Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

Eine immens überfüllte Zellumgebung stellt viele Herausforderungen bei der Sortierung bestimmter Proteine und Moleküle dar. Diese intensive Arbeitsbelastung der Organisation und raumzeitlichen Verteilung von Molekülen innerhalb des Zytoplasmas wird durch molekulare Motoren und Zytoskelettspuren erleichtert. Molekulare Motoren sind die Enzyme, die die Energiewährungen wie ATP hydrolysieren und diese Energie während der Bewegung und Krafterzeugung nutzen¹. Basierend auf der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz werden Kinesine in 14 Familien eingeteilt und trotz dieser Ähnlichkeit trägt jeder Motor einzigartig zur Funktion einer Zelle bei. Die Motoren der Kinesin-3-Familie bilden eine der größten und umfassen fünf Unterfamilien (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 und KIF28)², die mit verschiedenen zellulären und physiologischen Funktionen verbunden sind, einschließlich Vesikeltransport, Signalübertragung, Mitose, Kernmigration und Entwicklung 3,4,5. Eine Beeinträchtigung der Kinesin-3-Transportfunktion ist mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen, Entwicklungsdefekten und Krebserkrankungen verbunden 6,7,8,9.

Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Kinesin-3-Motoren Monomere sind, aber eine ladungsinduzierte Dimerisierung durchlaufen und im Vergleich zu herkömmlichen Kinesin^10,11,12,13 zu einer schnellen und superprozessiven Motilität führen. Ihre biochemische und biophysikalische Charakterisierung benötigt eine große Menge an gereinigten, aktiven Proteinen. Ihre Produktion im prokaryotischen Expressionssystem führte jedoch zu inaktiven oder aggregierten Motoren, vermutlich aufgrund inkompatibler Proteinsynthese-, Faltungs- und Modifikationsmaschinerie 14,15,16,17,18. Um solche Einschränkungen zu umgehen und die Ausbeute zu erhöhen, haben wir hier ein robustes Sf9-Baculovirus-Expressionssystem etabliert, um diese Motoren zu exprimieren und zu reinigen.

Das Baculovirus-Expressionssystem verwendet Sf9-Insektenzelllinien als Wirtssystem für die eukaryotische rekombinante Proteinexpression mit hohem Durchsatz^19,20. Baculovirus besitzt einen starken Polyhedrin-Promotor, der die heterologe Genexpression und die Produktion löslicher rekombinanter Proteine unterstützt¹⁷. Aufgrund seiner Kosteneffizienz, seiner sicheren Handhabung und seines hohen Anteils an aktiver Proteinexpression ist es zu einem leistungsstarken Werkzeug²¹ geworden. Um ein Protein von Interesse zu exprimieren, besteht ein wichtiger Schritt darin, ein rekombinantes Bakmid zu erzeugen. Da die kommerziell erhältlichen Bacmid-Generierungskits teuer sind und wir mit mehr Proben arbeiten werden, haben wir ein internes Protokoll für große und kleine Einsätze von Kinesin-3-Motoren in Bacmid entwickelt. Sf9-gereinigte Kinesin-3-Motoren wurden verwendet, um in vitro Einzelmolekül- und Multimotor-Mikrotubuli-Gleiteigenschaften mittels TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluoreszenz) zu charakterisieren. Motoren sind C-terminal-markiert mit 3-Tandem-fluoreszierenden Molekülen (3xmCit), um ein verbessertes Signal und eine verminderte Photobleiche zu liefern. Aufgrund des erhöhten Signal-Rausch-Verhältnisses, der geringeren Phototoxizität und der selektiven Bildgebung eines sehr kleinen Bereichs in der Nähe des Deckglases wurde die TIRF-Bildgebung häufig verwendet, um die Proteindynamik auf Einzelmolekülebene in vivo und in vitro zu visualisieren.

Diese Studie diskutiert die Reinigung von Kinesin-3-Motoren unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems und der In-vitro-Einzelmolekülbildgebung und der Multimotor-Gleitanalyse von Motoren mittels TIRF-Mikroskopie. Insgesamt zeigt diese Studie, dass die Motilitätseigenschaften von gereinigten Sf9-Motoren identisch sind mit denen von Motoren, die aus Säugetierzelllysaten hergestellt werden. Daher glauben wir, dass das Sf9-Baculovirus-System angepasst werden kann, um jedes Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

1. Sf9-Kultur, Transfektion und Virusgenerierung

HINWEIS: Halten Sie die Sf9-Zellen in 30 ml Sf-900/SFM-Medium in einem sterilen 100-ml-Einwegkolben ohne Antibiotikum/Antimykotikum bei 28 °C. Halten Sie die Aufhängungskultur in einem Orbitalschüttler bei 90 U/min. Die Zufuhr von CO₂ und die Aufrechterhaltung der Luftfeuchtigkeit ist nicht erforderlich. Die Zellen werden normalerweise jeden vierten Tag subkultiviert, indem 0,5 x 10⁶ Zellen / ml inokuliert werden, um am vierten Tag eine Dichte von 2,0 x 10⁶ Zellen / ml zu erreichen.

