Präparation und morphologische Analyse von Küken-Schädel-Neuralleistenzellkulturen

Neuralleistenzellen (NCCs) sind eine vorübergehende Zellpopulation in Wirbeltierembryonen. NCCs werden an den Grenzen der Neuralplatte spezifiziert und durchlaufen einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT), um aus dem dorsalen Neuralrohr¹ zu wandern. Nach EMT verteilen sich NCCs weitgehend im gesamten Embryo und differenzieren und tragen letztendlich zu verschiedenen Strukturen bei, einschließlich des kraniofazialen Skeletts, des Ausflusstrakts des Herzens und des größten Teils des peripheren Nervensystems². Veränderungen der Zellpolarität, des Zytoskeletts und der Adhäsionseigenschaften liegen dieser Verschiebung von einer primären zu einer wandernden Zellpopulation zugrunde³. Die Untersuchung von NCC EMT und Migration liefert Einblicke in grundlegende Mechanismen der Zellmotilität und informiert über die Bemühungen zur Vorbeugung und Behandlung von Geburtsfehlern und Krebsmetastasen.

Während die In-vivo-Analyse für das Verständnis von NCC-Entwicklungsprozessen in einem embryonalen Kontext von entscheidender Bedeutung ist, bieten In-vitro-Methoden visuelle und physische Zugänglichkeit, die zusätzliche experimentelle Wege ermöglichen. In einer vereinfachten 2D-Umgebung können NCC-Morphologie, Zytoskelettstrukturen und Distanz migriert ausgewertet werden. Darüber hinaus können die Auswirkungen der genetischen oder löslichen Faktorstörung auf das Migrationsverhalten beweglicher NCCs analysiert werden 4,5,6,7,8,9,10. Darüber hinaus können isolierte präpagratorische oder migrierende NCCs gesammelt, gepoolt und für Hochdurchsatzmethoden verwendet werden, um die Entwicklungsregulation von NCCs durch proteomische, transkriptomische und epigenomische Profilierung zu untersuchen ^7,11. Während Methoden zur Herstellung von kranialen NCCs aus verschiedenen Entwicklungsmodellorganismen zur Verfügung stehen^12,13,14, zeigt dieser Artikel die Mechanik des Ansatzes für diejenigen, die zuerst lernen^, kraniale NCC aus Hühnerembryonen zu kultivieren.

Das aktuelle Protokoll beschreibt eine vielseitige Technik zur Herstellung von NCC-Kulturen des Kükenkrans (Abbildung 1). Da NCCs leicht aus explantierten Neuralfalten auf ein Kultursubstrat migrieren, trennen sich Hühner-NCCs auf natürliche Weise von embryonalem Gewebe, und Primärkulturen können leicht erzeugt werden. Da Mittelhirn-NCCs massenhaft aus den kranialen Neuralfalten wandern (im Gegensatz zur langwierigen Zell-für-Zell-Delaminierung im Stamm¹⁵), bestehen diese Kulturen hauptsächlich aus wandernden kranialen Neuralleistenzellen, wobei die anfängliche Neuralfaltenexzision eine Sammelmethode für premigratorische NCCs darstellt. Eine grundlegende Methode zur Sezierung und Kultivierung von Küken-Schädel-Neuralfalten wird detailliert beschrieben, und es werden Vorschläge für verschiedene Anwendungen und Variationen dieser Methode angeboten.

Abbildung 1: Schematische Übersicht des Kükenkranial-Neuralfaltenkulturprotokolls. (A,B) Schädelneuralfalten (blau umrandet) werden aus einem Hühnerembryo mit fünf Somiten herausgeschnitten (in dorsaler Ansicht in A). Graue Bänder, Herzsichel. (C) Wenn sie auf Fibronektin plattiert werden, treten wandernde Neuralleistenzellen aus den Neuralfalten aus und verteilen sich auf dem Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Jede Vielzahl von Gallus gallus-Rassen kann verwendet werden, einschließlich White Leghorn, Golden Sex Link oder Rhode Island Red. Die in der vorliegenden Studie verwendeten Hühnereier stammten aus verschiedenen Rassen und stammten aus verschiedenen Quellen, einschließlich lokaler Bauernhöfe und Brütereien.

