Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Zusammenfassung

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Zusammenfassung

Filamentöse Pilze sind erfolgreiche Bewohner des Bodens und spielen eine wichtige Rolle in Bodenökosystemen, etwa beim Abbau organischer und anorganischer Stoffe, sowie bei der Regulierung des Nährstoffgehalts. Dort finden sie auch zahlreiche Möglichkeiten, mit einer Vielzahl anderer Mikroben wie Bakterien oder anderen Pilzen zu interagieren. Die Untersuchung von Pilzinteraktionen auf zellulärer Ebene kann jedoch aufgrund der Black-Box-ähnlichen Natur des Bodens eine Herausforderung darstellen. Neue mikrofluidische Werkzeuge werden für die Untersuchung von Pilzinteraktionen entwickelt; Zwei Plattformen zur Untersuchung von bakteriell-pilzlichen und Pilz-Pilz-Interaktionen werden hervorgehoben. Innerhalb dieser Mikrokanäle können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen in kontrollierten physikalisch-chemischen Umgebungen mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung als bisher beobachtet werden. Die Anwendung dieser Werkzeuge hat zahlreiche neue biologische Erkenntnisse hervorgebracht, wie z.B. die Beobachtung der bakteriellen polaren Bindung an Hyphen oder die Aufdeckung uncharakterisierter Pilz-Pilz-Antagonismen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methoden ist die einfache Verwendung dieses Tools durch Nicht-Experten, was zu hochgradig übersetzbaren Technologien für den Einsatz in mikrobiologischen Labors führt.

Einleitung

Der Boden ist eine außergewöhnlich vielfältige Umgebung, die eine Fülle von Mikroorganismen enthält, die für Kohlenstoff- und Phosphorzyklen von entscheidender Bedeutung sind ^1,2. Filamentöse Pilze sind ein wichtiger Bestandteil zahlreicher Ökosysteme als Zersetzer von organischer und anorganischer Substanz und können die Ernährung von Pflanzen durch die Bildung symbiotischer Beziehungen^{verbessern 3,4}. Im Boden interagieren Pilze dynamisch mit einer Vielzahl von Mikroben wie anderen Pilzen⁵, Bakterien 6^, Viren⁷ und Nematoden⁸. Diese Wechselwirkungen haben erhebliche Folgen für die Boden- und Pflanzengesundheit. Aufgrund des Mangels an geeigneten experimentellen Systemen, die in der Lage sind, interagierende Mikroorganismen mit hoher Auflösung abzubilden, bleiben viele jedoch undefiniert.

Untersuchungen zu bakteriell-pilzlichen Interaktionen (BFIs) und Pilz-Pilz-Interaktionen (FFIs) haben wertvolle Anwendungen in einer Reihe von Bereichen, darunter antimikrobielle Mittel in der Medizin und biologische Bekämpfungsmittel in der Landwirtschaft. Zum Beispiel produziert der Pilz Coprinopsis cinerea das Peptid Copsin, das nachweislich eine antibakterielle Aktivität gegen den menschlichen Erreger Listeria monocytogenes⁹ aufweist. Ebenso wird die pilzliche Verbindung Griseofulvin häufig zur Behandlung von menschlichen Pilzinfektionen eingesetzt und ist zusätzlich in der Lage, das Wachstum des pflanzenpathogenen Pilzes Alternaria solani^10,11 zu hemmen. Mehrere Stämme des bodenbewohnenden Bakteriums Bacillus subtilis haben sich ebenfalls als wirksame Biokontrollmittel des pilzlichen Pflanzenpathogens Rhizoctonia solani^12,13 erwiesen. Aufgrund von Einschränkungen, die mit traditionellen Methoden verbunden sind, werden BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen jedoch nur unzureichend verstanden.

Konventionelle Studien untersuchen typischerweise BFIs und FFIs auf der Makroskala unter Verwendung von Agarplatten mit zwei oder mehr Arten in Konfrontation. Ihre Wechselwirkung wird durch Messung der Wachstumsraten und der Metabolitenproduktion der konfrontierenden Spezies^14,15,16 bewertet; Diese Methodik wird jedoch nur auf Kolonieebene gelöst. Um Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu untersuchen, können bakterielle und pilzliche Impfmittel auf mit Agar beschichteten Glasmikroskopobjektträgern kultiviert werden, die dann unter einem Mikroskop^{abgebildet werden 17}. Dennoch kann es schwierig sein, einem einzelnen Hypha mit Objektträgern zu folgen, da es an Enge mangelt, was bedeutet, dass Zeitrafferbilder schwieriger zu erhalten sind. Darüber hinaus ist die Möglichkeit, andere Mikroorganismen räumlich in definierten Regionen des Pilzmyzels einzuschließen oder definierte chemische Umgebungen zu schaffen, die beispielsweise gestört werden können, in solchen Aufbauten nicht möglich. Die "Black Box" -Natur des Bodens trägt auch zur Komplexität der Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Interaktionen auf der Ebene einzelner Zellen^{bei 18}. Durch die Beobachtung interagierender Arten abseits der unglaublichen Vielfalt des Bodenmikrobioms kann die genaue Art und Weise, wie einzelne Mitglieder interagieren, beurteilt werden. Daher besteht weiterhin Bedarf an vielseitigen Plattformen, die eine hochauflösende Einzelzellbildgebung von BFIs und FFIs ermöglichen.

