Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Dongbo Xu; Li Wang; Kyle Wieczorek; Yanqing Wang; Xiaojing Zhang; David W. Goodrich; Qiang Li

doi:10.3791/63855

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Methodenartikel

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

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DOI:

10.3791/63855

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5. Mai 2022

Dongbo Xu¹ , Li Wang¹ , Kyle Wieczorek¹ , Yanqing Wang² , Xiaojing Zhang² , David W. Goodrich² , Qiang Li¹^,²

¹Department of Urology, Roswell Park Comprehensive Cancer Center, ²Department of Pharmacology and Therapeutics, Roswell Park Comprehensive Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Zusammenfassung

Blasenkrebs ist ein wenig untersuchter Bereich, insbesondere in gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs). Inzucht-GEMMs mit gewebespezifischen Cre- und loxP-Stellen waren die Goldstandards für bedingtes oder induzierbares Gen-Targeting. Um schnellere und effizientere experimentelle Modelle zu liefern, wird ein Ex-vivo-Organoid-Kultursystem entwickelt, das das Adenovirus Cre und normale Urothelzellen verwendet, die mehrere loxP-Allele der Tumorsuppressoren Trp53, Pten und Rb1 tragen. Normale Urothelzellen sind enzymatisch von vier Blasen dreifach floxierter Mäuse getrennt (Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f^/f). Die Urothelzellen werden ex vivo mit Adenovirus-Cre transduziert, das von einem CMV-Promotor (Ad5CMVCre) angetrieben wird. Die transduzierten Blasenorganoide werden in vitro und in vivo kultiviert, vermehrt und charakterisiert. Die PCR wird verwendet, um Gendeletionen in Trp53, Pten und Rb1 zu bestätigen. Die Immunfluoreszenz-Färbung (IF) von Organoiden zeigt eine positive Expression von Urothellinienmarkern (CK5 und p63). Die Organoide werden subkutan in Wirtsmäuse injiziert, um Tumorexpansion und serielle Passagen zu erhalten. Die Immunhistochemie (IHC) von Xenotransplantaten zeigt eine positive Expression von CK7, CK5 und p63 und eine negative Expression von CK8 und Uroplakin 3. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Adenovirus-vermittelte Gendeletion aus Urothelzellen der Maus, die mit loxP-Stellen manipuliert wurden, eine effiziente Methode ist, um das tumorigene Potenzial definierter genetischer Veränderungen schnell zu testen.

Einleitung

Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart bei Männern und betrifft jährlich mehr als 80.000 Menschen in den Vereinigten Staaten¹. Die platinbasierte Chemotherapie ist seit mehr als drei Jahrzehnten der Standard für Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkrebs. Die Landschaft der Blasenkrebsbehandlung wurde durch die jüngste Zulassung der Food and Drug Administration (FDA) für Immuntherapie (Anti-PD-1- und Anti-PD-L1-Immun-Checkpoint-Inhibitoren), Erdafitinib (ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-Inhibitor) und Enfortumab-Vedotin (ein Antikörper-Wirkstoff-Konjugat) revolutioniert2,3,4.