1. Herstellung von Lösungen und Materialien

1. Die Ringer-Lösung wird durch Mischen von 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl 2, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na2_HPO4 und 0,147 mM KH₂PO₄ hergestellt (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und filtern Sie die Sterilisation in 100-ml-Flaschen. An einem sauberen, trockenen Ort aufbewahren. Waschen Sie keine Flaschen mit Seife (als Glasgeschirr für Gewebekultur behandeln).
2. 1 mg/ml Stammlösung Fibronektin (FN) (siehe Materialtabelle) durch Auflösen von FN in steriler Ringer-Lösung herstellen und in 100 μL Aliquots bei -80 °C lagern (mindestens 4 Jahre stabil).
3. Bereiten Sie komplette Nährmedien vor, indem Sie L15-Medien mit 0,8% L-Glutamin, 0,08% Penicillin / Streptomycin, 10% FBS und 10% Hühnerembryoextrakt^{ergänzen 12}. Erstellen Sie 3 ml Aliquots und lagern Sie bei -20 °C oder -80 °C.
   HINWEIS: Wenn Kulturen in einem CO2-Inkubator inkubiert werden, muss DMEM/_F12 durch L15 ersetzt werden, das für Luft gepuffert wird.
4. Bereiten Sie 4% ige Paraformaldehydlösung in 1x PBS vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Erstellen Sie 10 mL Aliquots und lagern Sie sie bei -20 °C.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd muss in einem Abzug gehandhabt werden.
5. Bereiten Sie Filterpapier-Stützrahmen vor (ca. 1 cm x 1,5 cm Rechtecke aus Papier mit zwei oder drei gestanzten Löchern, die sich auf der Längsachse überlappen).
   1. Stanzen Sie Löcher entlang der Kante eines großen Stücks Filterpapier mit einem Standard-Dreilocher, schneiden / trimmen Sie die gestanzte Kante in einen Streifen und schneiden Sie dann den Streifen zwischen den Löchern in Rechtecke ~ 1,5 cm Länge. Autoklaven-Filterpapiere vor Gebrauch (optional).
6. Sammeln Sie Dissektionswerkzeuge, einschließlich feiner Pinzette , stumpfer Pinzette, Sezierschere, Federschere und geschärfter Wolframnadeln¹⁶.

2. Inkubation des Embryos

1. Erhalten Sie befruchtete Eier aus einer der oben genannten Quellen.
2. Legen Sie die befruchteten Eier in eine aufrechte Position (lange Achse des Eies vertikal mit dem spitzen Ende nach unten / stumpfen Seite nach oben) in einen befeuchteten Inkubator bei 38 ° C (100 ° F).
3. Inkubieren, bis sich vier bis sieben Somiten gebildet haben (Stadien 8⁺-9)¹⁷, was ca. 35 h dauert.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach Stamm, Alter der Hühner, Jahreszeit usw. erheblich variieren und muss experimentell bestimmt werden. Programmierbare Auslasstimer sind nützlich, um die Inkubation während der Nacht zu initiieren, um das gewünschte Timing zu erhalten.
4. Nach dem Entfernen aus dem Inkubator die Eier gründlich mit 70% Ethanol besprühen und trocknen lassen, um die Schalen zu desinfizieren.
   HINWEIS: Embryonen können sofort entnommen werden, aber das Abkühlen der Eier auf Raumtemperatur verringert die Zerbrechlichkeit des Eigelbs und den Embryonenverlust während der Entnahme.