Mikrofluidische Technologien, sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, bieten eine ideale Plattform für die Untersuchung von BFIs und FFIs auf der Ebene einzelner Zellen. Der Bereich der Mikrofluidik, der aus Technologien stammt, die für die chemische Analyse und Mikroelektronik entwickelt wurden, wurde von den Biowissenschaften^{übernommen 19}. Mikrofluidische Technologien regulieren kleine Mengen von Flüssigkeiten innerhalb eines maßgeschneiderten Netzwerks miniaturisierter Kanäle, die mindestens eine Dimension auf der Mikrometerskala haben, und ihre Verwendung in der biologischen Forschung nimmt zu²⁰. Insbesondere wurden mikrofluidische Geräte entwickelt, um das Wachstum von fadenförmigen Pilzen 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 zu untersuchen. Ein Vorteil der Verwendung dieser Technologie besteht darin, dass der Einschluss von Hyphen und die Verteilung von Nährstoffen innerhalb von Mikrokanälen der Struktur der Bodenumgebung ähnlicher ist als herkömmliche Agarmethoden³¹. In jüngster Zeit wurden mikrofluidische Plattformen verwendet, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Neutrophilen und pilzlichen Krankheitserregern 32, Bakterien und Pflanzenwurzeln³³ sowie Pilzen und Nematoden^34,35 zu untersuchen.

Einer der vielen Vorteile der Verwendung von Mikrofluidik zur Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen ist die spezifische Steuerung der Mikrokanalumgebung. Zum Beispiel können laminare Strömungsregime genutzt werden, um definierte Konzentrationsgradienten zu erzeugen, was besonders bei der Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis³⁶ nützlich ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass die transparente Natur von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS), einem kostengünstigen, biokompatiblen Elastomerpolymer, das üblicherweise bei der Herstellung von mikrofluidischen Bauelementen verwendet wird, die hochauflösende Bildgebung einzelner Zellen mittels Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie^{ermöglicht 37}. Ebenso bedeutet der Einschluss von Mikroben in Mikrokanälen, dass Zeitrafferexperimente, die einzelne Zellen verfolgen, durchgeführt werden können, so dass einzelne zelluläre Reaktionen aufgezeichnet und quantifiziert werden^{können 37}. Da mikrofluidische Geräte benutzerfreundlich gestaltet werden können, können sie von Nicht-Experten leicht eingesetzt werden³⁸.

Die Förderung des Wissens über die Wechselwirkungen zwischen bodenbewohnenden Mikroorganismen ist wichtig, um nachhaltige Ökosystembewirtschaftungspraktiken zu verbessern, die die biologische Vielfalt erhalten und die Auswirkungen des Klimawandels auf die terrestrische Umwelt mildern³⁹. Daher ist die Entwicklung neuartiger mikrofluidischer Werkzeuge von grundlegender Bedeutung, um das Verständnis von Pilzen und ihren Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene zu erweitern. Das Protokoll konzentriert sich hier auf zwei mikrofluidische Geräte, die für die Untersuchung der BFIs⁴⁰ und FFIs⁴¹ hergestellt wurden, wie in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Visuelle und schematische Darstellung der Geräte für die bakterielle-pilzische Interaktion (BFI) und die Pilz-Pilz-Interaktion (FFI). (A) Bild des BFI-Geräts. Ein Myzelstopfen wird am Eingang zu einem Ende der Mikrokanäle platziert, um das Wachstum der Hyphen in das Gerät zu ermöglichen. Der bakterielle Einlass befindet sich am gegenüberliegenden Ende. Maßstabsleiste = 5 mm. (B) Schematische Übersicht des BFI-Geräts, das die Positionierung der bakteriellen Einlässe und die Richtung des Hyphenwachstums durch die Interaktionsmikrokanäle darstellt. Die Kanäle sind 10 μm tief, 100 μm breit und 7 mm lang, mit insgesamt 28 Beobachtungskanälen. (C) Konfrontationstest auf Agarplatte zwischen Coprinopsis cinerea und Bacillus subtilis NCIB 3610, Skalenstab = 20 mm (links). Mikroskopische Aufnahmen, die die Wechselwirkung zwischen C. cinerea und B. subtilis NCIB 3610 innerhalb des Mikrokanals (Mitte und rechts) zeigen, d.h. die polare Anheftung von Bakterien an Pilzhyphen. Skalenbalken = 25 μm (Mitte) und 10 μm (rechts). (D) Abbildung des FFI-Geräts, das an eine Petrischale mit Glasboden gebunden ist, die mit Myzelstopfen doppelt beimpft ist. Maßstabsleiste = 1 cm. (E) Schematische Übersicht des FFI-Geräts. Zwei Pilzimpfstopfen werden an beiden Enden des Geräts in die Einlässe eingeführt, was eine hyphalische Exploration der Mikrokanäle ermöglicht. Die Steuerkanäle sind nur mit einem Pilzeinlass verbunden und haben einen Sackgassenkanal, der Wechselwirkungen zwischen den Testpilzen verhindert. Interaktionskanäle verbinden beide Pilzeinlässe und ermöglichen hyphalische Interaktionen zwischen den Probanden innerhalb des Mikrokanals. Jeder Interaktionskanal besteht aus 18 rautenförmigen Abschnitten, die eine Gesamtlänge von 8,8 mm (490 x 430 μm pro Diamant), 10 μm tief und einen Verbindungsbereich zwischen jedem Diamanten von 20 μm messen. Kanaltypen werden dupliziert, Maßstabsbalken = 1 mm. (F) Interaktionszone zwischen zwei sich nähernden Hyphenfronten, die von gegenüberliegenden Enden des miteinander verbundenen Interaktionskanals wächst. Phasenkontrastmikroskopie-Bild, Maßstabsbalken = 250 μm. Die Paneele in dieser Abbildung wurden von Stanley et al., 2014 (A-C)⁴⁰ und Gimeno et al., 2021 (D-F)⁴¹ modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protokoll

