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Methodenartikel

Isolierung von Präadipozyten aus Masthähnchen-Kieferembryonen

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DOI:

10.3791/63861

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4. August 2022

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1Department of Animal Science, University of Tennessee

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von Präadipozyten aus Fettgewebe in Masthähnchenembryonen. Diese Methode ermöglicht die Isolierung mit hoher Ausbeute, Primärkultur und adipogener Differenzierung von Präadipozyten. Öl-Rot-O-Färbung und Lipid-/DNA-Färbung maßen die adipogene Fähigkeit isolierter Zellen, die mit Differenzierungsmedien induziert wurden.

Zusammenfassung

Primäre Präadipozyten sind ein wertvolles experimentelles System zum Verständnis der molekularen Signalwege, die die Differenzierung und den Stoffwechsel von Adipozyten steuern. Hühnerembryonen bieten die Möglichkeit, Präadipozyten vom frühesten Stadium der Fettentwicklung an zu isolieren. Diese Primärzelle kann verwendet werden, um Faktoren zu identifizieren, die die Präadipozytenproliferation und die adipogene Differenzierung beeinflussen, was sie zu einem wertvollen Modell für Studien im Zusammenhang mit Fettleibigkeit bei Kindern und der Kontrolle der überschüssigen Fettablagerung bei Geflügel macht. Das schnelle Wachstum von postnatalem Fettgewebe verschwendet effektiv Futter, indem es vom Muskelwachstum bei Masthühnern wegverteilt wird. Daher können Methoden zum Verständnis der frühesten Stadien der Fettgewebeentwicklung Hinweise geben, um diese Tendenz zu regulieren und Wege zu finden, die Fettausdehnung früh im Leben zu begrenzen. Die vorliegende Studie wurde entwickelt, um eine effiziente Methode zur Isolierung, Primärkultur und adipogenen Differenzierung von Präadipozyten zu entwickeln, die aus sich entwickelndem Fettgewebe kommerzieller Masthähnchen-Kükenembryonen (Fleischtyp) isoliert wurden. Das Verfahren wurde optimiert, um Zellen mit hoher Lebensfähigkeit (~ 98%) und erhöhter Fähigkeit zur Differenzierung in reife Adipozyten zu erhalten. Diese einfache Methode der embryonalen Präadipozytenisolierung, -kultur und -differenzierung unterstützt funktionelle Analysen des Fettwachstums und der Entwicklung im frühen Leben.

Einleitung

Fettleibigkeit ist eine globale Gesundheitsbedrohung für Erwachsene und Kinder. Kinder, die übergewichtig oder fettleibig sind, sind etwa fünfmal häufiger fettleibig als Erwachsene, was sie einem signifikant erhöhten Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und viele andere Komorbiditäten aussetzt. Etwa 13,4% der US-Kinder im Alter von 2-5 Jahren haben Fettleibigkeit1, was zeigt, dass die Tendenz, überschüssiges Körperfett anzusammeln, sehr früh im Leben in Gang gesetzt werden kann. Aus sehr unterschiedlichen Gründen ist die Ansammlung von überschüssigem Fettgewebe ein Problem für Masthühner (Fleisch). Moderne Masthähnchen sind unglaublich effizient, akkumulieren aber immer noch mehr Lipid als physiologisch notwendigist 2,3. Diese Tendenz beginnt kurz nach dem Schlüpfen und verschwendet effektiv Futter, die teuerste Produktionskomponente, indem sie es vom Muskelwachstum weg verteilt. Daher besteht sowohl für Kinder als auch für Masthühner, wenn auch aus sehr unterschiedlichen Gründen, die Notwendigkeit, Faktoren zu verstehen, die die Entwicklung des Fettgewebes beeinflussen, und Wege zu finden, die Fettexpansion früh im Leben zu begrenzen.

Adipozyten bilden sich aus Präadipozyten, aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen, die einer Differenzierung unterzogen werden, um reife, lipidspeichernde Fettzellen zu entwickeln. Dementsprechend sind Präadipozyten in vitro ein wertvolles experimentelles Modell für Adipositasstudien. Diese Zellen, die aus der stromalen vaskulären Fraktion der Fettdepots isoliert sind, können ein grundlegendes Verständnis der molekularen Signalwege liefern, die die Differenzierung und den Stoffwechsel der Adipozyten steuern 4,5. Kükenembryonen sind ein günstiges experimentelles Modell in Entwicklungsstudien, da die Kultivierung von Eiern nach dem gewünschten Zeitplan die experimentelle Manipulation erleichtert, da sie es ermöglicht, Embryonen ohne das Opfer der Mutter zu erhalten, um eine Reihe von Entwicklungsstadien von Embryonen zu beobachten. Darüber hinaus sind komplizierte chirurgische Eingriffe und längere Zeiträume nicht erforderlich, um Embryonen im Vergleich zu größeren Tiermodellen zu erhalten. Daher bietet der Kükenembryo die Möglichkeit, Präadipozyten aus den frühesten Stadien der Fettgewebeentwicklung zu erhalten. Unterhautfettgewebe wird im Küken um den 12. Embryonaltag (E12) als klar definiertes Depot um den Oberschenkel herum sichtbar. Dieses Depot ist mit hochproliferativen Präadipozyten angereichert, die unter Entwicklungshinweisen aktiv differenziert werden, um reife Adipozytenzu bilden 6,7. Der Prozess der adipogenen Differenzierung ist zwischen Hühnern und Menschen vergleichbar. Daher können Präadipozyten, die aus Kükenembryonen isoliert wurden, als Zweizweckmodell für Studien verwendet werden, die für Menschen und Geflügel relevant sind. Die Ausbeute an Präadipozyten nimmt jedoch mit zunehmendem Alter ab, da die Zellen zu reifen Adipozyten heranwachsen5.