3. Zubereitung von Kulturgerichten

1. Wählen Sie Neuralfaltenkulturschalen (siehe Materialtabelle) aus, die für die nachgeschaltete Anwendung geeignet sind.
   1. Für Kulturen, die fixiert und gefärbt werden, verwenden Sie Glasdeckgläser, die in Multi-Well-Gewebekulturschalen gelegt werden.
      HINWEIS: Deckgläser, die der Bohrlochgröße entsprechen, bewegen sich beim Mischen von Flüssigkeit weniger, wodurch sich Explantate weniger wahrscheinlich verschieben und eher am Deckglas als am Schalenboden haften.
   2. Wählen Sie Glasboden-Einzelkammer- oder geteilte Kammerschalen (siehe Materialtabelle) für Live-Aufnahmen mit einem inversen Mikroskop.
   3. Verwenden Sie für die Live-Bildgebung auf einem Klavier- oder Stereomikroskop 6-, 12- oder 24-fach optisch geeignete Gewebekulturplatten.
   4. Wählen Sie plastische Gewebekulturschalen für die Massenentnahme wandernder Neuralleistenzellen für Hochdurchsatzanalysen.
2. Fügen Sie 10 U / ml Penicillin und 10 μg / ml Streptomycin zu einer 100-ml-Flasche steriler Ringer-Lösung hinzu (z. B. 100 μL 10.000 U / ml Penicillin und 10.000 μg / ml Streptomycin, um Ringer's P / S herzustellen). Verwenden Sie Ringer's P / S innerhalb von 1 Woche.
3. Ein Aliquot von 1 mg/ml FN auf Eis auftauen. Mit Ringer's P/S auf eine Konzentration von 10-100 μg/ml FN verdünnen.
4. Pipeten Sie genug FN-Lösung, um den Boden des Brunnens oder der Schale abzudecken. Zum Beispiel 100 μL pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte, 500 μL für eine 35-mm-Schale.
5. Ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie Geschirr oder Teller mit FN-Lösung in einem befeuchteten Inkubator (oder einem abgedeckten Tablett mit destillierten wassergetränkten Papiertüchern) bei 38 ° C (100 ° F) für mindestens 1 Stunde, während Sie Neuralfalten sezieren.

4. Isolierung von Hühnerembryonen

1. Achten Sie darauf, die Ausrichtung des Eies beizubehalten (der Embryo schwimmt während der Inkubation an die Spitze des Eigelbs). Verwenden Sie eine Schere oder eine stumpfe Pinzette, um ein kleines Loch in die Schale zu stechen, etwa 1/4-1/3 des Weges entlang der Länge des Eies.
   1. Führen Sie vorsichtig die Spitze einer Schere oder einer stumpfen Pinzette in das kleine Loch ein, um das Eigelb nicht zu stören, und schneiden Sie die Eierschale um das Ei herum durch, wobei Sie die Oberseite der Eierschale entfernen (Abbildung 2A).
2. Positionieren Sie den Embryo zur Isolierung.
   HINWEIS: Wenn sich der Embryo nicht ideal im Schalenbecher befindet, verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um das Eigelb vorsichtig zu drehen, so dass sich der Embryo oben befindet. Alternativ können Sie das Eigelb in eine behandschuhte, geschröpfte Hand gießen, wobei darauf zu achten ist, dass das Eigelb nicht bricht und das Albumin abfließen kann (Abbildung 2B). Dann kann der Embryo positioniert werden, indem das Eigelb von Hand zu Hand bewegt wird.
3. Bereiten Sie den Embryo vor, indem Sie vorsichtig den flachen Rand der geschlossenen stumpfen Pinzette verwenden, um überschüssiges Albumin abzuwischen, das auf der Oberfläche des Eigelbs verbleibt, die den Embryo bedeckt (Abbildung 2C). Überschüssiges Albumin kann auch durch sanften Druck mit einem empfindlichen Aufgabenwischer entfernt werden.
   HINWEIS: Sobald Albumin entfernt ist, sollte die Oberfläche des Eigelbs strukturiert statt glatt erscheinen. Wenn nicht genügend Albumin weggewischt wird, wird die Haftung des Filterpapierträgers in Abschnitt 4, Schritt 4 verhindert.
4. Verwenden Sie eine Pinzette, um einen Filterpapierträgerrahmen über den Embryo zu legen, wobei sich der Embryo im Fenster des Rahmens befindet. Drücken Sie vorsichtig auf das Filterpapier, um es auf das Eigelb zu kleben.
5. Schneiden Sie die Außenseite des Filterpapierrahmens mit einer Sezierschere ab (Abbildung 2D). Verwenden Sie eine Pinzette oder Scherenspitzen, um den Rand des Rahmens zu fassen und den Embryo vorsichtig vom Eigelb wegzuheben (Abbildung 2E). Das Anheben in einem Winkel hilft, den Embryo sauber aus dem Eigelb zu entfernen.
6. Legen Sie den Embryo mit dem Papierrahmen mit der Seite nach unten (ventrale Seite des Embryos nach oben) in eine 60 mm oder 100 mm große Petrischale, die mit Ringer's P/S gefüllt ist (Abbildung 2F). Halten Sie die Schale der Embryonen auf Eis, wenn Sie sie für eine RNA- oder proteinsensitive nachgeschaltete Anwendung sammeln.
   HINWEIS: Wenn die Embryonen nicht mit der Bauchseite nach oben platziert werden, besteht die Gefahr, dass sie sich von ihren Papierrahmen lösen. Mehrere Embryonen können gesammelt und bis zu 1 Stunde lang in Ringer's P / S gelagert werden, bevor sie zu den Dissektionsschritten der Neuralfalte übergehen.