HINWEIS: Eine Zusammenfassung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 2 visuell dargestellt.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der vorgestellten Methodik, bestehend aus fünf Hauptabschnitten, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind. Gerätedesigns werden mit CAD-Software (Computer Aided Design) und einer mit Photolithographie hergestellten Masterform erstellt (1). Dies wird verwendet, um Poly (Dimethylsiloxan) (PDMS) zu gießen, das dann in Platten gewürfelt und mit Glasboden-Petrischalen verbunden wird, um die mikrofluidischen Geräte zu bilden (2). Mikroben, die in die Studie einbezogen werden sollen, werden kultiviert (3) und zur Impfung der Geräte verwendet (4). Wechselwirkungen werden mittels Mikroskopie untersucht und mittels Bildanalysetechniken quantifiziert (5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

1. Meisterformenbau

1. Fotomasken-Produktion
   1. Generieren Sie mikrofluidische Gerätedesigns mit CAD-Software (Computer Aided Design). Die Abmessungen der vorgestellten Geräte sind in Abbildung 1 dargestellt und weitere Details zu den spezifischen Konstruktionsmerkmalen sind in den jeweiligen Publikationen^40,41 umfassend aufgeführt.
   2. Exportieren Sie die CAD-Konstruktionsdatei in einem geeigneten Format (z. B. .dwg, .dxf). Drucken Sie eine Filmfotolithographiemaske, indem Sie die exportierte CAD-Konstruktionsdatei zum Drucken an einen kommerziellen Anbieter senden.
2. Fotolithografie
   HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer staubfreien und lichtkontrollierten Umgebung durchgeführt werden, z. B. in einer Laminar-Flow-Haube oder einer Reinraumanlage. Die hier bereitgestellten Versuchsbedingungen dienen als Richtschnur und sollten im eigenen Haus optimiert werden. Die Autoren empfehlen, eine spezifische Schulung zu suchen und die etablierten Protokolle⁴² zu konsultieren.
   1. Bereiten Sie einen 100 mm Siliziumwafer vor, indem Sie ihn 2 h lang in einem Ofen bei 200 °C backen. Beschichten Sie den Siliziumwafer mit dem Fotolack SU-8 2010 mit einer Zieldicke von 10 μm unter folgenden Bedingungen: 500 U/min für 10 s (Beschleunigung 100 U/min/s) und 3.000 U/min für 45 s (Beschleunigung 300 U/min/s).
      ACHTUNG: SU-8 Fotolack ist gefährlich, seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und verhindern Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut. Es ist brennbar, potenziell krebserregend und giftig für die Umwelt.
   2. Den beschichteten Siliziumwafer bei 95 °C für 2,5 min backen (weich backen). Setzen Sie den Fotolack ultraviolettem (UV) Licht aus, indem Sie die Filmfotolithographiemaske und eine Energiedosis von 140 mJ/cm² bei einer Wellenlänge von 365 nm mit einem Masken-Aligner verwenden.
   3. Backen Sie den beschichteten Siliziumwafer bei 95 °C für 3,5 min (Backen nach der Belichtung). Tauchen und rühren Sie den Siliziumwafer 3 Minuten lang in die Entwicklerlösung, um die mikrofabrizierten Strukturen zu enthüllen, indem Sie den unbelichteten Fotolack entfernen.
      ACHTUNG: Die Entwicklerlösung kann brennbar sein, treffen Sie entsprechende Vorkehrungen bei der Handhabung und Lagerung.
   4. Spülen Sie mit einer frischen Entwicklerlösung für 10 s. Mit Isopropylalkohol 10 s abspülen und an der Luft trocknen. Verwenden Sie gefilterte Druckluft, um sicherzustellen, dass die Strukturen gründlich trocken sind. Messen Sie beispielsweise die Höhe der SU-8-Strukturen mit einem Profilometer.
   5. Silanisieren Sie jede Masterform mit 50 μL Chlortrimethylsilan, indem Sie einen Vakuumdruck von 50 mbar für 2 h anlegen. Die Autoren stellen fest, dass eine Resilanisierung der Masterform nicht für notwendig befunden wurde.
      ACHTUNG: Chlortrimethylsilan ist ein gefährlicher Stoff. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und behandeln Sie sie mit Vorsicht. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und verhindern Sie das Einatmen. Von Zündquellen fernhalten und in einem gut belüfteten Bereich verwenden.

2. Geräteherstellung

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer staubfreien Umgebung, z. B. einer Laminar-Flow-Haube, durchgeführt werden.