1. Generierung von P0-Virusbeständen
   1. Für die Transfektion werden die Zellen in eine 35 mm Schale mit 4,5 x 10⁵ Zellen/ml Konfluenz gesät und bei 28 °C ohne zu schütteln gehalten.
   2. Nach 24 Stunden, sobald die Zellen angebunden sind und gesund aussehen, fahren Sie mit der Transfektion wie unten beschrieben fort.
      1. Röhre A: Mischen Sie 1 μg Bacmid-DNA-Kodierung für konstitutiv aktiven KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG-spezifischen Kinesin-3-Motor mit 100 μL unergänztem Grace-Medium.
      2. Röhrchen B: Mischen Sie 6 μL Transfektionsreagenz mit 100 μL unergänztem Grace-Medium.
      3. Übertragen Sie den Inhalt von Röhrchen A vorsichtig in Röhrchen B und mischen Sie gründlich durch Pipettieren auf und ab (ca. 20 Mal).
      4. Inkubieren Sie die Mischung für ~45 min bei Raumtemperatur.
   3. Nach Abschluss der Inkubation 0,8 ml unergänztes Grace-Medium zu der obigen Mischung hinzufügen und langsam durch Pipettieren mischen.
   4. Saugen Sie das Sf-900/SFM-Medium vorsichtig aus den Zellen ab (um Spuren von Serum zu entfernen, die die Transfektionseffizienz beeinträchtigen können).
   5. Die Transfektionsmischung aus Schritt 1.1.3 wird tropfenweise auf die Oberseite der Zellen gegeben und die Platte 6 h bei 28 °C inkubiert.
   6. Nach der Inkubation die Transfektionsmischung vorsichtig entfernen, 2 ml Sf-900/SFM-Medien hinzufügen und 48 h bei 28 °C weiter inkubieren.
   7. Überprüfen Sie die Motorproteinexpression unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop. Das Motorprotein ist mit einem fluoreszierenden Protein, mCitrin, einer Variante des gelb fluoreszierenden Proteins, markiert.
      HINWEIS: Transfizierte Zellen wurden unter einem inversen Mikroskop visualisiert, das mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC) und Epifluoreszenzbeleuchtung mit einem 20-fachen Objektiv (200-fache Vergrößerung), einer Quecksilberlampe und einer EM-CCD-Kamera ausgestattet war. Überprüfen Sie die Effizienz der Virusgenerierung und Infektion, indem Sie die Expression von mCitrin-markierten Motoren in Zellen durch mCitrin-Anregung und Emissionsfilterwürfel überwachen. Überprüfen Sie außerdem auf morphologische Veränderungen infizierter Zellen, wie vergrößerte Zellen / Kerne (Abbildung 1A-C).
   8. Überprüfen Sie die Zellen 72 Stunden nach der Infektion. Normalerweise beginnen sich Zellen von der Oberfläche zu lösen (Abbildung 2).
   9. Wenn sich >5% der Zellen von der Oberfläche lösen, ernten Sie das Medium mit infizierten Zellen in 1,5 ml sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie sich 5 Minuten lang bei 500 x g.
   10. Sammeln Sie die Überstands- und Snap-Freeze-Aliquots von 1 ml in flüssigem Stickstoff und lagern Sie sie als P0-Bestand bei -80 °C oder verwenden Sie sie, um P1-Virusvorrat zu erzeugen.
2. Generierung von P1-Virusbeständen
   1. Um den P0-Baculovirus-Bestand weiter zu amplifizieren und die Proteinexpression zu bestätigen, züchten Sf9-Zellen in flüssiger Suspensionskultur.
   2. In einem sterilen 100-ml-Konikenkolben werden 10 ml Sf-900/SFM-Medien mit einer Zelldichte von 2 x 10⁶ Zellen/ml und 1 ml P0-Virusschaft hinzugefügt. Bei 28 °C unter ständigem Schütteln bei 90 U/min inkubieren.
   3. Überprüfen Sie nach 72 Stunden Infektion die Proteinexpression wie zuvor beschrieben (Schritt 1.1.7). Wenn die Proteinexpression gut ist (>90% der Zellen zeigen ein helles mCitrin-Fluoreszenzsignal) und einen signifikanten Zelltod zeigt (ca. 10%-15%), drehen Sie die Zellen in einem 15 ml sterilen konischen Röhrchen bei 500 x g für 5 min herunter.
   4. Sammeln Sie den Überstand, Snap-Freeze-Aliquots von 1 ml (P1-Vorrat) in flüssigem Stickstoff und lagern Sie ihn bei -80 ° C oder fahren Sie mit einer großflächigen Infektion und Proteinreinigung fort.
3. Großflächige Infektion
   1. Für die großflächige Proteinexpression 30 mL der Suspensionskultur bei 2 x 10⁶ Zellen/ml Dichte mit 1 ml P1-Virusvorrat infizieren und bei 28 °C mit konstantem Schütteln bei 90 U/min inkubieren.
   2. Überprüfen Sie nach ~72 h nach der Infektion die Proteinexpression (im Allgemeinen wird die maximale Proteinexpression zwischen 65-75 h nach der Infektion erreicht).
   3. Wenn >90% der Zellen ein helles fluoreszierendes Signal mit minimalem Zelltod (<5%) zeigen, sammeln Sie die Zellen in einem sterilen 50-ml-Konikenröhrchen und drehen Sie sich bei 500 x g bei 4 °C für 15 min herunter.
      HINWEIS: Es sollte einen minimalen Zelltod (<5%) geben, da tote Zellen den zellulären Inhalt in das Medium abgeben, was zum Verlust des exprimierten Proteins führt.
   4. Entsorgen Sie den Überstand, sammeln Sie das Zellpellet und fahren Sie mit der Proteinreinigung fort.