Das vorliegende Protokoll optimiert die Isolierung von Präadipozyten aus Fettgewebe während des Stadiums (E16-E18), in dem adipogene Differenzierung und Adipozytenhypertrophie in Masthähnchenkükenembryonen ihren Höhepunkt erreichen8. Dieses Verfahren kann die Auswirkungen von Faktoren, denen der sich entwickelnde Embryo in Ovo ausgesetzt ist, wie z. B. die Ernährung von Hühnern, auf die Adipozytenentwicklung und das adipogene Potenzial ex vivo bewerten. Es kann auch den Einfluss verschiedener Manipulationen (z. B. Hypoxie, Nährstoffzusätze, pharmakologische Agonisten und Antagonisten) auf die Adipogenese oder die verschiedenen Ome (z. B. Transkriptom, Metabolom, Methylom) von Adipozytenvorläufern testen. Als Darstellung des frühesten Stadiums der Fettbildung sind die mit diesem Protokoll erhaltenen Zellen wertvolle Modelle für Studien, die für Geflügel und Menschen relevant sind.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Tennessee genehmigt. Frisch befruchtete kommerzielle Masthähncheneier (Cobb 500) wurden aus einer lokalen Brüterei gewonnen. Die Eier wurden bei 38 °C mit 60% relativer Luftfeuchtigkeit bis zur Dissektion an den Embryonaltagen 16-18 (E16-E18) bebrütet. Fettgewebe wurde aus dem subkutanen (femoralen) Depot entnommen.

1. Vorbereitung auf Isolation und Kultur

  1. Bereiten Sie die Kulturhaube und die Instrumente vor.
    1. Bevor Sie mit der Dissektion beginnen, richten Sie einen Arbeitsbereich in der Laminar-Flow-Haube ein. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich und alle Instrumente durch Abtropfen mit 70% Ethanol. Führen Sie alle Verfahren mit sterilen Materialien durch.
      HINWEIS: Tupfen Sie die Behälter und Instrumente immer mit 70% Ethanol ab, bevor Sie sie wieder in die Zellkulturhaube legen. Es wird empfohlen, einen Tisch-Instrumentensterilisator in der Haube zu platzieren, damit die Instrumente leicht zwischen den Embryonen sterilisiert werden können.
      ACHTUNG: Wenn Sie einen Instrumentensterilisator verwenden, kühlen Sie das heiße Instrument richtig ab, um Verbrennungsverletzungen und Gewebeschäden zu vermeiden. Eine Mindestabkühlzeit von 3 min wird empfohlen. Vor Gebrauch mit 70% Ethanol abtupfen.
    2. Montieren Sie folgende Instrumente und Gefäße in der Haube: gerade Pinzette (120 mm), Pinzette (110 mm), zwei Paar gebogene Pinzetten (100 mm), zwei Paar gerade Scheren (140 mm), gebogene chirurgische Scheren (115 mm), Gewebesieb (250 μm Nylonnetz), Zellsieb (40 μm Nylongewebe), konische Zentrifugenröhrchen (15 ml und 50 ml), Petrischalen (60 mm und 100 mm), kleines Becherglas (100 ml), 70% Ethanolspray und sterile Gaze, Papiertuch und Tischwischer (siehe Materialtabelle).
  2. Bereiten Sie enzymatische Lösungen, Sammelmedien und Kulturmedien mit den folgenden Schritten vor.
    HINWEIS: Bereiten Sie die Lösungen im Voraus vor und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C. Medien müssen vor der Gewebeentnahme auf Eis gelegt werden. Alle in diesem Schritt verwendeten Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
    1. Bereiten Sie Medien vor, die sowohl für die Entnahme von Fettgewebe als auch für die Herstellung einer enzymatischen Lösung verwendet werden, indem Sie DMEM/F12 (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 2,50 mM L-Glutamin und 15 mM HEPES-Puffer) mit 2,5 μg/ml Amphotericin B und 1x Penicillin/Streptomycin (P/S), 100 U/ml ergänzen. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Dieses Medium bleibt bei einer Lagerung bei 4 °C 1 Jahr lang stabil.
    2. Sterilisationslösung vorbereiten, indem Betadin in 1x PBS (Phosphat Buffered Saline mit pH 7,4, ohne Calcium, Magnesium oder Phenolrot) mit 2,5 μg/ml Amphotericin B auf 20% (v/v) verdünnt wird.
      HINWEIS: Die Lösung ist bei Lagerung bei 4 °C 2 Jahre haltbar.
    3. Es wird eine enzymatische Lösung hergestellt, indem die Typ-1-Kollagenase (1 mg/ml) in DMEM/F12 mit 2,5 μg/ml Amphotericin B und 1x P/S aufgelöst wird (Schritt 1.2.1). Machen Sie frische Kollagenase-Lösung und halten Sie sie während der Dissektionen auf Eis. Etwa 10 min vor dem Gebrauch, vorwärmen, indem diese Lösung bei 37 °C in einem Wasserbad inkubiert wird, um ihre enzymatische Aktivität zu initiieren.
      HINWEIS: Pro 100 mg Fettgewebe wird etwa 1 ml Kollagenaselösung (1 mg/ml) benötigt.
    4. Bereiten Sie Wachstumsmedien für die Beschichtung und Ausbreitung vor, indem Sie DMEM/F12-Medien mit 1x P/S und 10% FBS ergänzen. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Die Lösung ist 1 Jahr lang stabil, wenn sie bei 4 °C gelagert wird.
    5. Bereiten Sie die Waschlösung vor, indem Sie 1x PBS mit 2,5 μg/ml Amphotericin B ergänzen. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Die Lösung ist bei Lagerung bei 4 °C 2 Jahre haltbar.