1. Herstellung von Poly(dimethylsiloxan)- (PDMS)-Brammen
   1. Bereiten Sie ca. 40 g PDMS vor, indem Sie die Basis und das Härter im Verhältnis 10:1 mit einem Spatel in einem sauberen Plastikbecher gründlich mischen. Entgasen Sie das Gemisch, um alle Luftblasen zu entfernen, indem Sie den Plastikbecher mit dem PDMS für 1 h in eine Vakuumkammer (Vakuumdruck = 50 mbar) geben.
   2. Befestigen Sie die Master-Form mit durchsichtigem Klebeband in einer Kunststoffhalterung. Reinigen Sie mit komprimierter gefilterter Luft, um Staubpartikel zu entfernen.
      HINWEIS: Alternativ kann Aluminiumfolie um eine Glas-Petrischale herum geformt und dann verwendet werden, um die Master-Form unterzubringen und das PDMS⁴³ zu enthalten.
   3. Gießen Sie die PDMS-Mischung auf die Mitte der Masterform, stellen Sie sicher, dass sie sich auf einer ebenen Oberfläche befindet, und lassen Sie sie absetzen.
      HINWEIS: Die PDMS-Mischung sollte so nah wie möglich an die Oberfläche der Masterform gegossen und ein kontinuierlicher Durchfluss aufrechterhalten werden, um die Einführung von Luftblasen zu minimieren. Luftblasen können entfernt werden, indem Druckluft über die Blase geleitet oder mit einer feinen Nadel herausgeschöpft wird.
   4. Decken Sie die Masterform locker mit einem Kunststoffdeckel ab, um zu verhindern, dass sich Staubpartikel auf der Oberfläche des PDMS absetzen. Die Masterform in einen Ofen geben und über Nacht bei 70 °C aushärten.
   5. Entfernen Sie die Master-Form aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Ziehen Sie das ausgehärtete PDMS von der Masterform und dem Kunststoffrahmen weg und achten Sie darauf, dass die Masterform / das PDMS nicht beschädigt werden.
   6. Legen Sie durchsichtiges Klebeband über die in das PDMS geprägten Mikrokanäle, um eine staubfreie Oberfläche zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Band vor dem Kleben entfernt wird.
   7. Schneiden Sie das PDMS in Brammen (d. h. wenn mehrere Geräte im Design der Master-Form enthalten sind, können viele aus einem einzigen Gussteil hergestellt werden), wie vom Design mit einer montierten Guillotine oder Rasierklinge vorgesehen. Achten Sie beim Schneiden der seitlichen Öffnung der BFI-PDMS-Platte darauf, dass die Mikrokanäle vollständig geöffnet sind (Abbildung 1A). Stellen Sie bei der FFI PDMS-Platte sicher, dass jede Ecke so beschnitten ist, dass sie in die Petrischale mit Glasboden in Abbildung 1D passt.
   8. Stanzen Sie gewünschte Einlass- / Auslasslöcher entsprechend dem Gerätedesign. Verwenden Sie einen Präzisionsschneider, um Einlasslöcher von 3,18 mm bzw. 4,75 mm für die beispielhaften BFI- bzw. FFI-Geräte zu stanzen.
2. Verklebung von PDMS-Brammen zur Herstellung von Bauelementen
   HINWEIS: Bei den folgenden Waschschritten (2.2.1-2.2.2) wird ein Ultraschallreiniger verwendet, der mit gereinigtem Wasser (ddH₂O) bei 37 kHz gefüllt ist. Das Waschen der PDMS-Platten trägt dazu bei, die erfolgreiche Verklebung⁴⁴ zu verbessern und das Risiko einer Kontamination zu verringern. Um die PDMS-Platten zu manipulieren, verwenden Sie saubere Pinzetten und heben Sie sie mit den Einlasslöchern an, um Schäden an den Mikrokanälen oder der Geräteoberfläche zu vermeiden.
   1. Tauchen Sie die PDMS-Platten in 0,5 M NaOH ein und beschallen Sie für 5 min. Mit sterilem ddH₂O abspülen. PDMS-Platten in 70%ige Ethanollösung geben und 5 min beschallen. Mit sterilem ddH₂0 abspülen.
   2. PDMS-Platten in sterile ddH₂O tauchen und 5 min beschallen. Entfernen Sie die PDMS-Platten aus der sterilen ddH₂O, trocknen Sie sie mit gefilterter Druckluft und legen Sie sie in eine sterile quadratische Petrischale.
   3. Stellen Sie die quadratische Petrischale mit den PDMS-Platten für 1 Stunde zum Trocknen in einen Ofen bei 70 °C. Aus dem Ofen nehmen und in staubfreier Umgebung abkühlen lassen. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche der PDMS-Brammen mit Klebeband und/oder gefilterter Druckluft.
   4. Aktivieren Sie die Oberflächen der zu verklebenden PDMS-Platten und Petrischalen mit Glasboden mit einem Plasmareiniger mit folgenden Einstellungen: Vakuumdruck 0,75 mbar, Leistung 50%, Beschichtungszeit 1 min. Legen Sie die zu aktivierenden (und anschließend zu verklebenden) Oberflächen nach oben in den Plasmareiniger.
   5. Entfernen Sie die PDMS-Platten und die Petrischalen mit Glasboden aus dem Plasmareiniger und verbinden Sie sie, indem Sie die aktivierten Oberflächen vorsichtig in konformen Kontakt miteinander bringen. Verkleben Sie die BFI- und FFI-PDMS-Platten mit den Glasboden-Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm bzw. 50 mm (Glasstärke 0,17 mm).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, beim Kleben nicht zu viel Druck auszuüben, da dies zum Kollaps der Mikrokanäle führen kann.
   6. Überprüfen Sie die erfolgreiche Verklebung, indem Sie einfach versuchen, die PDMS-Platte mit einer Pinzette von der Petrischale mit Glasboden zu ziehen. Visualisieren Sie die Geräte mit dem Auge oder mit generischer Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Impfeinlässe oder Mikrokanäle nicht kollabieren.
      HINWEIS: Für gesättigte Bedingungen (d. h. wassergesättigte und/oder nährstoffreiche Bedingungen) schließen Sie Schritt 2.2.7 des Protokolls ein. Wenn wasserungesättigte Bedingungen erforderlich sind, fahren Sie mit Schritt 2.2.8 fort. Geräte können mit Wasser oder Medien befüllt werden.
   7. Füllen Sie die Geräte unmittelbar nach dem Verkleben, indem Sie 100 μL der gewünschten Lösung für das BFI-Gerät (bakterieller Einlass und seitliche Öffnung) oder 30 μL Medien in jeden Einlass (60 μL insgesamt) für das FFI-Gerät pipettieren. Wenn Luftblasen vorhanden sind, lösen sich diese etwa 10 Minuten nach dem Befüllen auf, da PDMS porös ist.
   8. Fügen Sie steriles ddH₂O (~ 100-200 μL) in die Petrischale hinzu, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

3. Mikrobielle Kultur

HINWEIS: Die folgenden Schritte bieten ein allgemeines mikrobiologisches Verfahren für die Pilz- und Bakterienkultur und sollten unter sterilen Bedingungen (d. H. Unter Verwendung einer Flamme oder einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank) durchgeführt werden, die für den für die gewünschten Mikroben erforderlichen Sicherheitsgrad geeignet sind. Spezifische Beispiele werden am Ende jedes Abschnitts für eine Art von Interesse gegeben.