2. Sf9-Reinigung von Kinesin-3-Motoren

1. Zu dem obigen Zellpellet werden 3 mL eiskalter Lysepuffer (Zusatztabelle 1) frisch ergänzt mit 5 mM DTT, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin und 5 μg/ml PMSF hinzugefügt und die Zellen durch Pipettieren 20-25 mal lysiert, ohne Luftblasen zu erzeugen. Alle Pufferzusammensetzungen und Reagenzien entnehmen Sie bitte der Zusatztabelle 1.
2. Schleudern Sie das Zelllysat bei 150.000 x g für 30 min bei 4 °C.
3. Sammeln Sie den Überstand in ein frisches, steriles Röhrchen und mischen Sie es mit ~40 μL 50% Anti-FLAG M2-Affinitätsharz. Die Mischung für 3 h bei 4 °C mit End-to-End taumeln.
4. Nach der Inkubation das FLAG-Harz durch Schleudern bei 500 x g für 1 min bei 4 °C pelletieren. Den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet mit einer 26 G Nadel zu stören, entsorgen und entsorgen.
5. Waschen Sie das FLAG-Harzpellet dreimal mit eiskaltem Waschpuffer (Zusatztabelle 1), frisch ergänzt mit 2 mM DTT, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin und 5 μg/ml PMSF. Die Perlen durch Schleudern bei 500 x g für 1 min bei 4 °C in jedem Waschgang pelletieren.
6. Nach der dritten Wäsche den Waschpuffer vorsichtig so weit wie möglich abtropfen lassen, ohne das Pellet zu stören. Für die Proteinelution ~70 μL Waschpuffer mit 100 μg/ml FLAG-Peptid in das Harzpellet geben und über Nacht bei 4 °C mit End-to-End-Taumeln inkubieren.
7. Am folgenden Tag das Harz bei 500 x g für 1 min bei 4 °C herunterschleudern. Sammeln Sie den Überstand mit gereinigtem Protein in eine frische Tube und ergänzen Sie ihn mit 10% Glycerin. Aliquots von 5 μL in flüssigem Stickstoff einfrieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
8. Führen Sie das SDS-PAGE-Gel aus, um die Proteinkonzentration und den Ertrag zu bestimmen. Zusammen mit dem gereinigten Protein von Interesse, einer Standardproteinkontrolle, werden BSA mit bekannten Konzentrationen im Bereich von 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg und 1 μg geladen, um eine Standardkurve zu erzeugen. Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant blue (Abbildung 3).
9. Analysieren Sie das Gel mit einem integrierten Gel-Quantifizierungstool in der ImageJ-Software. Messen Sie zunächst die Bandenintensität bekannter BSA-Konzentrationen und erzeugen Sie die Standardkurve. Messen Sie dann die Intensität der gereinigten Proteinbande und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Öffnen Sie dazu die Image J-Software, klicken Sie in der Menüleiste auf die Option Analysieren und wählen Sie Gels im Dropdown-Menü.

3. In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätstest mit Sf9-gereinigten Kinesin-3-Motoren

HINWEIS: Die Sf9-gereinigten Kinesin-3-Motoren können verwendet werden, um biochemische und biophysikalische Eigenschaften wie ATP-Umsatzrate, Mikrotubuli-Affinität, Geschwindigkeit, Lauflänge, Schrittweite und Krafterzeugung zu untersuchen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die in vitro Einzelmolekül-Motilitätsanalyse von KIF1A(1-393LZ) mittels TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) beschrieben. Alle Pufferzusammensetzung und Reagenzien entnehmen Sie bitte der Zusatztabelle 1.