2. Fettgewebeentnahme und Verdauung

  1. Euthanasieren Sie den Embryo.
    1. Am 16. Embryonaltag die Eier aus dem Inkubator entfernen. Die primäre potenzielle Quelle der mikrobiellen Kontamination ist die Oberfläche des Eies; Tupfen Sie daher die Eier mit einer sterilen Gaze ab, die mit 70% Ethanol getränkt ist, bevor Sie sie knacken. Legen Sie das Ei nach dem Abstrich vertikal mit dem spitzen Ende nach unten auf ein kleines Becherglas (100 ml), das mit Papiertüchern ausgekleidet ist, um das Ei vom Glas abzufedern.
    2. Zerbrechen Sie mit dem Griff der Pinzette ein Ei, indem Sie auf das stumpfe Ende des Eies tippen. Entfernen Sie vorsichtig die Eierschale, um eine Öffnung zu schaffen, die groß genug ist, um den Embryo zu entfernen (Schritt 2.1.3). Reißen Sie vorsichtig die weiße Schalenmembran auf, um den Embryo freizulegen (Abbildung 1A). Durchbohren Sie das Amnion vorsichtig mit einer sterilen Pinzette (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Die Fruchtblase ist eine transparente Membran, die mit Fruchtwasser gefüllt ist und den Embryo umschließt.
    3. Entfernen Sie den Embryo aus dem Ei, indem Sie den Hals des Embryos mit gerader Pinzette leicht greifen. Durchtrennen Sie den Dottersack, um ihn vom Embryo zu trennen, und übertragen Sie den Embryo in eine 100 mm große Petrischale.
    4. Enthaupten Sie sofort mit chirurgischen Scheren und Pinzetten.
  2. Führen Sie die Fettgewebeentnahme durch.
    1. Tupfen Sie den Embryokörper mit 70% Ethanol ab und schrubben Sie die Hautoberfläche sanft mit einer sterilen Gaze, um Federn zu entfernen, da sie die Filtration in späteren Schritten nach der Verdauung beeinträchtigen können. Verwenden Sie Tischwischer, um zu verhindern, dass Haut und Federn das gesammelte Gewebe berühren.
    2. Schneiden Sie die Haut zwischen den Beinen und der Bauchregion ab, um das Paar der femoralen Fettdepots freizulegen.
    3. Halten Sie die Haut mit einer gebogenen Pinzette um das Bein. Entfernen Sie vorsichtig das femorale Unterhautfett mit der anderen Hand und ziehen Sie das Depot vorsichtig vom Bein weg, indem Sie eine gebogene Pinzette verwenden.
      HINWEIS: Es gibt relativ wenig Bindegewebe, das am Fettpolster am Bein haftet, und das gesamte Fettpolster sollte in einem Stück nur mit einer Pinzette herausnehmbar sein. Dies kann erleichtert werden, indem die Pinzette nach hinten gedrückt wird, so dass die gekrümmten Teile (und nicht die Enden) das Fettpolster zum Entfernen klemmen.
      1. Falls erforderlich, schneiden Sie das Fettpolster mit einer gebogenen Schere ab. Wiederholen Sie dies mit dem anderen Fettpolster und zusätzlichen Embryonen nach Bedarf.
        HINWEIS: Insgesamt 80 mg subkutanes Fett können aus den meisten Embryonen bei E16 gewonnen werden (Abbildung 1C). Dies ergibt typischerweise ~ 1 x 106 Zellen, genug, um einen T-25-Kolben zu beschichten. Es könnte bei diesem Schritt nützlich sein, Fettpolster aus einigen Embryonen zu wiegen, um die Menge des Ausgangsmaterials zu beurteilen, da die Fettpolstergewichte über bestimmte Masthähnchenlinien hinweg variieren können und aufgrund unkontrollierbarer Faktoren wie Alter und Ernährung der Züchterhenne. Subkutanes Fett wurde routinemäßig aus fünf Eiern gesammelt, um eine ausreichende Ausbeute an Zellen für die Plattierung in mehreren Kolben zu gewährleisten.
    4. Übertragen Sie das Gewebe in ~ 5 ml Sammelmedien in einem 15-ml-Röhrchen und wiederholen Sie die Dissektion für die verbleibenden Eier.
    5. Spülen Sie die gesammelten Fettpolster kurz ab, indem Sie sie in eine 60-mm-Petrischale mit Sterilisationslösung geben und die Schale einige Male schwenken.
    6. Spülen Sie die Sterilisationslösung ab, indem Sie die Fettpads in eine 60 mm Petrischale mit 1x PBS geben. Vorsichtig schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie auf eine zweite 60-mm-Petrischale mit 1x PBS wechseln.
  3. Führen Sie die enzymatische Verdauung und die Isolierung der Präadipozyten gemäß den folgenden Schritten durch.
    1. Übertragen Sie das Fettgewebe in ein 15-ml-Röhrchen, das ~ 1 ml vorgewärmte enzymatische Lösung pro 100 mg Gewebe enthält. Tauchen Sie eine lange, gerade Schere in das Rohr und zerkleinern Sie das Fettgewebe in der Lösung fein in möglichst kleine Stücke (~1 mm3) (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Die Zellausbeute wird reduziert, wenn das Gewebe nicht gründlich zerkleinert wird.
