Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.
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Methodenartikel
Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Filamentöse Pilze sind erfolgreiche Bewohner des Bodens und spielen eine wichtige Rolle in Bodenökosystemen, etwa beim Abbau organischer und anorganischer Stoffe, sowie bei der Regulierung des Nährstoffgehalts. Dort finden sie auch zahlreiche Möglichkeiten, mit einer Vielzahl anderer Mikroben wie Bakterien oder anderen Pilzen zu interagieren. Die Untersuchung von Pilzinteraktionen auf zellulärer Ebene kann jedoch aufgrund der Black-Box-ähnlichen Natur des Bodens eine Herausforderung darstellen. Neue mikrofluidische Werkzeuge werden für die Untersuchung von Pilzinteraktionen entwickelt; Zwei Plattformen zur Untersuchung von bakteriell-pilzlichen und Pilz-Pilz-Interaktionen werden hervorgehoben. Innerhalb dieser Mikrokanäle können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen in kontrollierten physikalisch-chemischen Umgebungen mit höherer zeitlicher und räumlicher Auflösung als bisher beobachtet werden. Die Anwendung dieser Werkzeuge hat zahlreiche neue biologische Erkenntnisse hervorgebracht, wie z.B. die Beobachtung der bakteriellen polaren Bindung an Hyphen oder die Aufdeckung uncharakterisierter Pilz-Pilz-Antagonismen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methoden ist die einfache Verwendung dieses Tools durch Nicht-Experten, was zu hochgradig übersetzbaren Technologien für den Einsatz in mikrobiologischen Labors führt.
Einleitung
Der Boden ist eine außergewöhnlich vielfältige Umgebung, die eine Fülle von Mikroorganismen enthält, die für Kohlenstoff- und Phosphorzyklen von entscheidender Bedeutung sind 1,2. Filamentöse Pilze sind ein wichtiger Bestandteil zahlreicher Ökosysteme als Zersetzer von organischer und anorganischer Substanz und können die Ernährung von Pflanzen durch die Bildung symbiotischer Beziehungenverbessern 3,4. Im Boden interagieren Pilze dynamisch mit einer Vielzahl von Mikroben wie anderen Pilzen5, Bakterien 6, ....
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Protokoll
HINWEIS: Eine Zusammenfassung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 2 visuell dargestellt.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der vorgestellten Methodik, bestehend aus fünf Hauptabschnitten, die in diesem Protokoll detailliert beschrieben sind. Gerätedesigns werden mit CAD-Software (Computer Aided Design) und einer mit Photolithographie hergestellten Masterform erstellt (1). ....
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Ergebnisse
Repräsentative Ergebnisse werden anhand der Exemplare BFI40 und FFI41 vorgestellt. Hyphenwachstumsratenmessungen können mit diesen Geräten in Kombination mit grundlegenden Mikroskopietechniken leicht durchgeführt werden. Abbildung 3A-B veranschaulicht bakteriell-pilzliche Interaktionen zwischen C. cinerea hyphae und B. subtilis NCIB 3610. Das Vorhandensein von B. subtilis stoppt das W.......