1. Mikrotubuli-Polymerisation
   1. Bereiten Sie in einem vorgekühlten 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen eine Polymerisationsmischung durch Pipettieren in der folgenden Reihenfolge vor: 12,0 μL BRB80-Puffer, pH 6,9; 0,45 μL 100 mM MgCl₂, 1 μL 25 mM GTP.
   2. Man nimmt ein 10 μL Aliquot von 10 mg/ml Tubulin, das in flüssigem Stickstoff gelagert ist, taut sofort auf und fügt es in die obige Polymerisationsmischung ein. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie 2-3 mal pipettieren, ohne Luftblasen zu erzeugen.
      HINWEIS: Führen Sie die oben genannten Schritte schnell und streng auf Eis durch.
   3. Lassen Sie die obige Mischung 5 min auf Eis sitzen.
      HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, um die Denaturierung von Tubulin zu verhindern oder die Bildung von kurzen Mikrotubulisamen zu vermeiden.
   4. Das Rohr wird in einen vorgewärmten 37 °C heißen Hitzeblock/Wasserbad überführt und 30 min zur Polymerisation der Mikrotubuli inkubiert.
   5. Während Mikrotubuli polymerisieren, tauen Sie einen aliquoten P12-Puffer auf und bringen Sie ihn auf Raumtemperatur.
   6. Beginnen Sie vor Abschluss der 30-minütigen Inkubation mit der Vorbereitung des MT-Stabilisierungspuffers, indem Sie 100 μL P12-Puffer in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Fügen Sie dazu 1 μL 1 mM Taxol hinzu und wirbeln Sie sofort die Mischung durch.
      HINWEIS: Beginnen Sie ca. 5 Minuten vor Abschluss der Inkubation in Schritt 3.1.4 mit der Vorbereitung des MT-Stabilisierungspuffers. Taxol stabilisiert die polymerisierten Mikrotubuli durch Bindung an β-Tubulin.
   7. Erwärmen Sie den Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer für 2-3 min bei 37 °C und geben Sie ihn vorsichtig in die polymerisierten Mikrotubuli, ohne die Polymerisationsmischung am Boden zu stören.
      HINWEIS: Das Erwärmen des Stabilisierungspuffers bringt ihn auf die gleiche Temperatur wie die Polymerisationsmischung.
   8. Die Mischung wird nicht angeklopft oder pipettiert und bei 37 °C 5 min lang weiter inkubiert.
   9. Klopfen Sie vorsichtig auf die Mischung und mischen Sie sie mit einer abgeschrägten Schnittspitze (200 μL Fassungsvermögen) langsam mit der Pipette.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sollten Mikrotubuli immer mit einer abgeschrägten Schnittspitze behandelt werden, um eine Scherung der Mikrotubuli zu vermeiden.
   10. Nehmen Sie 10-15 μL polymerisierte Mikrotubuli in eine Durchflusszelle, um die korrekte Mikrotubuli-Polymerisation zu überprüfen.
       HINWEIS: Man kann die unbeschrifteten Mikrotubuli mit einem DIC-Mikroskopie-Setup visualisieren.
   11. Wenn Mikrotubuli konzentriert sind, verdünnen Sie sie in P12-Puffer, ergänzt mit 10 μM Taxol.
2. Vorbereitung der Motilitätsflusszellenkammer
   1. Bereiten Sie eine Motilitätskammer mit einem Glasobjektträger, doppelseitigem Klebeband und Glasdeckglas (22 mm x 30 mm) vor.
   2. Nehmen Sie einen Glasobjektträger, legen Sie einen Tropfen (~ 70 μL) deionisiertes destilliertes Wasser in die Mitte und wischen Sie ihn mit einem fusselfreien Seidenpapier ab.
   3. Schneiden Sie zwei Streifen doppelseitiges Klebeband (~ 35 x 3 mm) und kleben Sie sie parallel fest auf den Glasträger, wobei Sie einen ~ 4-5 mm Abstand zwischen zwei Streifen lassen, um einen engen Durchgang zu schaffen.
   4. Als nächstes nehmen Sie ein Deckglas und fügen einen Tropfen (~ 20 μL) deionisiertes destilliertes Wasser in der Mitte hinzu. Legen Sie einen Streifen fusselfreies Linsenreinigungspapier auf den Wassertropfen, bis er das Wasser aufnimmt. Schieben Sie es dann langsam zu einem Ende des Deckglases.
      HINWEIS: Das Deckglas sollte vollständig trocken sein. Auf dem Deckglas sollte kein Wasser sichtbar sein.
   5. Legen Sie das Deckglas auf die doppelseitigen Streifen, die auf dem Objektträger aufgeklebt sind, und drücken Sie das Deckglas gleichmäßig entlang der Streifen, um fest zu kleben.
      HINWEIS: Bitte stellen Sie sicher, dass die gereinigte Seite des Deckglases dem Glasobjektträger zugewandt ist.
   6. Stellen Sie sicher, dass zusammen eine schmale Kammer mit einer Kapazität von 10-15 μL für die Durchführung von Motilitätstests entsteht (Abbildung 4A).
3. In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätstest
   HINWEIS: Um die auf Mikrotubuli basierenden Einzelmolekülmotilitätseigenschaften von Motoren zu untersuchen, müssen Mikrotubuli auf die Deckglasoberfläche in der Motilitätskammer adsorbiert werden.