    2. Überführen Sie das gehackte Gewebe und die enzymatische Lösung in einen 25-ml-Autoklavenkolben. Den Kolben mit Paraffinfolie umwickeln. Auf einen Orbitalschüttler in einen Inkubator geben und während des Verdauungsschritts bei 37 °C schütteln.
      HINWEIS: Alternativ können Sie ein schüttelndes Wasserbad verwenden. Bei beiden Ansätzen sollte die Geschwindigkeit ausreichen, um zu verhindern, dass sich Gewebestücke auf dem Boden des Kolbens absetzen, darf jedoch nicht so schnell sein, dass die Stücke an die Oberseite des Kolbens geschleudert werden und am Glas haften bleiben oder dass sich Flüssigkeit auf der Paraffinfolienabdeckung ansammelt.
    3. Nach ~30 min schneiden Sie das Ende einer 1 ml Pipettenspitze auf einen Durchmesser von ca. 3 mm. Pipettieren Sie die Gewebemischung einige Male auf und ab, um die Zellen aus dem Fettgewebe freizusetzen. Bringen Sie den Kolben in den Inkubator/das Wasserbad zurück und setzen Sie das Schütteln fort.
    4. Überprüfen Sie nach weiteren 15 Minuten den Kolben auf Vollständigkeit der Verdauung. Nach dem Entfernen des Kolbens aus dem Shaker bildet sich eine Schicht weißlicher Zellen an der Oberseite der Flüssigkeitsschicht. Wenn noch Gewebefragmente übrig sind, schneiden Sie das Ende von einer anderen Pipettenspitze ab und pipettieren Sie die Mischung vorsichtig auf und ab, dann schütteln Sie sie weitere 15 Minuten.
      HINWEIS: Vollständig verdautes Gewebe / Kollagenase-Gemisch sieht aus wie milchiger Speisemüll. Typischerweise ist das Gewebe nach 1 Stunde sanftem Schütteln ausreichend verdaut. Wenn an dieser Stelle viele Fragmente verbleiben, kann dies auf ein Problem mit dem verwendeten Kollagenase-Enzym hinweisen. Ständiges Schütteln kann den Ertrag erhöhen; Eine längere Exposition gegenüber dem Enzym und die körperliche Belastung können jedoch auch die Zellen schädigen.
    5. Nach der Verdauung vorsichtig auf und ab pipettieren, um sie gut zu mischen. Filtern Sie durch ein 250-μm-Gewebesieb in ein 15-ml-Rohr durch Pipettieren, um unverdautes Gewebe und Ablagerungen zu entfernen.
      1. Spülen Sie den Kolben mit 4 ml Wachstumsmedien durch Pipettieren ab, um Zellen zu entfernen, die am Glas haften bleiben können, und filtern Sie in dasselbe 15-ml-Rohr. Spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen Wachstumsmedien durch Pipettieren ab, um alle eingeschlossenen Zellen bis zu einem Gesamtvolumen von 14 ml zu lösen.
    6. Pelletieren Sie die Zellfraktion durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min bei RT (7 min für 50 mL Röhrchen).
      HINWEIS: Tupfen Sie die Röhrchen immer mit 70% Ethanol ab, bevor Sie zur Zellkulturhaube zurückkehren.
    7. Aspirieren Sie den Überstand. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (siehe Materialtabelle), indem Sie es auf und ab pipettieren, und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei RT. Die Lösung wird rötlich, wenn rote Blutkörperchen lysiert werden (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Platzieren Sie den RBC-Lysepuffer vor der Verwendung bei RT. Hühner haben rote Blutkörperchen9 genukleed und sie heften sich zusammen mit Präadipozyten an Gewebekulturschalen. RBC-Lysepuffer wird verwendet, um diese Zellen zu lysieren, um ihre Interferenz mit genauen Zellzahlen zu verhindern.
    8. Fügen Sie 5 ml Wachstumsmedien in das Röhrchen mit den Zellen hinzu, um den Lysepuffer zu verdünnen, und mischen Sie vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren. Filtern Sie mit einer Pipette durch ein 40-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Rohr und spülen Sie das Sieb mit zusätzlichen 5 ml Wachstumsmedien ab.
    9. Pelletzellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 7 min bei RT. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und resuspendieren Sie das verbleibende Zellpellet in 1 ml Wachstumsmedien durch Pipettieren nach oben und unten.
      1. Verwenden Sie ein Hämozytometer, einen Zellzähler und einen Trypan Blue-Fleck, um Zellen zu zählen und die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen. Nehmen Sie 10 μL Probe und mischen Sie mit 10 μL Trypan Blue durch Pipettieren. Belasten Sie 10 μL der Mischung auf das Hämatoktometer und messenSie 10.
        HINWEIS: Die Zentrifugationsgeschwindigkeiten können auf 600 x g erhöht werden, wenn nach dem ersten Spin nicht genügend Zellpellets sichtbar sind.