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Diskussion
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Untersuchung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen unter Verwendung der Kanalmikrofluidik vor. Ziel der Autoren ist es, die Vielseitigkeit dieser Geräte zu demonstrieren und die Anpassung an die Interessen des Forschers zu fördern. Mit Hilfe der beispielhaften BFI- und FFI-Geräte können pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen detaillierter untersucht werden, als bisher zugänglich. Durch die Beseitigung der Hintergrundkomplexität und Heterogenität des Bodens, die Moderation des Wachs.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Wir danken der finanziellen Unterstützung des Department of Bioengineering am Imperial College London und des Leverhulme Trust (Research Grant Reference: RPG-2020-352).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | Wird zum Verfestigen von Nährmedium für die Bakterien- und Pilzkultivierung in Petrischalen |
| verwendet Aluminiumfolie | Fisher Scientific Ltd | 11759408 | |
| AutoCAD 2021 | Autodesk, USA | ||
| Autoklav (VX-75) | Systec | ||
| Zentrifuge (5810R) | Eppendorf | ||
| Chlortrimethylsilan | Merck Life Sciences | 386529 | VORSICHT: Chlortrimethylsilan ist ein gefährlicher Stoff. Tragen Sie geeignete PSA und gehen Sie vorsichtig damit um. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen und verhindern Sie das Einatmen. Von Zündquellen fernhalten und in einem gut belüfteten Bereich verwenden. |
| Korkbohrer | SLS | COR1000 | |
| Entwicklerlösung (mr-Dev 600) | Microresist Technologies | ACHTUNG: Die Entwicklerlösung mr-Dev 600 ist brennbar | |
| Erlenmeyerkolben | VWR | 214-1108 | z.B. 200 mL; wählen Sie die Größe, die genau Ihren Bedürfnissen entspricht |
| Ethanol (70% v/v) | Fisher Scientific Ltd | E/0650DF/15 | Verdünnt von 99,8 % (Qualität für analytische Reagenzien) |
| Fiji | ImageJ | Exemplarisches Softwarepaket für die Bildverarbeitung | |
| Gefilterte Druckluft | In den meisten Labors standardmäßig verfügbar. Alternativ kann ein ölfreier Kompressor mit Luftregler verwendet werden. | ||
| Flachkopfpinzette | SLS | INS5026 | |
| Pinzette | Fisher Scientific Ltd | 10008051 | Gebogene, scharfe |
| Petrischale mit Glasboden | World Precision Instruments | FD35-100 | 35 mm |
| Petrischale mit Glasboden | World Precision Instruments | FD5040-100 | 50 mm |
| Kristallisationsschalen aus Glas | VWR | 216-1865 | Gebraucht zum Waschen von PDMS-Platten |
| Glaskristallisationsschalen | VWR | 216-1866 | Wird bei der Entwicklung von Urformen |
| Medienflaschen aus Glas | Fisher Scientific Ltd | 15456113 | z.B. 250 mL; wählen Sie die Größe genau nach Ihren Bedürfnissen |
| Glasspritze (Hamilton) | Fisher Scientific Ltd | 10625251 | Wird zur Abgabe von Chlortrimethylsilan |
| Heizplatte (HP 160 III BM) | verwendetSAWATEC | ||
| Impföse | VWR | COPA175CS01 | |
| Isopropylalkohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| Laminar-Flow-Haube | Air Science (PCR) | Exemplarische Laminar-Flow-Haube für die Herstellung von Geräten | |
| LB medium | Fisher Scientific Ltd | BP9723-500 | Exemplar Nährstoffbrühe für bakterielle Übernachtkultur |
| Leuchtdioden-Lichtmaschine (LedHUB) | Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH | Exemplarische Lichtquelle, die zur Abbildung von Pilz-Mikrobiellen Wechselwirkungen (Fluoreszenz) verwendet werden kannMA6 | |
| Ultraviolett-Masken-Aligner | Süss Microtec | ||
| Malzextrakt | VWR | 84618 | Wird zur Herstellung von exemplarischem Pilzkulturmedium (Malzextrakt-Agar) |
| verwendetMask Writer | Verwendete Materialien | 4700DP | Beispiel für einen Maskenschreiber, der zum Drucken von Fotomasken für die Fotolithographie verwendet werden kann |