   1. Die polymerisierten taxolstabilisierten Mikrotubuli werden in P12-Puffer, ergänzt mit 10 μM Taxol, im Verhältnis 1:5 verdünnt und durch langsames Pipettieren mit einer abgeschrägten Spitze gemischt.
   2. Halten Sie die Durchflusskammer in einer schrägen Position (~15-20°). Fließen Sie 30 μL verdünnte Mikrotubulilösung vom oberen Ende durch die Durchflusskammer, während am unteren Ende ein fusselfreies Seidenpapier aufbewahrt wird, um die Flüssigkeit aufzunehmen. Dies erzeugt eine Scherkraft, um den Mikrotubuli in Strömungsrichtung auszurichten und hilft, die Mikrotubuli gerade und parallel auszurichten.
   3. Lassen Sie einen kleinen Tropfen Flüssigkeit an beiden Enden der Kammer und halten Sie die Durchflusszelle in einer umgekehrten Position (Deckglas nach unten) in einer geschlossenen, feuchten Kammer, um ein Austrocknen der Motilitätskammer zu verhindern.
   4. Lassen Sie es ~ 30 min sitzen, so dass Mikrotubuli an der Oberfläche des Deckglases in der Motilitätskammer adsorbieren.
   5. In der Zwischenzeit wird der Blockierpuffer vorbereitet, indem 500 μL P12-BSA-Puffer mit 5 μL 1 mM-Taxol gemischt wird.
   6. Fließen Sie 40-50 μL Blockierpuffer und inkubieren Sie den Objektträger in einer umgekehrten Position für 10 min in einer feuchten Kammer.
   7. Die Motilitätsmischung wird hergestellt, indem die folgenden Komponenten in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von 500 μL in der folgenden Reihenfolge pipettiert werden: 25 μL P12-Puffer mit Taxol, 0,5 μL 100 mM MgCl₂, 0,5 μL 100 mM DTT, 0,5 μL 20 mg/ml Glucoseoxidase, 0,5 μL 8 mg/ml Katalase, 0,5 μL 2,25 M Glucose und 1,0 μL 100 mM ATP.
      HINWEIS: Fluoreszenzbildgebung wurde häufig für biologische Anwendungen verwendet 22,23,24,25,26. Die Photoanregung fluoreszierender Proteine erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die eine Photobleiche der fluoreszierenden Proteine und eine Schädigung der biologischen Proben verursachen können^27,28. Sauerstofffänger wie Glucose, Glucoseoxidase und Katalase werden routinemäßig in Motilitätstests verwendet, um Lichtschäden zu begrenzen und die Bleichzeit fluoreszierender Proteine zu verlängern.
   8. Schließlich fügen Sie 1 μL des gereinigten Motors zu der obigen Motilitätsmischung hinzu und mischen Sie gut, bevor Sie in die Motilitätskammer fließen.
   9. Versiegeln Sie beide Enden der Motilitätskammer mit flüssigem Paraffinwachs und machen Sie sofort ein Bild unter TIRF-Beleuchtung mit einem 100-fachen TIRF-Objektiv von 1,49 NA mit 1,5-facher Vergrößerung.
   10. Um die Deckglasoberfläche zu fokussieren, fokussieren Sie sich zunächst auf einen der Innenkanten des doppelseitigen Klebebandes in der Motilitätskammer unter differentieller Interferenzkontrastbeleuchtung (DIC).
       HINWEIS: Die helle und unebene Oberfläche ist sichtbar.
   11. Verschieben Sie dann den Fokus in die Motilitätskammer. Fokussieren Sie die Deckglasoberfläche durch Feineinstellung und suchen Sie nach den Mikrotubuli, die auf der Deckglasoberfläche adsorbiert sind.
   12. Sobald die Mikrotubuli fokussiert sind, wechseln Sie mit einem 488-nm-Anregungslaser zur TIRF-Beleuchtung und passen Sie die Beleuchtungstiefe an, indem Sie den Anregungsstrahlwinkel ändern, um die beste und gleichmäßige TIRF-Beleuchtung zu erhalten (Abbildung 4B).
   13. Fokussieren Sie die einzelnen mCitrin-markierten Motoren, die sich prozessiv entlang der Mikrotubulioberfläche bewegen, mit 100 ms Belichtung und zeichnen Sie die Bewegung mit einer EM-CCD-Kamera auf.
       HINWEIS: Obwohl die Motilitätstests an unmarkierten Mikrotubuli durchgeführt wurden, kann die z-Projektionsfunktion mit maximaler Intensität verwendet werden, um den Umriss der Mikrotubulispur zu enthüllen. Bevorzugt wurden Ereignisse auf langen Mikrotubulispuren für die Tracking-Analyse berücksichtigt.
   14. Verfolgen Sie manuell die Position der fluoreszierend markierten einzelnen Motoren, die auf langen Mikrotubulispuren laufen, Bild für Bild mit einem benutzerdefinierten Plugin in der ImageJ (nih.gov) -Software, wie zuvor beschrieben²⁹.
   15. Generieren Sie die Histogramme der Geschwindigkeit und der Lauflänge für die motorische Grundgesamtheit, indem Sie die Anzahl der Ereignisse in jedem Behälter darstellen. Passen Sie diese Histogramme an eine einzelne Gaußsche Peakfunktion an, um die durchschnittliche Geschwindigkeit und Lauflänge¹² zu erhalten (Abbildung 4C-E).