1. Pilzkultur
   1. Bereiten Sie das gewünschte Kulturmedium mit Agar ergänzt vor. Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min. Lassen Sie das Medium auf 50 ° C abkühlen und gießen Sie es in Petrischalen mit einem Durchmesser von 9 cm, wobei die sterilen Bedingungen erhalten bleiben.
   2. Verwenden Sie einen Korkbohrer, um einen Agarstopfen mit 4 mm Durchmesser, der Myzel enthält, aus einer Kühlcontainerkolonie des gewünschten Pilzstamms zu entfernen, um das Isolat zu aktivieren. Dies wird durchgeführt, um ein standardisiertes und kräftiges Wachstum des Pilzes vor der Impfung des Geräts zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die Mikroben können auch aus einem Glycerinbestand aktiviert werden, d. H. Pilzisolate, die auf Agarstopfen in 50% iger Glycerinlösung bei -70 ° C⁴¹ gespeichert sind.
   3. Platzieren Sie die Seite des Steckers mit Myzel in Kontakt mit der Agaroberfläche in der Mitte der ungeimpften Petrischale. Ersetzen Sie den Deckel auf der Oberseite der Petrischale und verschließen Sie, bevor Sie bei der für die gewünschte Belastung geeigneten Temperatur für die erforderliche Zeit, typischerweise etwa 3 bis 4 Tage, inkubieren.
      HINWEIS: Beispiel für Kulturbedingungen für Trichoderma rossicum: Malzextraktagar, 48 h bei 25 °C im Dunkeln inkubiert.
2. Bakterienkultur
   1. Streichen Sie das gewünschte Bakterienisolat aus dem Quellmaterial (z. B. Glycerinbestand oder einzelne Kolonie aus der Agarplatte) auf eine Agarplatte, um einzelne Bakterienkolonien zu erhalten und sicherzustellen, dass keine Kontamination^{auftritt 45}. Verschließen Sie die Platte mit Folie.
   2. Inkubieren Sie mit einer Temperatur und Dauer, die für das interessierende Isolat spezifisch sind, bis einzelne Kolonien beobachtet werden.
   3. Bereiten Sie die gewünschte Kulturbrühe vor. Zum Beispiel fügen Sie 10 g Trypton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt pro 1 L ddH₂O hinzu, um LB-Medium für die Kultur von B. subtilis vorzubereiten. Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min.
   4. Lassen Sie das Medium auf Raumtemperatur abkühlen. Geben Sie das Medium in einen sterilen Kulturkolben in einer sterilen Umgebung.
   5. Berühren Sie eine einzelne Bakterienkolonie von der Agarplatte mit einer sterilen Impfschleife. Übertragen Sie die geimpfte Schleife in das sterile Kulturmedium, indem Sie die Flüssigkeit kurz mit der Schlaufe berühren.
   6. Verschließen Sie den Kolben mit einem sterilen Deckel oder einer sterilen Folie und legen Sie ihn über Nacht in einen Schüttelinkubator mit den für die ausgewählte Art geeigneten Einstellungen.
      HINWEIS: Beispielkulturbedingungen für B. subtilis: i) Flüssigkultur - aerobes Wachstum bei 37 °C bei 200 U/min in LB-Medium und ii) Plattenkultur - Raumtemperatur auf LB-Agarplatte. Weitere Einzelheiten zur Kultivierung verschiedener Pilzstämme finden Sie in den FFI/BFI-Papieren^40,41.

4. Geräteimpfung

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten in einer Laminar-Flow-Haube mit sterilen Geräten durchgeführt werden.

1. Pilzimpfung
   1. Verwenden Sie einen sterilisierten Korkbohrer (ø = 4 mm), um einen Agarstopfen aus der Kolonie am Rande einer 3 Tage alten Kultur zu entfernen (Schritt 3.1). Stellen Sie sicher, dass die wachsende Hyphenfront intakt bleibt.
   2. Führen Sie den Stecker in den Pilzeinlass ein, Myzel mit der Seite nach unten, wobei die Wachstumsrichtung der Hyphenfront auf die Mikrokanalöffnungen ausgerichtet ist, um die Hypheninfiltration der Kanäle zu fördern.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.2 für die zweite Pilzart (wenn Sie das FFI-Gerät verwenden), und führen Sie den Stecker in den gegenüberliegenden Einlass ein. Wenn Sie das BFI-Gerät verwenden, lassen Sie diesen Schritt aus und fahren Sie mit Schritt 4.1.4 fort.
   4. Die Petrischale mit transparenter Folie versiegeln und bei 25-28 °C im Dunkeln inkubieren, bis die Bildgebung beginnt. Bestimmen Sie die Inkubationszeit vor der Bildgebung in Abhängigkeit von dem beabsichtigten biologischen Ereignis, das beobachtet werden soll, z. B. Pilz-Pilz-Konfrontationen, und der Wachstumsrate der im Gerät enthaltenen Arten.
2. Bakterielle Impfung
   1. Die Bakterien aus einer Übernachtkultur (Schritt 3.2) werden im Verhältnis 1:25 mit demselben Kulturmedium wie in Schritt 3.2.3 beschrieben verdünnt. Kultur für 3 h bei 37 °C.
   2. Waschen Sie die Bakterien durch Pelletieren der Kultur mit einer Zentrifuge bei 2000 x g für 10 min. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen im gewünschten Volumen von 0,9% w / v Natriumchloridlösung.
   3. Zentrifen Sie erneut, um ein Pellet zu erhalten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in flüssigem Medium (z. B . C. cinerea minimales Medium bis zu einem OD₆₀₀ von 1). Optimieren Sie den OD_600-Wert für den betreffenden Bakterienstamm.
   4. Entfernen Sie das BFI-Gerät aus dem Inkubator und öffnen Sie es in einer sterilen Umgebung. Pipette 10 μL Suspension in den bakteriellen Einlass.
      HINWEIS: Optimieren Sie die genauen Impfzeiten für die betreffenden bakteriell-pilzlichen Interaktionen. Führen Sie beispielsweise Bakterien 18 h nach der Pilzimpfung in das BFI-Gerät ein, wenn Sie C. cinerea verwenden.
   5. Die Petrischale mit einer transparenten Folie versiegeln und bei 25 °C im Dunkeln inkubieren, bis die Bildgebung beginnt. Bewahren Sie das Gerät aufrecht auf.