3. Aussaat und Kultur von Präadipozyten

  1. Samen Sie ~ 1 x 106 Zellen in 4 ml vorgewärmten Wachstumsmedien in einem T-25-Kolben. Folgen Sie der gleichen Beschichtungsdichte, wenn Sie andere Arten von Kulturgefäßen verwenden. In den Gewebekultur-Inkubator geben und über Nacht anbringen lassen.
    HINWEIS: Die Zellen werden in einem 38 °C Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO2 kultiviert. Die optimale Temperatur für das Wachstum von Vogelzellen11 beträgt 38 ° C, und sie wachsen langsam bei 37 ° C.
  2. Am nächsten Tag aspirieren Sie Medien und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x PBS durch Pipettieren, um nicht angehängte oder tote Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie durch 4 ml frische Wachstumsmedien. Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop. Zellen sollten wie Fibroblasten spindeldürrisch geformt sein (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Typischerweise heften sich Präadipozyten ziemlich schnell (innerhalb weniger Stunden). Der Erfolg oder Misserfolg der Zellisolierung kann zu diesem Zeitpunkt (nach 24 h) bestätigt werden.
  3. Ersetzen Sie alle 2 Tage durch 4 ml frisches Wachstumsmedium und subkulturieren oder kryokonservieren Sie die Zellen, wenn sie einen Zusammenfluss von 70% -80% erreichen (Abbildung 3C).