5. Neuralfalten sezieren

1. Übertragen Sie einen Embryo in eine saubere Schale, die Ringer's P / S-Lösung enthält, und spülen Sie den Embryo aus, indem Sie den Filterpapierrahmen mit einer Pinzette halten und sanft hin und her schwenken, um das Eigelb zu entfernen, das die Sicht des Embryos verdeckt. Tauschen Sie das P / S des Ringers aus oder übertragen Sie es in ein frisches Gericht, wenn es trüb wird.
2. Positionieren Sie den Embryo dorsal/frame mit der Seite nach oben unter einem Seziermikroskop. Lassen Sie den Embryo auf dem Papierrahmen, um ihn straff zu halten und an Ort und Stelle zu halten, entfernen Sie die Vitellinmembran mit einer Pinzette, um die Neuralfalten freizulegen.
   HINWEIS: Wenn der Embryo vom Papierrahmen fällt, kann er flach in der Schale ausgelegt oder zur Sektion an eine mit Sylgard beschichtete Schale¹⁸ geheftet werden.
3. Mit einer Federschere oder einer geschärften Wolframnadel die Neuralfalten des Mittelhirns vorsichtig herausschneiden. Schließen Sie kaudales Gewebe zu den expandierenden optischen Vesikeln und rostral zum Hinterhirn ein, wo Rhombomerverengungen gerade erst auftreten (die Herzsichel ist auch ein nützlicher Indikator, Abbildung 3B, C). Achten Sie darauf, den dorsalsten Aspekt der Neuralfalte mit minimalem kontaminierendem Neuralrohr und nicht-neuralem Ektoderm herauszuschneiden (Abbildung 3C).
4. Übertragen Sie die Neuralfalten mit einem P20-Pipettierer oder einer sterilen Pasteur-Pipette aus Glas, die mit Eigelb Ringer's P/S gespült wird (dies blockiert den Kunststoff oder das Glas, um ein Anhaften des Gewebes zu verhindern) in eine saubere Schale, die Ringer's P/S enthält. Sammeln Sie gesammelte Falten auf Eis und sezieren Sie zusätzliche Falten.

6. Beschichtung von Neuralfalten

1. Auftauen eines Aliquots vollständiger Nährmedien (Abschnitt 1, Schritt 3). Fügen Sie 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin hinzu und sterilisieren Sie. Bewahren Sie vorbereitete Medien bei 37-38 °C auf, während Sie andere Schritte ausführen.
2. Nehmen Sie Kulturschalen aus dem Inkubator (Abschnitt 3, Schritt 5). Entfernen Sie die FN-Lösung mit einem Pipettierer oder einer Pasteur-Pipette aus Deckgläsern, Schalen oder Vertiefungen. Nach dem Spülen des FN-beschichteten Substrats mit Ringer's P/S wird ein entsprechendes Volumen kompletter Nährmedien in die Schalen oder Vertiefungen gegeben (500 μL für Vertiefungen in einer 24-Well-Platte, 2 ml für eine 35-mm-Schüssel oder eine Sechs-Well-Platte).
   HINWEIS: Kleinere Volumina können teure Reagenzien konservieren (z. B. so niedrig wie 200 μL für eine 24-Well-Platte), aber sicherstellen, dass die Schale ausreichend befeuchtet ist, um Verdunstung zu vermeiden.
3. Spülen Sie zunächst mit einem p20- oder p200-Pipettor die Pipettenspitze mit dotterigem Ringer's P / S aus, um den Kunststoff zu blockieren und ein Anhaften des Gewebes zu verhindern. Übertragen Sie dann die isolierten Neuralfalten auf die FN-beschichteten Deckgläser und achten Sie darauf, so wenig Ringer's P / S wie möglich zu übertragen. Legen Sie die Falte(n) in Richtung der Mitte des FN-beschichteten Deckglases.
   HINWEIS: Eine oder wenige Neuralfalten können auf einem 12-mm-Deckglas in einer 19-mm-Vertiefung plattiert werden, bis zu 50 auf einer 35-mm-Platte.
4. Nachdem Sie die Explantate 10-15 Minuten ruhen lassen, legen Sie sie in eine befeuchtete Kammer bei 38 ° C (100 ° F), indem Sie die Kulturschalen mit plattierten Neuralfalten langsam und vorsichtig tragen. Dies minimiert die Verschiebung von Neuralfalten in den Vertiefungen und stellt sicher, dass sie verteilt bleiben und an Deckgläsern haften.
   HINWEIS: Bei Verwendung von L15 (nicht DMEM) können Explantatkulturschalen auch in einem Eierbrutschrank mit einem abgedeckten Tablett mit angefeuchteten Papiertüchern inkubiert werden.
5. Inkubieren Sie neuronale Faltenkulturen im befeuchteten Inkubator für die Dauer der aktiven Migration (ca. 16-20 h insgesamt, Abbildung 4).