5. Mikroskopie und Bildanalyse

1. Mikroskopie
   HINWEIS: Der Forscher sollte die geeignete Bildgebungsmethode auswählen, die mit der Art des durchzuführenden Experiments übereinstimmt, z. B. eine invertierte Weitfeldepifluoreszenz oder konfokale Mikroskopie. Hier wurde ein allgemeiner Überblick gegeben, da spezifische Details von den Attributen des gewählten Mikroskopie-Setups abhängen.
   1. Schalten Sie den Mikroskopcomputer, den Hauptkörper des Mikroskops (falls zutreffend), die Kamera, den temperaturgesteuerten Inkubator und die Lichtquelle(n) ein. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop richtig eingestellt wurde, z. B. wurde die Köhler-Beleuchtung für eine gleichmäßige Beleuchtung der Probe korrekt angewendet. Initiieren Sie das Imaging-Softwarepaket.
      HINWEIS: Bei der Verwendung eines temperaturgesteuerten Inkubators ist es wichtig, die Mikroskoptemperatur mehrere Stunden lang ausgleichen zu lassen, bevor ein Experiment gestartet wird.
   2. Montieren Sie das mikrofluidische Gerät in den Bühneneinsatz. Stellen Sie sicher, dass das Gerät gut gesichert ist, d. h. mit Band, um ein Verschieben des Geräts während der aktiven Bühnenbewegung zu verhindern.
   3. Erfassen Sie Bilder der geimpften Geräte, z. B. entweder Einzelpunkt- oder Zeitrafferexperimente. Umfassende Bildgebungsspezifikationen, die für die mit den BFI- und FFI-Geräten durchgeführten Experimente relevant sind, finden Sie in den jeweils vorgenannten Publikationen^40,41.
      HINWEIS: Hellfeldbilder wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie aufgenommen, um die Hyphenproliferation durch die Wachstumskanäle mit Autofokus-Software und entweder 10-facher Vergrößerung, 0,30 NA (numerische Blende) oder 20-facher Vergrößerung, 0,45 NA-Objektivlinsen zu visualisieren. Die Anregung fluoreszierender Reporterproteine wurde mit einer Hochleistungs-Leuchtdioden-Lichtmaschine mit Wellenlängen erreicht, die für den Fluorophor spezifisch sind.
   4. Exportieren Sie Bilder in ein geeignetes Format für die anschließende Bildverarbeitung. Beispiel: .tiff.
2. Bildanalyse
   HINWEIS: Die Autoren empfehlen Fidschi⁴⁶ als Werkzeug zur Bildanalyse, aber auch andere Softwarepakete sind verfügbar. Im Folgenden finden Sie Beispiele für Bildanalysen, die mit Fidschi aus den vorgestellten BFI- und FFI-Gerätepublikationen durchgeführt wurden. Diese Schritte sind spezifisch für einen Mac und können sich bei Verwendung eines PCs geringfügig unterscheiden.
   1. Messungen der Hyphenwachstumsrate
      HINWEIS: Diese Methode wurde im BFI-Manuskript⁴⁰ verwendet, um die Wachstumsraten einzelner Hyphen zu messen.
      1. Laden Sie Fidschi herunter, installieren Sie es und starten Sie es. Importieren Sie die Bildsequenz aus einem Zeitrafferexperiment, indem Sie Datei > > Bildsequenz importieren auswählen. Suchen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert sind, und wählen Sie Öffnen aus. Wählen Sie im Fenster "Sequenzoptionen" die Option "Einstellungen" und dann "OK".
      2. Wählen Sie in der Hauptsymbolleiste das Symbol "Gerade Linie" aus. Positionieren Sie den Anfang der geraden Linie an der Spitze der wachsenden Hyphenspitze, indem Sie klicken und dann gleichzeitig den Cursor an einen anderen Punkt innerhalb des Fensters ziehen. Es erscheint eine gelbe Linie mit drei Feldern, die den Anfang, die Mitte und das Ende der Linie anzeigen.
      3. Wechseln zum nächsten Frame in der Bildsequenz, indem Sie Strg und > gedrückt halten. Positionieren Sie das Ende der geraden Linie an der Spitze des wachsenden Hyphas, indem Sie die quadratische Box auswählen und an die richtige Position ziehen.
      4. Halten Sie Strg und M gedrückt, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen. Es erscheint ein Ergebnisfenster mit den Messdaten. Definieren Sie die im Ergebnisfenster angezeigten Daten wie folgt: Klicken Sie auf das Fenster Ergebnisse, und wählen Sie dann Ergebnisse > Messungen festlegen aus.