4. In-vitro-Mikrotubuli-Gleittest

ANMERKUNG: Um das kollektive Verhalten von Kinesin-3-Motoren zu verstehen, wurde ein In-vitro-Mikrotubuli-Gleittest durchgeführt 18,30,31. Wenn Motoren in umgekehrter Position auf dem Deckglas immobilisiert werden und Mikrotubuli in die Kammer gegeben werden, landen Mikrotubuli auf Motoren und gleiten dahin, während die Motoren versuchen, auf ihnen zu laufen (Abbildung 5A, B).

1. Fluoreszierende Mikrotubuli-Polymerisation: Polymerisieren Sie die Mikrotubuli nach dem zuvor beschriebenen Protokoll, mit Ausnahme des Mischens von rhodaminmarkiertem Tubulin (3 mg / ml) mit unmarkiertem Tubulin (10 mg / ml) in einem Verhältnis von 1: 10.
2. Nach 30 min Polymerisation 30 μL vorgewärmter Mikrotubuli-Stabilisierungspuffer zugeben und 5 min bei 37 °C weiter inkubieren.
3. Als nächstes scheren Sie die Mikrotubuli durch Pipettieren mit der Kapillarladespitze (~ 25-30 mal).
4. Die Motilitätsflusskammer wie zuvor beschrieben vorbereiten, 50 μL Sf9-gereinigte GFP-Nanobodies fließen lassen (2,5 μL 100 nM verdünnt in 50 μL P12-Puffer) und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren, wobei das Deckglas in einer feuchten Kammer nach unten zeigt.
   HINWEIS: Die Motoren sind C-terminal mit mCitrin gekennzeichnet. GFP-Nanobodies werden verwendet, um die Motoren aufgrund ihrer niedrigen Dissoziationskonstante³² zu immobilisieren.
5. Blockieren Sie die Deckglasoberfläche, indem Sie 50 μL Blockpuffer in die Durchflusskammer fließen, um eine unspezifische Proteinadsorption zu verhindern, und inkubieren Sie weiter für 5 min.
6. Bereiten Sie die Motormischung vor, indem Sie 50 μL Blockpuffer, 1 μL 100 mM ATP und 5 μL 100 nM Sf9-gereinigte Kinesin-3-Motoren pipettieren. Vor dem Einfließen in die Kammer vorsichtig mischen und 30 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren.
7. Waschen Sie die Kammer zweimal mit 50 μL P12-Kasein.
8. In einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen wird die Gleitassaymischung in der folgenden Reihenfolge hergestellt, 45 μL P12-Casein mit 10 μM Taxol, 1 μL 100 mM ATP, 0,5 μL 8 mg/ml Katalase, 0,5 μL 20 mg/ml Glucoseoxidase, 0,5 μL 2,25 M Glucose und 1 μL gescherte fluoreszierende Mikrotubuli. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig, bevor Sie in die Motilitätskammer fließen, und verschließen Sie die Enden der Kammer mit flüssigem Paraffinwachs.
9. Bildmikrotubuli gleiten unter TIRF-Beleuchtung bei 100 ms Belichtung und erfassen die Bilder mit angeschlossener EM-CCD-Kamera.
   HINWEIS: Die durchschnittliche Gleitgeschwindigkeit von Mikrotubuli wurde durch manuelle Verfolgung von etwa 100 einzelnen Mikrotubuli Frame für Frame mit einem speziell geschriebenen Plugin in ImageJ²⁹ bestimmt. Bestimmen Sie die durchschnittliche Gleitgeschwindigkeit der Mikrotubuli, indem Sie ein Histogramm generieren und an eine Gaußfunktion anpassen (Abbildung 5C, D).

Um aktive und funktionelle rekombinante Motorproteine in großem Maßstab mit der Sf9-Baculovirus-Expression zu exprimieren und zu reinigen, benötigt das System die Erzeugung von Viruspartikeln, die stabil eine kodierende Sequenz tragen, um Sf9-Zellen zu infizieren. Um dies zu erreichen, wurden Sf9-Zellen mit rekombinantem Bacmid-Encoding KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG transfiziert. Nach 72 h zeigte eine signifikante Zellpopulation die Expression von grün fluoreszierendem Protein (mCitrin) mit vergrößerten Zellen und Kernen (Abbildung 1 und Abbildung 2), was auf eine erfolgreiche Erzeugung von Viruspartikeln (P0) hindeutet. Diese Viruspartikel wurden weiter expandiert, indem frische Sf9-Populationen in einem höheren Volumen infiziert wurden, um P1-Virusbestände für die Lagerung und großflächige Infektion zu erzeugen. Zur Reinigung des Kinesin-3-Motors wurde eine 30-ml-Kultur von Sf9-Zellen mit 1 ml P1-Viruspartikeln infiziert. Nach 72 Stunden Infektion wurden Zellen, die grün fluoreszierendes Protein exprimierten, geerntet, lysiert und mit C-terminaler FLAG-Tag-Affinitätsreinigung mit Anti-FLAG-Antikörper-beschichtetem Harz gereinigt. Interessanterweise eluierte die Zugabe von FLAG-Peptid zu den mit Kinesin-3-Motoren verbundenen Perlen den größten Teil des Proteins in einer einzigen Fraktion und das gereinigte Protein war von hoher Reinheit, dargestellt als eine Bande von ~ 120 kDa in Bahn 7 von Abbildung 3.