7. Fixierung und Färbung kultivierter wandernder NCCs für morphologische Analysen

1. Entfernen Sie die Kulturmedien mit einer Pasteur-Pipette und spülen Sie die Vertiefungen mit filtriertem 1x PBS ab.
2. Fügen Sie 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur hinzu.
   HINWEIS: Die Fixierungszeit muss möglicherweise experimentell bestimmt werden. Es ist auch möglich, Paraformaldehyd für 10 min (50:50) direkt zum Medium hinzuzufügen, zu entfernen und durch unverdünntes 4% Paraformaldehyd für 10 min zu ersetzen, um empfindlichere Zellstrukturen zu erhalten.
3. Paraformaldehyd entfernen und dreimal mit 1x PBS abspülen.
4. Färben Sie fixierte NCCs mit einem geeigneten Farbstoff für die morphologische Beurteilung. Als Beispiel wird hier die Färbung mit Oregon Green konjugiertem Phalloidin beschrieben.
   HINWEIS: Die Visualisierung des Aktinzytoskeletts mit Phalloidin¹⁹ zeigt die strukturelle Komplexität des wandernden NCC mit relativ gleichmäßiger Färbeintensität; Phalloidin kann jedoch nicht alle Zellbereiche hervorheben. Farbstoffe, die die Plasmamembran (z. B. Weizenkeimagglutinin oder DiI) oder das Zytoplasma markieren, können ebenfalls verwendet werden, erschweren jedoch die Abbildung feiner Vorsprünge relativ zum hell färbenden Zellkörper. Darüber hinaus kann gleichzeitig Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um Neuralleistenzellen mit HNK-1 zu markieren oder die subzelluläre Lokalisation eines Proteins von Interesse^{zu bestimmen 7,20}.
   1. Entfernen Sie die letzte PBS-Spülung und fügen Sie PBS + 0,5% Triton X-100 (PBST) + 5% Serum (FBS oder von einem anderen Tier, das für die Co-Färbung mit einem Antikörper geeignet ist) hinzu, um die Deckgläser abzudecken und 10 Minuten auf einem Plattformschüttler bei Raumtemperatur zu inkubieren.
   2. Pipet 200 nM Oregon Green konjugiertes Phalloidin (verdünnt in PBST + 5% Serum) auf eine glatte Oberfläche (z. B. flexible Paraffindichtungsfolie) für jedes Deckglas. Für ein Deckglas von 12 mm pipetten Sie ein Volumen von 30 μL.
   3. Entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette aus dem PBST + 5% Serum, um die Ausrichtung der nach oben gerichteten Zellen beizubehalten. Berühren Sie kurz den Rand des Deckglases zu einem empfindlichen Aufgabenwischer, um überschüssige Flüssigkeit abzuleiten.
   4. Legen Sie jede Deckglaszelle vorsichtig mit der Seite nach unten auf den Tropfen verdünntes Phalloidin. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Halten Sie die Deckgläser während der Färbung im Dunkeln (mit einer mit Alufolie überzogenen Schale abdecken oder in eine Schublade legen).
   5. Während der Inkubation PBST in die Vertiefungen der Kulturschale geben (750 μL PBST für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte).
   6. Nach der Inkubationszeit heben Sie Deckgläser von der Färbelösung ab und legen Sie sie zurück in die Kulturschale, wobei Sie das Deckglas umdrehen, so dass die Zellseite oben ist. Stellen Sie sicher, dass das Deckglas mit PBST bedeckt ist und legen Sie es für 10 Minuten auf einen Plattformschüttler, wobei die Deckgläser abgedeckt und im Dunkeln gehalten werden. Entfernen Sie PBST und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, für insgesamt drei 10-minütige Wäschen.
   7. Geben Sie einen Tropfen (pro Deckglas) des Montagemediums (siehe Materialtabelle) auf einen Objektträger. 25 μL Volumen funktioniert gut für ein 12 mm Deckglas.
   8. Berühren Sie nach der letzten Wäsche mit PBST den Rand des Deckglases mit einem empfindlichen Arbeitswischer, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und die Zellseite des Deckglases im Auge zu behalten.
   9. Montieren Sie die Deckglaszelle mit der Seite nach unten, indem Sie das Deckglas langsam schräg auf das Montagemedium absenken, um Blasen zu vermeiden. Lassen Sie das Medium vor dem Imaging einstellen.

