Das vorliegende Protokoll beschreibt Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte softwaregestützte Methoden zur Visualisierung und genauen Quantifizierung proliferierender und ruhender Trypanosoma-cruzi-Parasiten und T-Zellen in intakten, gereinigten Organen und Geweben. Diese Techniken bieten eine zuverlässige Möglichkeit, Behandlungsergebnisse zu bewerten und neue Einblicke in Parasiten-Wirt-Interaktionen zu bieten.
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Methodenartikel
Quantitative 3D-Bildgebung von Trypanosoma-cruzi-infizierten Zellen, ruhenden Amastigoten und T-Zellen in intakten geklärten Organen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Chagas-Krankheit ist eine vernachlässigte Pathologie, die Millionen von Menschen weltweit betrifft, hauptsächlich in Lateinamerika. Der Erreger der Chagas-Krankheit, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ist ein obligater intrazellulärer Parasit mit einer vielfältigen Biologie, der mehrere Säugetierarten, einschließlich des Menschen, infiziert und Herz- und Verdauungspathologien verursacht. Der zuverlässige Nachweis von T. cruzi-In-vivo-Infektionen ist seit langem erforderlich, um die komplexe Biologie der Chagas-Krankheit zu verstehen und das Ergebnis von Behandlungsschemata genau zu bewerten. Das aktuelle Protokoll demonstriert eine integrierte Pipeline zur automatisierten Quantifizierung von T. cruzi-infizierten Zellen in 3D-rekonstruierten, geklärten Organen. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die genaue Visualisierung und Quantifizierung von aktiv proliferierenden und ruhenden T. cruzi-Parasiten und Immuneffektorzellen in ganzen Organen oder Geweben. Auch die CUBIC-HistoVision-Pipeline zur einheitlichen Markierung von befreiten Organen mit Antikörpern und nuklearen Färbungen wurde erfolgreich übernommen. Die Gewebereinigung in Verbindung mit der 3D-Immunfärbung bietet einen unvoreingenommenen Ansatz zur umfassenden Bewertung von Arzneimittelbehandlungsprotokollen, zur Verbesserung des Verständnisses der zellulären Organisation von T. cruzi-infizierten Geweben und soll Entdeckungen im Zusammenhang mit Anti-T-Cruzi-Immunantworten, Gewebeschäden und Reparaturen bei der Chagas-Krankheit vorantreiben.
Einleitung
Die Chagas-Krankheit, verursacht durch den Protozoenparasiten T. cruzi, gehört zu den am meisten vernachlässigten Tropenkrankheiten der Welt und verursacht jährlich etwa 13.000 Todesfälle. Die Infektion schreitet häufig von einem akuten zu einem chronischen Stadium fort, was bei 30% der Patienten zu einer Herzpathologie führt, einschließlich Arrhythmien, Herzinsuffizienz und plötzlichem Tod 1,2. Trotz der starken Immunantwort des Wirts gegen den Parasiten während der akuten Phase bleiben während des gesamten Lebens des Wirts eine geringe Anzahl von Parasiten in Geweben wie Herz und Skelettmuskulatur c....
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Protokoll
Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und den Akkreditierungsrichtlinien der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt. Das Animal Use Protocol (Control of T. cruzi infection in mice-A2021 04-011-Y1-A0) wurde vom University of Georgia Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J und C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Mäuse (weiblich,1-2 Monate alt) wurden für die vorliegende Studie ....
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Ergebnisse
CUBIC fixierte Gewebe wurden mit PBS gewaschen, um Fixiermittel zu entfernen, und dann mit CUBIC-L-Cocktails inkubiert, einer basischen gepufferten Lösung von Aminoalkoholen, die Pigmente und Lipide aus dem Gewebe extrahieren, was zu einer Entfärbung des Gewebes unter Beibehaltung der Gewebearchitektur führt. Gitterlinien im Papier sind durch die Gewebe hindurch zu sehen, was auf eine entsprechende Reinigung der Organe hinweist (Abbildung 2A). Nach der Delipidierung wurden d.......
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Diskussion
Das Fehlen einer umfassenden Ganzorgan-Bildgebung von Parasiten und der Immunantwort schränkt das Verständnis der Komplexität der Wirt-Parasit-Interaktionen ein und behindert die Bewertung von Therapien für die Chagas-Krankheit. Die vorliegende Studie übernahm die CUBIC-Pipeline, um intakte Organe und Gewebe von T. cruzi-infizierten Mäusen zu klären und zu färben.
In dieser Studie wurden mehrere Gewebereinigungsprotokolle getestet (PACT32, ECi 33, FLASH
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.