4. Subkulturierung und Kryokonservierung

  1. Aspirieren Sie alte Medien und waschen Sie Zellen vorsichtig mit 4 ml von 1x PBS durch Pipettieren. Aspirieren Sie PBS, fügen Sie 2 ml 0,1% Trypsin hinzu, um die Zelloberfläche in einem T-25-Kolben zu bedecken (passen Sie das Volumen entsprechend für andere Kulturgefäße an) und inkubieren Sie dann für 3-4 min bei 38 ° C.
    HINWEIS: Beobachten Sie, ob sich die Zellen von der Kulturplatte lösen. Klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturplatte, um die Zellablösung zu unterstützen. Das Inkubieren von Zellen mit Trypsin für zu lange wird Zellen schädigen.
  2. Fügen Sie ein äquivalentes Volumen vorerwärmter Wachstumsmedien hinzu, um die Trypsinreaktion zu hemmen. Pipette mehrmals über die Zelloberfläche und kippt die Platte, um die verbleibenden Zellen zu lösen.
  3. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei RT (7 min für 50 mL-Röhrchen). Aspirieren Sie den Überstand.
  4. Wenn Sie subkultivieren, resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Wachstumsmedien durch Pipettieren nach oben und unten. Die Zellen werden wie in Schritt 2.3.9.1 beschrieben gezählt und dann mit der gleichen Beschichtungsdichte, die ursprünglich in Schritt 3.1 verwendet wurde, neu plattiert.
  5. Wenn Sie kryokonservieren, bereiten Sie 4 ml Gefriermedien für einen T-25-Kolben mit 90% Konfluenz vor.
    HINWEIS: Das Einfrieren von Medien besteht zu 10 % aus DMSO, zu 30 % aus FBS und zu 60 % aus DMEM/F12.
  6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in Gefriermedien und übertragen Sie 1 ml Gefriermedium in ein Kryovitum. Die Kryofrüchte werden mit einem Gefrierbehälter langsam auf -1 °C/min eingefroren. Stellen Sie den Behälter über Nacht in einen -80 °C Gefrierschrank und geben Sie ihn dann zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff um.
    HINWEIS: Richtig kryokonservierte Präadipozyten behalten ihre Lebensfähigkeit für mindestens 3 Jahre bei und verhalten sich typischerweise wie frisch isolierte Zellen, wenn sie aufgetaut und plattiert werden.

5. Adipogene Differenzierung

HINWEIS: 2% gelatinebeschichtete Platten können verwendet werden, um die Zelladhäsion zu verbessern.

  1. Bereiten Sie eine 2% (w/v) Gelatinelösung (siehe Materialtabelle) in destilliertem Wasser vor. Autoklav bei 121 °C, 15 psi für 30 min sterilisieren. Beschichtungskulturoberfläche mit 5-10 μL Gelatinelösung/cm 2 (d.h. 100-200 μg/cm2). Vorsichtig schwenken, um die Oberfläche gleichmäßig zu beschichten.
  2. Prüfen Sie die Platten auf gleichmäßige Verteilung der Gelatinelösung, da einige Regionen zunächst unbeschichtet bleiben können. Lassen Sie die gelatinebeschichtete Platte mindestens 1 h bei RT verbleiben. Entfernen Sie das gesamte Volumen der Gelatinelösung aus den Vertiefungen.
    HINWEIS: Dies hinterlässt eine dünne Gelatineschicht am Boden der Vertiefungen / Schalen. Gelatinelösung kann mehrmals (mindestens 10 Mal) wiederverwendet werden, ohne die Zelladhäsion und das Zellwachstum zu verändern. Lassen Sie die mit Gelatine beschichteten Schalen mindestens 30 Minuten in der Gewebekulturhaube verbleiben, bevor Sie die Zellen plattieren.
  3. Veranlassen Sie die Huhnpräadipozyten zur adipogenen Differenzierung, indem Sie Wachstumsmedien mit Fettsäuren ergänzen. Zur Herstellung adipogener Differenzierungsmedien (ADM) ergänzen Sie DMEM/F12 mit 10% Hühnerserum, 1x Linolsäure-Ölsäure-Albumin (9,4 μg/ml) und 1x P/S (siehe Materialtabelle). Machen Sie ADM vor Gebrauch frisch und warm.
    HINWEIS: Hähnchenpräadipozyten werden häufig dazu gebracht, adipogene Differenzierungen zu durchlaufen, indem Medien mit Fettsäuren anstelle von hormonellen Cocktails ergänzt werden, die typischerweise für Adipozyten anderer Speziesverwendet werden 12.
  4. Induzieren Sie die Differenzierung, indem Sie Wachstumsmedien durch adipogene Differenzierungsmedien ersetzen, wenn Zellen ~ 90% Konfluenz erreichen. Pflegen Sie Zellen in diesem Medium und ersetzen Sie sie alle 2 Tage. Beurteilen Sie die Differenzierung visuell unter einem Mikroskop (20x) basierend auf der Bildung von Lipidtröpfchen, die innerhalb von 48 Stunden nach der Induktion der Differenzierung leicht sichtbar werden.