8. Morphologische Bewertung kultivierter wandernder NCCs

1. Bild gefärbte Zellen und Export als .tiff Dateien.
   HINWEIS: Ein 40x-Objektiv eignet sich gut für bildgebende Kulturen, aber Ziele von 10x (um ein ganzes Feld von wandernden NCCs zu erfassen) bis 100x (einzelne NCCs) können verwendet werden, um Bilder für die morphologische Bewertung zu sammeln. Die Bilder in der vorliegenden Studie wurden mit einer inversen multimodalen Bildgebungsplattform aufgenommen (siehe Materialtabelle).
2. Laden Sie die Bilder in eine Bildanalysesoftware hoch (ImageJ²¹, siehe Materialtabelle). Klicken Sie auf Bild > Duplizieren , um eine zweite Kopie jedes Bildes für die Analyse zu erstellen, so dass das Original unbearbeitet bleibt, da die meisten Bildverarbeitungen nicht rückgängig gemacht werden können.
3. Klicken Sie auf Bild > Helligkeit/Kontrast anpassen > und verwenden Sie Schieberegler, um die Helligkeit oder den Kontrast der Bilder anzupassen.
4. Konvertieren Sie die Bilder in Graustufen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Wenn Bilder in RGB exportiert werden, werden sie in RGB als zusammengeführter Kanal hochgeladen. Um die Bilder zu trennen, klicken Sie auf Bild > Farbe > geteilte Kanäle , um Einkanal-Graustufenbilder zu erhalten.
   2. Wenn Bilder bereits getrennt sind, gehen Sie zu Bild > Geben Sie > 8-Bit ein , um die Datei in Graustufen zu konvertieren.
5. Klicken Sie auf Bild > Schwellenwert anpassen > , um in ein binäres Bild zu konvertieren, bei dem Pixel als Zellen (Vordergrund; schwarz) oder Hintergrund (weiß) identifiziert werden. Verwenden Sie den Schieberegler und/oder klicken Sie auf Auto , um die Einstellung Schwellenwert auszuwählen, die Zellen eindeutig vom Hintergrund abhebt.
   1. Wenn sich Zellen überlappen oder die Färbung nicht kontinuierlich ist, kann es erforderlich sein, mit den Funktionen Wasserscheide oder Löcher füllen²² weiter zu verarbeiten. Dadurch werden Zellen voneinander getrennt oder Lücken innerhalb der zu analysierenden Zellen geschlossen. Klicken Sie auf Process > Binary > Make Binary , um das Bild zunächst in ein 8-Bit-Binärformat zu konvertieren. Klicken Sie dann auf Process > Binary > Watershed oder Fill Holes.
      HINWEIS: Die Software passt am besten dorthin, wo Signale getrennt oder ausgefüllt werden müssen, was bei Bedarf mithilfe von Plug-Ins weiter angepasst werden kann.
6. Wählen Sie die zu erfassenden Messungen aus. Klicken Sie auf Analyze > Set Measurements und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Formdeskriptoren für die Analyse von Zirkularität (Circ.), Seitenverhältnis (AR), Rundheit (Rund) und Solidität.
   HINWEIS: Je nach Art der erforderlichen Analyse können auch andere Messungen enthalten sein, z. B. Fläche und Umfang.
7. Klicken Sie auf Analysieren > Partikel analysieren und stellen Sie die Parameter aus dem Menü "Partikel analysieren" ein.
   1. Schätzen Sie unter "Größe" grob, wie groß die interessierenden Zellen oder Partikel in Pixeln sind, da auch Hintergrundsignal oder kleinere Zelltrümmer enthalten sind, wenn der Parameter Size auf 0-Infinity festgelegt bleibt (z. B. als 500-Infinity in Abbildung 5).
      HINWEIS: Wenn Sie die Größe auf einen engeren Bereich einstellen, können kleinere oder größere Partikel ausgeschlossen werden, als für die Analyse benötigt werden.
   2. Lassen Sie unter "Zirkularität" bei 0-1,0, um alle Zellformen im Bild zu messen.
   3. Wählen Sie unter "Anzeigen" die Option " Nackte Umrisse " aus dem Dropdown-Menü, um die mit der Funktion "Partikel analysieren" ausgewählten Zellumrisse zu überprüfen. Scannen Sie die Umrisse, um sicherzustellen, dass überlappende Zellen unterschieden werden, Zellen jedoch nicht unnötig geteilt werden. Aktivieren Sie auch die Menüfelder für "Ergebnisse anzeigen", "Zusammenfassen" und "Zu Manager hinzufügen".
8. Wenn alle Parameter eingestellt sind, klicken Sie auf OK.
   HINWEIS: Es werden vier separate Fenster angezeigt, die (1) die nackten Umrisse der im Bild identifizierten Zellen, (2) die im Bild gezählten Zellen, (3) die Ergebnisse der Messungen jeder Zelle und (4) eine Zusammenfassung der Gesamtzahl der gezählten Zellen und ihrer gemittelten Messungen anzeigen.
   1. Wenn Trümmer gezählt wurden, überlappende Zellen als eins gezählt wurden, einzelne Zellen als Vielfache gezählt wurden oder viele Zellen aus der Zählung ausgelassen wurden, kehren Sie zum ursprünglichen, unbearbeiteten Bild zurück, erstellen Sie ein weiteres Duplikat und passen Sie "Schwellenwert" oder andere Parameter an.

