Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.
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Methodenartikel
Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die transiente Genexpressionsmodulation in der murinen Skelettmuskulatur durch Plasmidelektroporation ist ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung der normalen und pathologischen Physiologie. Die Überexpression oder der Knockdown von Zielgenen ermöglicht es den Forschern, einzelne molekulare Ereignisse zu manipulieren und so die Mechanismen, die sich auf die Muskelmasse, den Muskelstoffwechsel und die Kontraktilität auswirken, besser zu verstehen. Darüber hinaus ermöglicht die Elektroporation von DNA-Plasmiden, die für fluoreszierende Tags kodieren, den Forschern, Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen in der Skelettmuskulatur in vivo zu messen. Eine wichtige funktionelle Beurteilung der Skelettmuskulatur umfasst die Messung der Muskelkontraktilität. In diesem Protokoll zeigen wir, dass nach Plasmid-DNA-Injektion, Elektroporation und Genexpressionsmodulation noch Studien zur Kontraktilität des gesamten Muskels möglich sind. Das Ziel dieses Lehrverfahrens ist es, die Schritt-für-Schritt-Methode der DNA-Plasmid-Elektroporation in die Skelettmuskulatur der Maus zu demonstrieren, um die Aufnahme und Expression in den Myofasern der Musculus tibialis anterior und extensor digitorum longus zu erleichtern und zu zeigen, dass die Kontraktilität der Skelettmuskulatur nicht durch Injektion und Elektroporation beeinträchtigt wird.
Einleitung
Die Plasmid-DNA-Elektroporation in die Skelettmuskulatur in vivo ist ein wichtiges Instrument zur Beurteilung von Veränderungen in der Skelettmuskelphysiologie und molekularen Signalgebung durch Modulation der Genexpression unter einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Der experimentelle Gentransfer in die Sk....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden am Penn State College of Medicine durchgeführt, vom Institutional Animal Care and Use Committee der Penn State University genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen festgelegt wurden. Für dieses Verfahren wurden 12 Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse verwendet. Alle chirurgischen Werkzeuge wurden vor dem Experimentieren auf Sterilität autoklaviert.
1. TA- und EDL-Injektions-/Elektroporationsvorbereitung
HINWEIS: Diese Schritte sind für die TA- und EDL-Injektions- / Ele....
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Ergebnisse
Elektroporation zur Erleichterung des Gentransfers in der Skelettmuskulatur ist eine nützliche Technik, um Veränderungen in der Muskelphysiologie zu bewerten. Wir haben ein detailliertes, schrittweises Verfahren demonstriert, um einen effizienten Gentransfer sowohl in den TA- als auch in den EDL-Muskeln zu erreichen. Unterschiede in der Transfektionseffizienz treten aufgrund einer Reihe von Variablen auf. Zu diesen Variablen gehören Elektroporationsparameter (Impulse, Spannung, Pulsdauer usw.), die Größe des Genkonstrukt.......
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Diskussion
Der In-vivo-Gentransfer in der Skelettmuskulatur, der durch Elektroporation verstärkt wird, ist ein nützliches und relativ einfaches Werkzeug zur Modulation der Proteinexpression im Muskel. Wir haben die Schritte gezeigt, die erforderlich sind, um einen effizienten Gentransfer in den EDL- und TA-Muskeln zu erreichen, und gezeigt, dass die Kontraktilitätsmessung der EDL nach dem Verfahren praktikabel ist. Diese Technik erfordert keine komplizierteren viralen Vektoren und ermöglicht den Vergleich von transfizierte.......
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Offenlegungen
B.A.H. und D.L.W machen keine Interessenkonflikte geltend.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4-0 Nylon-Naht (nicht resorbierbar) | Ethicon | 662G | Naht zum Schließen des Hautschnitts |
| 50µ l Hamilton Spritze | Hamilton | 80501 | Mikrospritze |
| C57BLl/6NHsd Mäuse | Envigo | 044 | 12 Wochen alte weibliche Mäuse für Experimente |
| Messschieberelektrode | BTX | 45-0102 | 1,0 cm x 1,0 cm Edelstahl |
| Dynamische Muskelkontrolle Datenerfassung/-analyse | Aurora Scientific | 605A | Software zur Messung und Analyse der Muskelkontraktilität |
| ECM 830 Elektroporationssystem | BTX | 45-0662 | Elektroporator |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid-Aufreinigungsset |
| Extra schmale Schere | Fine Science Tools | 14088-10 | Schere für stumpfe Dissektion |
| Kraftaufnehmer | Aurora Scientific | 407A | Zur Messung der Kraft von |
| EDL Micro-Masquito Hämastaten | Fine Science Tools | 13010-12 | Hämastate zum Surturing von |
| pcDNA3.1 Säugetier-Expressionsvektor | Fisher Scientific | V79020 | Kontrollvektor |
| pcDNA3-EGFP-Expressionsplasmid | Addgene | 13031 | Plasmid für die GFP-Expression |
| Semken gebogene Pinzette | Fine Science Tools | 11009-13 | Pinzette für die |
| Chirurgie Chirurgische Klingen Edelstahl Nr. 10 | Becton Dickinson | 37 1210 | Skalpellklingen |
| Tissue-Tek O.C.T. Medien | VWR | 25608-930 | Gefriermedien für die Histologie |
| Weizenkeime Agglutinin - Texas Red | Thermo-Fisher Scientific | W21405 | Membranfärbung für Muskelquerschnitt |
Referenzen
- Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
- Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve.
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Nachdrucke und Genehmigungen