6. Beurteilung der Adipogenese

  1. Führen Sie die Öl-Rot-O-Färbung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Platten Sie die Zellen in einer Sechs-Well-Platte und induzieren Sie eine adipogene Differenzierung bei ~ 90% Konfluenz.
    2. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Oil Red O vor, indem Sie sechs Teile der Oil Red O-Stammlösung mit vier Teilen destilliertem Wasser in einem 50-ml-Rohr kombinieren. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab und lassen Sie es 10 Minuten bei RT stehen, und filtern Sie dann durch ein Filterpapier der Klasse 1 (siehe Materialtabelle) im Trichter, indem Sie die Lösung langsam in ein 50-ml-Rohr gießen.
      HINWEIS: Oil Red O Stammlösung wird hergestellt, indem 0,7 g Oil Red O (siehe Materialtabelle) in 200 ml 100% Isopropanol in einer autoklavierten Flasche gelöst werden. Gut mischen und 20 min ruhen lassen. Bei 4 °C lagern und bis zum Gebrauch lichtgeschützt aufbewahren. Dies ist stabil für 1 Jahr. Die Arbeitslösung kann für 3 h verwendet werden; Es wird jedoch empfohlen, es innerhalb von 2 Stunden zu verwenden.
    3. Entfernen Sie die Medien und waschen Sie die Vertiefungen vorsichtig zweimal mit 2 ml vorgewärmtem 1x PBS mit einer Pipette. Entfernen Sie PBS vollständig durch Pipettieren. Fixieren Sie Zellen mit 2 ml 10% gepuffertem Formalin und wickeln Sie die Platte mit Paraffinfolie um. Vor dem Färben mindestens 1 Stunde und bis zu 2 Tage bei RT einwirken lassen.
      HINWEIS: Um 1 l 10% gepufferte Formalinlösung herzustellen, mischen Sie 100 ml 37% Formaldehyd, 4,09 gNaH2PO 4, 6,5 gNa2HPO4 (siehe Materialtabelle) und 900 ml destilliertes Wasser. Pipettieren Sie Formalin nicht direkt auf die Zellen. Vorsichtig auf die Seitenwand in der Nähe des Brunnenbodens dosieren.
    4. Entfernen Sie Formalin und waschen Sie die Brunnen vorsichtig mit 2 ml destilliertem Wasser. Ersetzen Sie durch 2 ml 60% Isopropanol. Nach 5 min Isopropanol entfernen und die Vertiefungen ca. 10 min vollständig trocknen lassen. Führen Sie alle Färbeschritte bei RT durch.
    5. Fügen Sie 1 ml Oil Red O-Arbeitslösung zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 10-20 min bei RT. Entfernen Sie den Fleck durch Pipettieren und waschen Sie ihn fünfmal, indem Sie in Leitungswasser tauchen, bis kein überschüssiger Fleck mehr zu sehen ist. Nach dem letzten Spülen fügen Sie 1 ml Wasser zu den Zellen hinzu, bevor Sie die Färbung sichtbar machen und Bilder unter einem Mikroskop sammeln.
    6. Um die Lipidakkumulation pro Schale zu quantifizieren, entfernen Sie Wasser und extrahieren Sie den Öl-Rot-O-Farbstoff aus den Zellen, indem Sie 1-2 ml 100% Isopropanol hinzufügen, das ausreicht, um die Zellen in einer Vertiefung von sechs Bohrlöchern vollständig zu bedecken. Inkubieren Sie mit sanftem Schütteln auf einem Plattenschüttler für 10 min bei RT.
    7. Transfer von 200 μL der Extraktion in eine Vertiefung der 96-Well-Assay-Platte. Quantifizieren Sie die relative Fleckenmenge mit einem Spektralphotometer-Plattenleser, um die Absorption bei 495 nm zu messen.
  2. Führen Sie den Färbeassay der intrazellulären Lipidtröpfchen und des Kerns durch.
    1. Plattenzellen in schwarzen unteren 96-Well-Platten und induzieren adipogene Differenzierung, wie in Schritt 5.3 beschrieben.
    2. Um die Zellen zu färben, fügen Sie 200 μL der Färbelösung, die eine fluoreszierende Lipidfärbung und eine fluoreszierende DNA-Färbung (siehe Materialtabelle) enthält, in 1x PBS pro Vertiefung hinzu. Nachdem Sie das Gesamtvolumen der erforderlichen Färbung berechnet haben, fügen Sie zwei Tropfen der DNA-Färbung und 25 μL der Lipidfärbung pro ml vorgewärmtem 1x PBS hinzu, wobei Sie ein folienumwickeltes Röhrchen verwenden, um die Lösung vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie bei RT für 20 Minuten und schützen Sie sich vor Licht.
    3. Lesen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzplattenleser ab (siehe Materialtabelle). Nachweis der Lipidfärbung (Anregung: 485 nm/Emission: 572 nm) mit einem Rotfilter und der DNA-Färbung (Anregung: 359 nm/Emission: 450 nm) durch einen Blau-/Cyanfilter.
      HINWEIS: Färbungen können auch visualisiert und Bilder unter einem fluoreszierenden Mikroskop aufgenommen werden.
    4. Normalisieren Sie die Lipidfleckenintensitäten auf die DNA-Färbungsintensitäten, um die Lipidakkumulation relativ zur Zellzahl13 zu quantifizieren.