Danksagungen
Wir danken Dr. Etsuo Susaki für ihre wertvolle Hilfe und Empfehlungen zu Protokollen zur Gewebereinigung und Immunfärbung. Außerdem danken wir M. Kandasamy vom CTEGD Biomedical Microscopy Core für die technische Unterstützung mit LSFM und konfokaler Bildgebung. Wir danken auch allen Mitgliedern der Tarleton Research Group für hilfreiche Vorschläge während dieser Studie.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-Methylimidazol | Millipore Sigma | 616-47-7 | |
| 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon (Antipyrin | TCI | D1876 | |
| 6-Wells Zellkulturplatten | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| AlexaFluor 647 Anti-Maus Fab Fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 315-607-003 | |
| AlexaFluor 647 Anti-Kaninchen Fab-Fragment | Jackson Immuno Research Laboratories | 111-607-003 | |
| Anti-GFP-Nanobody Alexa Fluor 647 | Chromotek | gb2AF647-50 | |
| Anti-RFP | Rockland | 600-401-379 | |
| Anti-Α-SMA | Sigma | A5228 | |
| B6. C+A2:A44G-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Maus | Der Jackson Laboratory Stamm | #007914 | gebräuchlicher Name: Ai14, Ai14D oder Ai14(RCL-tdT)-D |
| B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J Maus | Der Jackson | Laboratory Stamm #007914 | Allgemeiner Name: Ai14, Ai14D oder Ai14(RCL-tdT)-D |
| BOBO-1 Iodid | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Maus | Der Jackson Laboratory Stamm | #032080 | Häufig Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre) |
| CAPSO | Sigma | #C2278 | |
| Reinigungstücher Kimwipes | Kimberly-Clark | T8788 | |
| Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Zeiss | LSM 790 | |
| CUBIC-HV 1 3D-Immunfärbekit | TCI | C3699 | |
| CUBIC-HV 1 3D-Nuklearfärbekit | TCI | C3698 | |
| CUBIC-L | TCI | T3740 | |
| CUBIC-P | TCI | T3782 | |
| CUBIC-R+ | TCI | T3741 | |
| Cyanacrylat-basierter | Gel-Sekundenkleber Scotch | 571605 | |
| DiR (DiIC18(7); 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyaniniodid) Unternehmen: Biotium | Biotium # | 60017 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Millipore Sigma | 60-00-4 | |
| Falcon Zentrifugenröhrchen 15 mL | Corning | ||
| Falcon Zentrifugenröhrchen 50 mL | Corning | CLS430290 | |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Heparin | ThermoFisher Scientific | J16920. BBR | |
| Hyaluronidase | Sigma | #H3884 oder #H4272 | |
| Imaris File Converter x64 | BitPlane | v9.2.0 | |
| Imaris Software | BitPlane | v9.3 | |
| ImSpector Software | LaVision BioTec, Miltenyi Biotec | v6.7 | |
| Intravenöse Injektionsnadel 23-G | Sartori, Minisart Spritzenfilter | 16534 | |
| Kimwipes | fusselfreie Tücher | ||
| Light-Sheet-Fluoreszenzmikroskop | Miltenyi Biotec | ULtramicroscope II Bildgebungssystem | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | 041838.K2 | |
| Mikropipettenspitzen, 10 & Mikro; L, 200 & Mikro; L und 1.000 µ L | Axygen | T-300, T-200-Y und T-1000-B | |
| Motorisierter Pipettenspender | Fisher Scientific, Fisherbrand | 03-692-172 | |
| Eindecklösung | TCI | M3294 | |
| N-Butyldiethanolamin | TCI | B0725 | |
| Nicotinamid | TCI | N0078 | |
| N-Methylnicotinamid | TCI | M0374 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain | Biotium | #40061 | |
| Sacrifice Perfusion System | Leica | 10030-380 | |
| Schere | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Serologische Pipetten | Costar Sterile | 4488 | |
| Schüttelinkubator | TAITEC | BR-43FM MR | |
| Natriumazid (NaN3) | ThermoFisher Scientific | 447815000 | |
| Natriumcarbonat (Na2CO3) | ThermoFisher Scientific | L13098.36 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | ThermoFisher Scientific | 447302500 | |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | ThermoFisher Scientific | 014707.A9 | |
| SYTOX-G Grüner Nukleinsäure-Farbstoff | ThermoFisher Scientific | S7020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Referenzen
- Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. The future of Chagas disease control. Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).
- Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. Pathogenesis of chronic Chagas heart disease. Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).
- Tarleto....
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Nachdrucke und Genehmigungen