| Master-Form Kunststoffhalterung | 3D-gedruckter maßgeschneiderter Halter, der im eigenen Haus hergestellt | ||
| wird Mikrobiologische Sicherheitswerkbank (BioMat2) | Contained Air Solutions | Exemplar MSC für mikrobielle Kulturen und Geräteinokulation | |
| Milli-Q gereinigtes Wasser | Als Standard in Biologielabors verfügbar. | ||
| NaOH | Fisher Scientific Ltd | BP359-500 | |
| NIS-Elements Advanced Research Imaging-Software | Nikon | Exemplar Softwarepaket für die Bilderfassung | |
| NIS-Elements Free Viewer | Nikon | Exemplar Softwarepaket zum Betrachten von aufgenommenen Bildern | |
| Ofen (Binder BD115) | Fisher Scientific Ltd | 15602126 | Wird zum Aushärten von Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) verwendet) |
| Backofen (CLO-2AH-S) | KOYO | Zur Vorbereitung von Silikonwafern | |
| Parafilm | Bemis | HS234526B | transparente Folie |
| Petrischale, quadratisch steril | Fisher Scientific Ltd | 11708573 | 120,5 mm |
| Petrischale, steril | Fisher Scientific Ltd | 15370366 | 90 mm |
| Photolithographie-Maske | Micro Lithography Services Ltd. UK | ||
| Plasmareiniger (Zepto) | Diener Electronic | 100012601 | |
| Kunststoffbecher | Semadeni | 8323 | |
| Kunststoffspatel | Semadeni | 3340 | |
| Tragbare Präzisionswaage (OHAUS Scout) | Fisher Scientific Ltd | 15519631 | Zum Wiegen von PDMS, Medien Komponenten usw. |
| Präzisionsschneider | Syneo | HS1251135P1183 | Durchmesser der Schneide: 3.18 mm |
| Präzisionsfräser | Syneo | HS1871730P1183S | Schneidendurchmesser: 4,75 mm |
| Profilometer | Bruker | Dektak XT-stylus | |
| Rasierklingen | Hä berle Labortechnik | 9156110 | |
| Kühlschrank | Haden | 4-6 ° C | |
| Retiga R1 CCD-Kamera | Qimaging | Beispielkamera, die zur Abbildung von Pilz-Mikroben-Wechselwirkungen verwendet werden kann | |
| Scotch Magic Tape | Office Depot | 3969954 | 19 mm unsichtbares Band; durchsichtiges Band |
| Schüttel-Inkubator (Cole-Parmer SI500) | Fisher Scientific Ltd | 10257954 | |
| Siliziumwafer | Inseto | 100 mm | |
| Kalknatronglas Platte | Inseto | 125 mm x 125 mm x 2 mm. Wird verwendet, um die Photolithographie-Maske in der Maskenschiene | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Spincoater zu halten | SAWATEC | SM-180-BM | |
| SU-8 2010 Fotolack | MicroChem | ACHTUNG: SU-8 Fotolack ist gefährlich, seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und verhindern Sie das Einatmen und den Kontakt mit der Haut. Entzündlich, potenziell krebserregend und giftig für die Umwelt. | |
| Sylgard 184 Elastomer-Kit | VWR | 634165S | Wird zur Vorbereitung von Poly(dimethylsiloxan)(PDMS)-Geräten |
| Temperaturgesteuerter Inkubator | Okolab | Exemplarischer Inkubator, der zur Darstellung von Pilz-mikrobiellen Wechselwirkungen verwendet werden | |
| kann Inverses Epifluoreszenzmikroskop Ti2-E Inverses Epifluoreszenzmikroskop | Nikon | MEA54000 | Exemplar-Mikroskop, das zur Darstellung von Pilz-Mikrobiellen Wechselwirkungen verwendet werden kann |
| Ultraschallreiniger S-Line | Fisher Scientific Ltd | FB15050 | |
| Vakuum-Exsikkator | Fisher Scientific Ltd | Silianisierung und PDMS-Entgasung sollten in separaten Exsikkatoren durchgeführt werden | |
| x10/0,3 NA CFI Plan Fluor DL Objektiv | Nikon | MRH20105 | Exemplar Objektiv, das zur Abbildung von Pilz-Mikroben-Wechselwirkungen verwendet werden kann |
| x20/0,45 NA CFI Plan Fluor DL Objektiv | Nikon | MRH48230 | Exemplarisches Objektiv, das zur Abbildung von Pilz-Mikroben-Interaktionen verwendet werden kann |
Referenzen
- Zhu, Y. -G., Miller, R. M. Carbon cycling by arbuscular mycorrhizal fungi in soil-plant systems. Trends in Plant Science. 8 (9), 407-409 (2003).
- Dai, Z., et al. Long-term nutrient inputs shift soil microbial fun....
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Nachdrucke und Genehmigungen