      5. Wechseln Sie zum nächsten Frame in der Bildsequenz, indem Sie die Strg-Taste gedrückt halten und dann >. Positionieren Sie den Anfang der geraden Linie an der Spitze des wachsenden Hyphas, indem Sie die quadratische Box auswählen und an die richtige Position ziehen.
      6. Halten Sie Strg und dann M gedrückt, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen. Es erscheint ein Ergebnisfenster mit den Messdaten.
      7. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1.5-5.2.1.6, bis Sie das Wachstum des Bindestrichs in Pixeln gemessen haben.
      8. Wählen Sie alle Daten im Ergebnisfenster aus. Kopieren und Einfügen in ein anderes Softwareprogramm, z. B. eine Tabellenkalkulation, um die Daten zu verarbeiten. Zeichnen Sie das Hyphenwachstum (in Pixeln oder Mikrometern) als Funktion der Zeit auf und berechnen Sie die durchschnittlichen Wachstumsraten. Führen Sie mindestens drei biologische Replikationen pro Experiment durch.
   2. Fluoreszenzintensitätsmessungen
      ANMERKUNG: Diese Methode wurde in der FFI-Publikation⁴¹ verwendet, um die Änderung der Fluoreszenzintensität in Hyphen von Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP bei Kontakt mit Clonostachys rosea 016 als Funktion der Zeit zu bewerten.
      1. Laden Sie Fidschi herunter, installieren Sie es und starten Sie es. Importieren Sie die Bildsequenz aus einem Zeitrafferexperiment, indem Sie Datei > > Bildsequenz importieren auswählen. Suchen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert sind, und wählen Sie Öffnen aus. Wählen Sie im Fenster "Sequenzoptionen" die Option "Voreinstellungen" und dann "OK".
      2. Geben Sie einen Bereich von Interesse (ROI) an, um die absolute Fluoreszenzintensität einer Hypha mit dem rechteckigen Werkzeug in der Hauptsymbolleiste zu messen. Die Größe des Quadrats kann genau wie folgt definiert werden: Bearbeiten > Auswahl > angeben; Der ROI kann auch zur späteren Bezugnahme im ROI-Manager gespeichert werden, indem Sie > Auswahl bearbeiten > Zu Manager hinzufügen auswählen.
      3. Messen Sie die absolute Fluoreszenzintensität (mittlerer Grauwert) innerhalb des definierten ROI für jedes Bild in der gesamten Bildsequenz oder im Stack wie folgt: Image > Stacks > Measure Stack. Das Ergebnisfenster wird automatisch geöffnet, sobald alle Bilder im Stapel verarbeitet wurden.
         HINWEIS: Die im Ergebnisfenster angezeigten Daten können wie folgt definiert werden: Klicken Sie auf das Ergebnisfenster und wählen Sie dann Ergebnisse > Messungen festlegen. Stellen Sie sicher, dass der mittlere Grauwert ausgewählt wurde.
      4. Wählen Sie alle Daten im Ergebnisfenster aus. Kopieren Sie es und fügen Sie es in ein anderes Softwareprogramm ein, z. B. eine Tabellenkalkulation, um die absoluten Fluoreszenzintensitäten des angegebenen ROI als Funktion der Zeit darzustellen.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.2.2-5.2.2.4, um absolute Fluoreszenzintensitätsmessungen für jeden ROI zu erfassen, d. h. für den interessierenden Hyph, neben dem interessierenden Hypha oder innerhalb des entsprechenden Kontrollkanals.
      6. Berechnen Sie die geeigneten relativen Fluoreszenzintensitäten in beliebigen Einheiten (AU), z. B. indem Sie die absolute Fluoreszenzintensität des ROI [Hypha of Interest] durch die absolute Fluoreszenzintensität des ROI [Kontrollkanal] dividieren. Weitere Einzelheiten finden Sie in der^{FFI-Veröffentlichung 41.}
      7. Führen Sie mindestens drei biologische Replikate pro Experiment durch und zeichnen Sie die relativen Fluoreszenzintensitäten als Funktion der Zeit auf.

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse werden anhand der Exemplare BFI⁴⁰ und FFI⁴¹ vorgestellt. Hyphenwachstumsratenmessungen können mit diesen Geräten in Kombination mit grundlegenden Mikroskopietechniken leicht durchgeführt werden. Abbildung 3A-B veranschaulicht bakteriell-pilzliche Interaktionen zwischen C. cinerea hyphae und B. subtilis NCIB 3610. Das Vorhandensein von B. subtilis stoppt das W...

