 30 دقيقة إضافية على الأقل مع مراقبة درجة الحموضة لمحاليل سلائف الهيدروجيل عن كثب لضمان بقائها أقل من 7 لمنع أكسدة الثيول وتكوين ثاني كبريتيد إلى الوصلات المتقاطعة. على النقيض من طرق الربط المتقاطع باستخدام آلية إضافة حركية من نوع مايكل10,21 ، فإن طريقة الربط الضوئي المستخدمة في هذا البروتوكول تقلل من احتمال الهلام التلقائي عندما يتم الجمع بين جميع الكواشف 21. يوصى بشدة بنقاط تفتيش مراقبة الجودة ، مثل قياس نسبة ذوبان HA31 وصنع هيدروجيل إضافي للاختبار الميكانيكي المتوازي لكل دفعة من الثقافات ثلاثية الأبعاد. أخيرا ، يجب تحديد كثافات البذر لتغليف 3D في الهلاميات المائية لكل نوع من أنواع الخلايا أو الخط المستخدم. بشكل عام ، تظهر النتائج أن الحد الأدنى من تركيز 1 مليون خلية / مل يكفي لثقافة 3D لمعظم الخلايا ، والتي تشكل كرويات ، بما في ذلك خلايا GBM المشتقة من المريض ، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (H9) ، والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (البيانات غير معروضة). يوصى أيضا بإدراج علاج مثبطات ROCK قبل التغليف (الخطوة 4.1) عند استخدام الخلايا الحساسة بشكل خاص40.
في سياق تطوير نهج علاجية جديدة ل GBM ، يوفر البروتوكول المعروض هنا طرقا للفحص الوظيفي للاستجابات الدوائية لخلايا GBM المشتقة من المريض داخل بيئة دقيقة ذات صلة فسيولوجيا. يتوفر مستودع غني ببيانات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال الوراثي واللاجيني والسريري ل GBM (والسرطانات الأخرى) للجمهور بفضل جهود أطلس جينوم السرطان (TCGA) وغيره15. تستخدم جنبا إلى جنب مع مجموعات البيانات الكبيرة هذه ، ومن المتوقع أن البيانات التي تم إنشاؤها من الشاشات الوظيفية للثقافات المصغرة ثلاثية الأبعاد يمكن أن تكشف عن ارتباطات جديدة ، مما يحسن التنبؤ بالنتائج السريرية لدى المرضى الفرديين. على سبيل المثال ، يمكن تحديد المجموعات الفرعية من أورام المرضى التي قد يحسن بعض العلاج لها ، مثل المركبات التي تعطل المصفوفة مثل cilengitide ، النتائج السريرية41. بالإضافة إلى الاستجابة للعقاقير، تتيح منصة الثقافة هذه إجراء تقييمات لغزو الخلايا السرطانية باستخدام أجهزة تصوير عالية المحتوى متوافقة مع الصفائح الجيدة. إن مرونة هذه المنصة لدمج العديد من الببتيدات المختلفة ، بمفردها أو مجتمعة ، في حين أن الصلابة المتفاوتة بشكل متعامد قد تساعد في تحديد ميزات المصفوفة التي تدفع عدوان ورم GBM.
بالإضافة إلى GBM ، يمكن تكييف هذه الطرق للتحقيق في آثار معلمات المصفوفة على أنواع الخلايا الأخرى في سياق الأمراض الأخرى ، وتطور الأنسجة ، ووظيفة الأنسجة الطبيعية. وفي المستقبل، سيكون من السهل زيادة إنتاجية هذه الأساليب بشكل أكبر، حيث تم تصميمها خصيصا ليتم تنفيذها في سياق لوحات متعددة الآبار لتسهيل اعتمادها في سير العمل الحالي لاكتشاف الأدوية من خلال استخدام مناولة السوائل الآلية المتاحة تجاريا وأجهزة التصوير عالية المحتوى. التكامل السهل مع البنية التحتية الحالية وزيادة الأتمتة ، مما يقلل من المهارات التقنية اللازمة لإنتاج وصيانة مزارع هيدروجيل 3D المحملة بالخلايا ، سيقلل بشكل كبير من الحواجز التي تحول دون اعتماد هذه الطريقة. في حين أن العمل هنا يعرض على وجه التحديد الثقافات داخل الهلاميات المائية القائمة على HA ، فمن المتوقع أن هذه الطريقة يمكن ترجمتها بسهولة إلى مواد أخرى شائعة الاستخدام قابلة للربط الضوئي لزراعة الخلايا 3D ، مثل الجيلاتين الميثاكريلات ، وأن الطرق المذكورة هنا ستوفر إرشادات مفيدة لتطبيقات إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم على وجه التحديد لكارولين كيم وأميليا لاو وريان ستوتامور وإيتاي سولومون لمساهماتهم في التكرارات السابقة لمخطط التبشير الضوئي. تم توفير خطوط الخلايا GS122 و GS304 بسخاء من قبل ديفيد ناثانسون. تم إنشاء جميع الأرقام مع BioRender.com. وكانت المرافق الأساسية لجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والموارد المشتركة للفحص الجزيئي، ومختبر توصيف النانو وبيكو مفيدة في هذا العمل. تم دعم تشن شيا تشون من قبل جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس إيلي ومركز إديث برود للطب التجديدي وبرنامج التدريب على أبحاث الخلايا الجذعية. تم دعم Grigor Varuzhanyan من قبل برنامج التدريب على بيولوجيا الخلايا السرطانية NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R.
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al.
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
- Lee, S. Y.
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A.
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