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Ergebnisse

Primäre Präadipozyten sind morphologisch ähnlich wie Fibroblasten, mit unregelmäßigen, sternförmigen Formen und einem zentralen Kern (Abbildung 2A-C). Die Zellen haften leicht an Gewebekulturplastik und beginnen sich bald nach der Anheftung zu vermehren. Sie differenzieren und akkumulieren schnell Lipidtröpfchen (Abbildung 3D), wenn sie mit Fettsäuren in den Medien versorgt werden. Die Lebensfähigkeit (98%, basierend auf dem Far...

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Diskussion

Obwohl mehrere gut beschriebene Protokolle über die Isolierung von Präadipozyten14,15,16,17 berichtet haben, wurde die Isolierung für embryonale Präadipozyten optimiert, die für funktionelle Analysen des Fettwachstums und der Entwicklung im frühen Leben bei Masthähnchenküken verwendet werden kann. Dieses Protokoll liefert embryonale Adipozyten-Vorläufer mit hoher Lebensfähigkeit und hohem Diffe...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken UT AgResearch und dem Department of Animal Science für die Unterstützung und Optimierung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch USDA-Zuschuss finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL PipetteEppendorfZ683825Einkanalpipette, 100 - 1000 & Mikro; L
1 mL PipettenspitzeFisher Scientific02-707-402
100 % IsopropanolFisher ScientificA426P4
1x PBSGibco10010023
25 mL KolbenPyrex4980-25
37 % FormaldehydFisher ScientificF75P-1GAL
6-Well-PlatteFalcon353046Mit Gewebekulturen behandelte
96-Well-Assay-PlatteCostar3632
96-Well-Platte, schwarzer BodenCostar3603Mit Gewebekulturen behandeltes
AdipoRedLonzaPT-7009
Amphotericin BGibco15290026
Tischwischer (Kimtechwiper)Kimberly-Clark34155
BetadineAuf & UpNDC 116730033420% Arbeitslösung
Cell CounterCorning6749
Zellsieb, 40 & Mikro; mSPL93040
ZentrifugatonEppendorf5702
HühnerserumGibco16110082
konische Zentrifugenröhrchen, 15 mLVWR10025-690
konische Zentrifugenröhrchen, 50 mLFalcon352098
KryoröhrchenNunc343958
gebogene Pinzette, 100 mmRoboz SurgicalRS-5137
Gebogene chirurgische Schere, 115 mmRoboz SurgicalRS-6839
Destilliertes WasserMilliporeSYNSV0000nach Bedarf ausgegeben
DMEM/F12HyCloneSH30023.01
DMSOSigmaD2650
EthanolDecon Labs270170% Arbeitslösung
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco10437028
FluoreszenzmikroskopEVOSM7000
FluoreszenzplattenleserBiotekSynergy H1
FolieReynoldsReynolds Wrap Hochleistungs-Aluminiumfolie, 125 SQ. FT.
GefrierbehälterThermo Scientific5100-0001
GelatineMillipore40552%ige Arbeitslösung
Hämatozytometer (Zählkammer)Corning4802000,1 mm
tiefer InkubatorFisher Scientific6845
InstrumentensterilisatorVWRB1205
Linolsäure-Ölsäure Säure-AlbuminSigmaL96551x
ArbeitslösungsmikroskopEvosAMEX1000
MehrkanalpipetteThermo Scientific466107012-Kanal Pipetten, 30 - 300 & Mikro; L
Na2HPO4SigmaS-7907
NaH2PO4SigmaS-3139
NucBlueInvitrogenR37605
Öl Rot OSigmaO-0625
OrbitalschüttlerIKAKS130BS1
PapierhandtuchTorkRK8002
ParafilmParafilm MPM996
Penicillin/Steptomycin (P/S)Gibco151401221x Arbeitslösung
Petrischale, 100 mmFalcon351029
Petrischale, 60 mmFalcon351007
PlattenschüttlerVWR200
RBC LysepufferRoche11814389001
Reagent ReserviorVWR89094-680
Kleines Becherglas, 100 mLPyrex1000-100
Spektralphotometer PlattenleserBiotekSynergy H1
Sterile GazeMcKesson762703
gerade Pinzette, 120 mmRoboz SurgicalRS-4960
Gerade Schere, 140 mmRoboz SurgicalRS-6762
T-25 KolbenCorning430639Gewebekulturen behandelter
Gewebekultur-InkubatorThermo Scientific50144906
Gewebesieb, 250 & Mikro; mPierce87791
Trypan Blue StainGibco15250061
TrypsinGibco154000540,1 % Arbeitslösung
Pinzette, 110 mmRoboz SurgicalRS-5035
Typ 1 KollagenaseGibco17100017
WasserbadFisher Scientific15-462-10
Whatman Filterpapier der Güteklasse 1Whatman1001-110
mit

Referenzen

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