Diskussion

Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen unter Verwendung der Kanalmikrofluidik vor. Ziel der Autoren ist es, die Vielseitigkeit dieser Geräte zu demonstrieren und die Anpassung an die Interessen des Forschers zu fördern. Mit Hilfe der beispielhaften BFI- und FFI-Geräte können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen detaillierter untersucht werden, als bisher zugänglich. Durch die Beseitigung der Hintergrundkomplexität und Heterogenität des Bodens, die Moderation des Wachs...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar	Difco Laboratories	214010	Wird zum Verfestigen von Nährmedium für die Bakterien- und Pilzkultivierung in Petrischalen
verwendet Aluminiumfolie	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoklav (VX-75)	Systec
Zentrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlortrimethylsilan	Merck Life Sciences	386529	VORSICHT: Chlortrimethylsilan ist ein gefährlicher Stoff. Tragen Sie geeignete PSA und gehen Sie vorsichtig damit um. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und verhindern Sie das Einatmen. Von Zündquellen fernhalten und in einem gut belüfteten Bereich verwenden.
Korkbohrer	SLS	COR1000
Entwicklerlösung (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		ACHTUNG: Die Entwicklerlösung mr-Dev 600 ist brennbar
Erlenmeyerkolben	VWR	214-1108	z.B. 200 mL; wählen Sie die Größe, die genau Ihren Bedürfnissen entspricht
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Verdünnt von 99,8 % (Qualität für analytische Reagenzien)
Fiji	ImageJ		Exemplarisches Softwarepaket für die Bildverarbeitung
Gefilterte Druckluft			In den meisten Labors standardmäßig verfügbar. Alternativ kann ein ölfreier Kompressor mit Luftregler verwendet werden.
Flachkopfpinzette	SLS	INS5026
Pinzette	Fisher Scientific Ltd	10008051	Gebogene, scharfe
Petrischale mit Glasboden	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Petrischale mit Glasboden	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Kristallisationsschalen aus Glas	VWR	216-1865	Gebraucht zum Waschen von PDMS-Platten
Glaskristallisationsschalen	VWR	216-1866	Wird bei der Entwicklung von Urformen
Medienflaschen aus Glas	Fisher Scientific Ltd	15456113	z.B. 250 mL; wählen Sie die Größe genau nach Ihren Bedürfnissen
Glasspritze (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Wird zur Abgabe von Chlortrimethylsilan
Heizplatte (HP 160 III BM)	verwendetSAWATEC
Impföse	VWR	COPA175CS01
Isopropylalkohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar-Flow-Haube	Air Science (PCR)		Exemplarische Laminar-Flow-Haube für die Herstellung von Geräten
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar Nährstoffbrühe für bakterielle Übernachtkultur
Leuchtdioden-Lichtmaschine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplarische Lichtquelle, die zur Abbildung von Pilz-Mikrobiellen Wechselwirkungen (Fluoreszenz) verwendet werden kannMA6
Ultraviolett-Masken-Aligner	Süss Microtec
Malzextrakt	VWR	84618	Wird zur Herstellung von exemplarischem Pilzkulturmedium (Malzextrakt-Agar)
verwendetMask Writer	Verwendete Materialien	4700DP	Beispiel für einen Maskenschreiber, der zum Drucken von Fotomasken für die Fotolithographie verwendet werden kann
Master-Form Kunststoffhalterung			3D-gedruckter maßgeschneiderter Halter, der im eigenen Haus hergestellt
wird Mikrobiologische Sicherheitswerkbank   (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC für mikrobielle Kulturen und Geräteinokulation
Milli-Q gereinigtes Wasser			Als Standard in Biologielabors verfügbar.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research Imaging-Software	Nikon		Exemplar Softwarepaket für die Bilderfassung
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar Softwarepaket zum Betrachten von aufgenommenen Bildern
Ofen (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Wird zum Aushärten von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) verwendet)
Backofen (CLO-2AH-S)	KOYO		Zur Vorbereitung von Silikonwafern
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparente Folie
Petrischale, quadratisch steril	Fisher Scientific Ltd	11708573	120,5 mm
Petrischale, steril	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithographie-Maske	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasmareiniger (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Kunststoffbecher	Semadeni	8323
Kunststoffspatel	Semadeni	3340
Tragbare Präzisionswaage (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Zum Wiegen von PDMS, Medien Komponenten usw.
Präzisionsschneider	Syneo	HS1251135P1183	Durchmesser der Schneide: 3.18 mm
Präzisionsfräser	Syneo	HS1871730P1183S	Schneidendurchmesser: 4,75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Rasierklingen	Hä berle Labortechnik	9156110
Kühlschrank	Haden		4-6 ° C
Retiga R1 CCD-Kamera	Qimaging		Beispielkamera, die zur Abbildung von Pilz-Mikroben-Wechselwirkungen verwendet werden kann
Scotch Magic Tape	Office Depot	3969954	19 mm unsichtbares Band; durchsichtiges Band
Schüttel-Inkubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Siliziumwafer	Inseto		100 mm
Kalknatronglas Platte	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Wird verwendet, um die Photolithographie-Maske in der Maskenschiene
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater zu halten	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 Fotolack	MicroChem		ACHTUNG: SU-8 Fotolack ist gefährlich, seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und verhindern Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut. Entzündlich, potenziell krebserregend und giftig für die Umwelt.
Sylgard 184 Elastomer-Kit	VWR	634165S	Wird zur Vorbereitung von Poly(dimethylsiloxan)(PDMS)-Geräten
Temperaturgesteuerter Inkubator	Okolab		Exemplarischer Inkubator, der zur Darstellung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen verwendet werden
kann Inverses Epifluoreszenzmikroskop Ti2-E Inverses Epifluoreszenzmikroskop	Nikon	MEA54000	Exemplar-Mikroskop, das zur Darstellung von Pilz-Mikrobiellen Wechselwirkungen verwendet werden kann
Ultraschallreiniger S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vakuum-Exsikkator	Fisher Scientific Ltd	Silianisierung und PDMS-Entgasung sollten in separaten Exsikkatoren durchgeführt werden
x10/0,3 NA CFI Plan Fluor DL Objektiv	Nikon	MRH20105	Exemplar Objektiv, das zur Abbildung von Pilz-Mikroben-Wechselwirkungen verwendet werden kann
x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL Objektiv	Nikon	MRH48230	Exemplarisches Objektiv, das zur Abbildung von Pilz-Mikroben-Interaktionen verwendet werden kann