Eine Übersicht über das aktuelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Die bebrüteten Eier wurden geöffnet, und das Eigelb mit dem Embryo auf der Oberfläche wurde isoliert, indem es vorsichtig in die Handfläche einer behandschuhten Hand gegossen wurde (Abbildung 2A, B). Nach dem Entfernen des Albumins (Abbildung 2C) wurden Filterpapierrahmen auf die Dottermembran aufgebracht, die den Embryo umgibt, um das Schneiden und Anheben des Embryos aus dem Eigelb zu erleichtern, das nach dem Schneiden der Dottermembranen zu verschütten beginnt (Abbildung 2D, E).

Abbildung 2: Isolierung von vier bis sieben Somit-Chick-Embryonen. Befruchtete Eier wurden für 35 h inkubiert. Ein Ei wurde mit einer stumpfen Pinzette (A) geöffnet und das Eigelb in eine behandschuhte Hand (B) gegossen. Überschüssiges Albumin wurde entfernt (C), so dass ein Filterpapierträger (D, Einschub) am Eigelb haften blieb. Der Embryo wurde aus dem Eigelb geschnitten (D), abgehoben (E) und in Ringer's P/S (F) gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Nach dem Spülen des Embryos und dem Reinigen von Ringers P/S waren Neuralfalten in den isolierten Embryonen sichtbar (Abbildung 3A). Diese Falten enthalten vorgelagerte kraniale Neuralleistenzellen. Einmal aus einem Embryo herausgeschnitten (Abbildung 3B,C) und gesammelt (Abbildung 3D), können isolierte Neuralfalten plattiert werden, um wandernde NCC-Kulturen zu schaffen.