Die erfolgreiche Polymerisation langer und gesunder Mikrotubuli zur Untersuchung der Motilitätseigenschaften von S9-gereinigten Kinesin-3-Motoren auf Einzelmolekülebene erfordert reines Tubulin. In der vorliegenden Studie wurden die Mikrotubuli unter Verwendung von 2X zyklischem Tubulin polymerisiert, das aus dem Ziegenhirn in einer kritischen Konzentration zwischen ~ 2,5-3,0 mg / ml für 30 min in Abwesenheit von Taxol gereinigt wurde, da Taxol die kritische Konzentration der Mikrotubuli-Keimbildung verringert und eine große Anzahl kurzer Mikrotubuli erzeugt33,34,35 . Taxol wurde nach der Polymerisation hinzugefügt, um die Mikrotubuli zu stabilisieren und eine Depolymerisation zu verhindern. Mikrotubuli, die mit dieser Methode polymerisiert wurden, ergaben lange und gleichmäßige Strukturen (Video 1) mit einer durchschnittlichen Länge von 60-70 μm.

Die In-vitro-Einzelmolekülmotilitätsanalyse des Sf9-gereinigten Kinesin-3-Motors KIF1A (1-393LZ) unter TIRF-Beleuchtung (Abbildung 4B) zeigte eine unidirektionale, schnelle und superprozessive Bewegung entlang des Mikrotubuli (Video 2), wie im Kymographen als lange diagonale weiße Linien gezeigt (Abbildung 4C). Die Tracking-Analyse dieser langen superprozessiven Motilitätsereignisse ergab eine durchschnittliche Geschwindigkeit und Lauflänge von 2,44 ± 0,02 μms-1 bzw. 10,79 ± 0,28 μm (Abbildung 4D-E). Diese Ergebnisse stimmen mit unseren zuvor veröffentlichten Daten12,13 überein, die Motoren verwenden, die aus Säugetierzelllysat durch Überexpression hergestellt wurden. Darüber hinaus zeigte der Multimotor-Mikrotubuli-Gleit-Assay mit Sf9-gereinigten Motoren, die unter TIRF-Beleuchtung auf dem Deckglas angebracht waren, lange, gleichmäßige und unidirektionale Bewegungen (Abbildung 5C und Video 3). Die Tracking-Analyse dieser langen Mikrotubuli-Gleitereignisse ergab eine durchschnittliche Geschwindigkeit von 1,37 ± 0,01 μms-1 (Abbildung 5D).

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Sf9-Baculovirus-System ein hervorragendes System für die Expression und Reinigung aktiver Motorproteine bietet, die mit dem prokaryotischen System im Allgemeinen schwierig sind. FLAG Tag bietet einen Vorteil der einstufigen Reinigung von Protein in seiner reinen Form. Darüber hinaus ergibt die Mikrotubulipolymerisation mit frischem und reinem Tubulin und deren Stabilisierung nach der Polymerisation lange und gleichmäßige Mikrotubuli. Darüber hinaus deutet die In-vitro-Einzelmolekülmotilitätsanalyse darauf hin, dass Sf9-gereinigte Motoren robust waren und Motilitätseigenschaften aufwiesen, die denen von Motoren in Säugetiersystemen ähnelten.

