Molekulare und immunologische Techniken in einem gentechnisch veränderten Mausmodell des gastrointestinalen Stromatumors

Summary

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, das Kit^V558Δ/+ Mausmodell und Techniken für die erfolgreiche Dissektion und Verarbeitung von Mausproben zu beschreiben.

Abstract

Der gastrointestinale Stromatumor (GIST) ist das häufigste menschliche Sarkom und wird typischerweise durch eine einzige Mutation im KIT-Rezeptor verursacht. Über alle Tumorarten hinweg wurden zahlreiche Mausmodelle entwickelt, um die nächste Generation von Krebstherapien zu untersuchen. In GIST verwenden die meisten In-vivo-Studien jedoch Xenograft-Mausmodelle, die inhärente Einschränkungen aufweisen. Hier beschreiben wir ein immunkompetentes, gentechnisch verändertes Mausmodell eines gastrointestinalen Stromatumors, der eine Kit^V558Δ/+ Mutation beherbergt. In diesem Modell wird das mutierte KIT, das für die meisten GISTs verantwortliche Onkogen, von seinem endogenen Promotor angetrieben, was zu einem GIST führt, der das histologische Erscheinungsbild und das Immuninfiltrat in menschlichen GISTs nachahmt. Darüber hinaus wurde dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um sowohl gezielte molekulare als auch Immuntherapien zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Zucht und Pflege einer Kit^V558Δ/+ Mauskolonie. Darüber hinaus beschreibt dieses Papier die Behandlung und Beschaffung von GIST, drainierendem mesenterialen Lymphknoten und angrenzendem Blinddarm in Kit^{V558Δ / +} -Mäusen sowie die Probenvorbereitung für molekulare und immunologische Analysen.

Introduction

GIST ist das häufigste Sarkom beim Menschen mit einer Inzidenz von etwa 6.000 Fällen in den Vereinigten Staaten von Amerika¹. GIST scheint von den gastrointestinalen Schrittmacherzellen zu stammen, die als interstitielle Zellen von Cajal bezeichnet werden, und wird typischerweise durch eine einzige Mutation in der Tyrosinkinase KIT oder PDGFRA² angetrieben. Chirurgie ist die Hauptstütze der Behandlung von GIST und kann kurativ sein, aber Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung können mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI), Imatinib, behandelt werden. Seit seiner Einführung vor über 20 Jahren hat I....

Protocol

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen an der University of Pennsylvania nach NIH-Richtlinien und mit Genehmigung der University of Pennsylvania IAUC untergebracht. Euthanasie wurde nach den Standardarbeitsanweisungen der University of Pennsylvania Laboratory Animal Resources durchgeführt.

1. Kit^V558Δ/+ Mauszucht

1. Überqueren Sie die Kit^V558Δ/+ Mäuse mehr als 10 Mal auf einem C57BL/6J-Hintergrund mit C57BL/6J-Mäusen. Züchten Sie dazu die männlichen Kit^V558Δ/+ Mäuse mit weiblichen C57BL/6J Mäusen im Verhältnis 1:2.

Results

Das Mausmodell Kit^V558Δ/+ ermöglicht die Untersuchung von Therapeutika in einem immunkompetenten Mausmodell. Kit^V558Δ/+ Mäuse haben aufgrund einer fortschreitenden Darmobstruktion eine durchschnittliche Lebensdauer von 8 Monaten (Abbildung 4). Tumore von Kit^V558Δ/+-Mäusen exprimieren kanonische Marker von GIST, einschließlich der Tyrosinkinase KIT und des Transmembrankanals DOG1 (

Discussion

Das Mausmodell Kit^V558Δ/+ ist ein leistungsfähiges Forschungswerkzeug in der molekularen und immunologischen Analyse von GIST. Obwohl die Züchtungsstrategie eine einzige Kreuzung erfordert, erfordert die Verwendung von Kit^V558Δ/+ Mauskohorten in Experimenten, die die Tumorreaktion analysieren, eine umfangreiche Zucht. Mäuse sollten alters- und geschlechtsgerecht sein, um ähnliche Tumorgewichte zu gewährleisten, und 10% der Mäuse sterben vor dem Alter von 8 Wochen, wenn Tumore festg.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 Mikron Filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC Lysepuffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL Spritze	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-Well, 30 & Mikro; l	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyd Lösung	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 Mikron Filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 Mikron Filter	EMSCO	1194-2350
AKT Antikörper (C67E7)	Zellsignalisierung	4691
C57BL/6J Mäuse	The Jackson Laboratory
Kollagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Kompletter Mini-EDTA-freier Proteasehemmer	Thomas	Scientific C852A34
Countess II Automatisierter Zellzähler	Thermo Fisher Scientific
Einweg-Skalpelle	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas	Scientific C756V81
Dog1 Antikörper	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK Antikörper (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
Fidschi Software	Fidschi		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenisator	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib Mesilat	Selleck Chemicals	S1026
KIT Antikörper (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotypisierung	Transnetyx
Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Maus-auf-Maus-Immundetektionskit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrozellulosemembran, vorgeschnitten, 0,45 &; Mikro; m	Rio-Rad	1620145
fettfreie Trockenmilch	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Ersatz	Sigma Aldrich	74385
p-AKT Antikörper (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK Antikörper (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT Antikörper (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease-Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Röhrchen für den Polystyrol-Test (FACS) mit rundem Boden	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Natriumfluorid (NaF)	Sigma Aldrich
Natriumorthovanadat (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS Puffer (10x)	University of Pennsylvania Cell
Center Gewebekulturschale (100 mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
zwischen 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 Plattform	Scanco medical