Abbildung 3: Dissektion der dorsalen Neuralfalten des Kükens. In Ringers P / S wurden Federscheren verwendet, um neuronale Falten zu entfernen. (A) Rückenansicht des Embryos, vorn zur Oberseite der Abbildung. Neuralfalten erscheinen undurchsichtiger als das umgebende Gewebe. Die Neuralfalten des Mittelhirns liegen hinter den Sehlappen (rosa) und vor der Herzsichel (gelb). (B) Dorsale Ansicht des Embryos nach Entfernung der Neuralfalten mit Exzisionsgrenzen. (C) Seitenansicht des Embryos mit entfernten Neuralfalten. Die Dissektionstechnik entfernt das dorsale Neuralrohr und vermeidet ventrale und nicht-neurale Röhrenstrukturen. (D) Isolierte neuronale Falten in Ringers P/S. Maßstabsbalken = 300 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Wenn neuronale Falten auf FN plattiert wurden, begannen NCCs innerhalb von 3-4 Stunden nach der Inkubation aus adhärenten neuronalen Faltenexplantaten zu entstehen (Abbildung 4A), und die Migration war nach etwa 20 h abgeschlossen (Abbildung 4B). Die HNK-1-Färbung, die wandernde NCCs20 markiert, war in den meisten Zellen der Kultur sichtbar (Abbildung 4D). Ein negatives Ergebnis trat auf, wenn Neuralfalten nicht am Deckglas haften konnten oder kein NCC aus der Explantat auswanderte (Daten nicht gezeigt). NCCs wurden analysiert, indem die Kulturen fixiert, auf filamentöses Aktin gefärbt und verschiedene Messungen in ImageJ durchgeführt wurden, um die NCC-Morphologie und -Migration zu bewerten (Abbildung 5). Die durchschnittliche Fläche der 69 analysierten Zellen betrug 802,11 ± 69,65 μm 2, mit einem Bereich von 60,27-2664,53 μm2, verteilt wie im Balkendiagramm und Geigendiagramm gezeigt (Abbildung 5C). Die Zirkularität (Formel: Zirkularität = 4π(Fläche/Umfang²)), ein Maß, das den Vorsprung einer Zelle widerspiegelt, lag zwischen 0,101 und 0,875 mit einem Durchschnitt von 0,38 ± 0,15. Niedrigere Werte zeigen eine längliche Form an, während ein Wert von 1 einen perfekten Kreis anzeigt. Wie im Geigendiagramm ersichtlich, weisen die meisten Zellen eine längliche Form auf (Abbildung 5D). Ein weiteres Maß für die Zellform ist das Seitenverhältnis (AR), das die Hauptachse der Zelle durch die Nebenachse dividiert. Ein AR-Wert von 1 zeigt eine symmetrische Form23 an. Migrierende NCCs in diesem Bereich hatten einen durchschnittlichen AR von 2,13 ± 0,11, mit Werten von 1,14-5,59 (Abbildung 5E). Mit diesen quantitativen Messungen der NCC-Morphologie können strenge Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen und verschiedenen veröffentlichten Studien durchgeführt werden.

Abbildung 4: Wandernde NCCs entstehen aus kultivierten neuronalen Falten. Hellfeldbilder von plattierten Neuralfalten nach 3 h Inkubation (A) und 20 h Inkubation (B). Maßstabsbalken = 200 μm. (C,D) Die Neuralfalte ist nach 20 h Inkubation weitgehend zerstreut, aber auf der rechten Seite dieser Bilder restlich vorhanden. Maßstabsbalken = 500 μm. Wandernde NCCs sind mit DAPI (C) und HNK-1 Färbung (D) sichtbar. Die HNK-1-Immunfärbung bestätigt, dass kultivierte Zellen wandernde NCCs sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Morphologische Bewertung kultivierter wandernder NCCs. (A) Phalloidin-Färbung von filamentösem Aktin in NCCs wanderte nach 20 h in Kultur aus einer Neuralfalte. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Schwellenwertbild mit schwarzen Zellen und dem Hintergrund weiß. Gelbe Umrisse umgeben Objekte, die als Zellen gezählt werden, und Zellen sind nummeriert. (C-E) Grafische Optionen zur Anzeige morphologischer Bewertungsdaten. Aus Messungen der 69 Zellen in Panel B wurden Balkendiagramme und Geigendiagramme erstellt, um die Fläche (μm2, C), die Kreisförmigkeit (D) und das Seitenverhältnis (E) der gemessenen Zellen darzustellen. Balkendiagramme zeigen Durchschnittswerte mit Fehlerbalken, die den Standardfehler des Mittelwerts auf der linken Seite jedes Bereichs darstellen. Geigenplots wurden mit app.rawgraphs.io erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.