Abbildung 1: 48 h nach Transfektion von Sf9-Zellen mit fluoreszenzmarkiertem Kinesin-3-Motor: Sf9-Zellen wurden auf einer 35-mm-Schale mit einer Dichte von 4,5 x 105 Zellen/ml plattiert. Nach 24 h wurden die Zellen mit rekombinanter Bacmid-DNA transfiziert, die den spezifischen Kinesin-3-Motor KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG unter Verwendung von Transfektionsreagenz kodiert. Nach 48 Stunden Transfektion wurden die Bilder unter differentieller Interferenz und Kontrast (DIC) und Epifluoreszenzbeleuchtung aufgenommen. (A) Nicht transfizierte Zellen, klein, rund und fest verbunden. (B) Transfizierte Zellen, die KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG-markiertes Protein exprimieren, das einen vergrößerten Zelldurchmesser aufweist und lose an die Oberfläche gebunden ist. Maßstabsbalken, 100 μm. (C) Balkendiagramm, das den durchschnittlichen Zelldurchmesser von nicht transfizierten und transfizierten Zellen angibt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar. N = 50 Zellen. Der studentische t-Test wird verwendet, um den Signifikanzwert (****p < 0,0001) zu finden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: 72 h Post-Transfektion von Sf9-Zellen mit fluoreszenzmarkiertem Kinesin-3-Motor: Bilder zeigen mehr als 90% der Sf9-Zellen, die einen fluoreszenzmarkierten Kinesin-3-Motor KIF1A(1-393LZ) exprimieren. Zellen sind lose an die Oberfläche gebunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Sf9-gereinigter Kinesin-3-Motor: Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das den Sf9-gereinigten Kinesin-3-Motor darstellt, KIF1A(1-393LZ) C-terminal, markiert mit 3xmCit-FLAG. Von links nach rechts, Proteinleiter (M), BSA-Standardproteinkontrolle, 0,2 μg (Bahn 2), 0,4 μg (Bahn 3), 0,6 μg (Bahn 4), 0,8 μg (Bahn 5) und 1,0 μg (Bahn 6), gereinigter Kinesin-3-Motor (S) (Bahn 7). BSA wurde als Standard verwendet, um die gereinigte Proteinkonzentration zu schätzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: In-vitro-Einzelmolekül-Motilitätstest unter Verwendung von Sf9-gereinigten Kinesin-3-Motoren:(A) Schematische Flusszellenmotilitätskammer, hergestellt mit einem Glasobjektträger, doppelseitigem Klebeband und Glasdeckglas. (B) Karikaturdiagramm, das die In-vitro-Einzelmolekül-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Motoren veranschaulicht, die sich entlang der Mikrotubulioberfläche bewegen, die unter Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) auf das Deckglas adsorbiert wurden. Nur die Moleküle, die sehr nahe am Deckglas liegen, werden durch das evaneszente Feld (~150-200 nm) angeregt, das durch die vollständige Reflexion des einfallenden Lichts gebildet wird, wenn es in einem Winkel jenseits des kritischen Winkels beleuchtet wird. (C) Der Kymograph zeigt den Kinesin-3-Motor, der prozessiv (diagonale weiße Linien) entlang der Mikrotubulioberfläche geht. Zeit auf der y-Achse (vertikaler Pfeil) und Abstand auf der x-Achse (horizontaler Pfeil). (D-E) Die Histogramme der Geschwindigkeit (D) und der Lauflänge (E) wurden bestimmt, indem einzelne Motoren, die auf der Mikrotubulioberfläche liefen, Bild für Bild verfolgt wurden, und Histogramme wurden für jede Population von Motoren aufgetragen und an einen einzelnen Gauß angepasst. Der Peak stellt die durchschnittliche Geschwindigkeit und Lauflänge dar, und die Werte werden im Diagramm als Mittelwert ± REM angezeigt. N = Anzahl der gezählten Ereignisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: In-vitro-Mikrotubuli-Gleittest mit gereinigten Sf9-Kinesin-3-Motoren: (A) Schematische Darstellung der Durchflusszellenkammer, die mit einem Glasobjektträger, doppelseitigem Klebeband und Glasdeckglas hergestellt wurde. (B) Cartoon-Diagramm, das rhodaminmarkierte Mikrotubuli zeigt, die auf der Oberfläche von konstitutiv aktiven Kinesin-3-Motoren gleiten. Da Kinesin-3-Motoren C-terminal-markiert mit mCitrin sind, wurden GFP-Nanobodies verwendet, um sie an der Glasoberfläche zu befestigen. Anschließend wurden gescherte, mit Rhodamin markierte Mikrotubuli in die Strömungskammer eingeführt und Bilder der Gleitbewegung der Mikrotubuli unter TIRF-Beleuchtung aufgenommen. (C) Der Kymograph stellt das glatte Gleiten der Mikrotubuli (diagonaler weißer Streifen) durch die Kinesin-3-Motoren dar. Zeit auf der y-Achse (vertikaler Pfeil) und Abstand auf der x-Achse (horizontaler Pfeil). D. Das Histogramm der Geschwindigkeit wurde für eine Population von Mikrotubuli aufgezeichnet und passte zu einem einzelnen Gaußschen Peak. Die durchschnittliche Gleitgeschwindigkeit wird in der oberen linken Ecke als Mittelwert ± REM angezeigt. N = Anzahl der gezählten Moleküle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Video 1: Polymerisierte Mikrotubuli. TIRF-Bildgebung von polymerisierten Mikrotubuli vor der Verdünnung für den Motilitätstest. Der Film wurde mit 100 ms Belichtung aufgenommen und das Video wird mit 60 Bildern / s abgespielt. Maßstabsleiste, 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: In vitro Einzelmolekül-Assay des konstitutiv aktiven Kinesin-3-Motors. Fluoreszenzmarkierte KIF1A(1-393LZ)-Motoren, gereinigt aus Sf9-Zellen, die sich progressiv entlang der Mikrotubuli-Oberfläche bewegen (unmarkiert), adsorbiert auf dem Deckglas in einer Motilitäts-Assay-Kammer. Die Bildgebung wurde in TIRF-Beleuchtung durchgeführt und die Bilder wurden bei einer Belichtung von 100 ms aufgenommen. Das Video wird mit 30 Bildern/s abgespielt. Maßstabsleiste, 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 3: Mikrotubuli-Gleittest des konstitutiv aktiven Kinesin-3-Motors. Rhodaminmarkierte Mikrotubuli gleiten sanft auf der Oberfläche des Glasdeckglases, beschichtet mit Sf9 gereinigtem KIF1A (1-393LZ) Motor. Die Bildgebung wurde in TIRF-Beleuchtung durchgeführt und die Bilder wurden bei einer Belichtung von 100 ms aufgenommen. Das Video wird mit 60 Bildern/s abgespielt. Maßstabsleiste, 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung von Puffern und Reagenzien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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