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Methodenartikel

Linke anteriore absteigende Koronararterienligatur für die Ischämie-Reperfusionsforschung: Modellverbesserung durch technische Modifikationen und Qualitätskontrolle

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DOI:

10.3791/63921

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16. Dezember 2022

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1Department of Life Science, Fu Jen Catholic University, 2Department of Medicine, MacKay Medical College, 3Department of Emergency Medicine, MacKay Memorial Hospital, 4Graduate Institute of Injury Prevention and Control, Taipei Medical University, 5MacKay Junior College of Medicine, Nursing, and Management, 6Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Taitung Mackay Memorial Hospital, 7Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, MacKay Memorial Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das sich auf die Qualitätskontrolle der linken anterioren absteigenden Koronararterienligatur konzentriert, indem das traditionelle Verfahren bei Ratten für die akute Myokardischämie-Reperfusionsforschung technisch modifiziert wird.

Zusammenfassung

Die koronare Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Todesursache. Eine vollständige Unterbrechung des Blutflusses in den Koronararterien führt zu einem ST-Hebungs-Myokardinfarkt (STEMI), der zu einem kardiogenen Schock und tödlichen Arrhythmien führt, die mit einer hohen Mortalität verbunden sind. Die primäre Koronarintervention (PCI) zur Rekanalisation der Koronararterie verbessert die Ergebnisse von STEMI signifikant, aber Fortschritte bei der Verkürzung der Zeit von der Tür bis zum Ballon haben die Sterblichkeit im Krankenhaus nicht gesenkt, was darauf hindeutet, dass zusätzliche therapeutische Strategien erforderlich sind. Die Ligatur der linken anterioren absteigenden Koronararterie (LAD) bei Ratten ist ein Tiermodell für die akute myokardiale IR-Forschung, das mit dem klinischen Szenario vergleichbar ist, in dem eine schnelle koronare Rekanalisation durch PCI für STEMI verwendet wird. Die PCI-induzierte STEMI ist jedoch eine technisch anspruchsvolle und komplizierte Operation, die mit einer hohen Mortalität und großen Schwankungen in der Infarktgröße verbunden ist. Wir identifizierten die ideale Position für die LAD-Ligatur, entwickelten ein Gerät zur Kontrolle einer Snare-Schleife und unterstützten ein modifiziertes chirurgisches Manöver, wodurch Gewebeschäden reduziert wurden, um ein zuverlässiges und reproduzierbares Forschungsprotokoll zur akuten Myokardischämie-Reperfusion (IR) für Ratten zu etablieren. Es handelt sich um eine Operation, bei der es sich nicht um ein Überleben handelt. Wir schlagen auch eine Methode zur Validierung der Qualität von Studienergebnissen vor, was ein entscheidender Schritt zur Bestimmung der Genauigkeit nachfolgender biochemischer Analysen ist.

Einleitung

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit eine der häufigsten Todesursachen 1,2. Neben der Kontrolle modifizierbarer Risikofaktoren zur Verhinderung der Entstehung einer koronaren Herzkrankheit sind beim akuten Koronarsyndrom therapeutische Strategien von entscheidender Bedeutung 3,4. Es wurde festgestellt, dass kardiogener Schock und tödliche Arrhythmien bei akutem ST-Hebungs-Myokardinfarkt (STEMI) die Wahrscheinlichkeit einer Krankenhausmortalität erhöhen 5,6,7,8. Die primäre perkutane Koronarintervention (PCI) ist die bevorzugte Behandlung von STEMI 9,10,11; Die therapeutischen Effekte haben jedoch eine Obergrenze, wenn die Tür-zu-Ballon-Zeit <90 min12,13 beträgt. Zusätzliche Strategien sind erforderlich, um die klinischen Ergebnisse der Krankheit weiter zu verbessern 14,15,16,17,18,19.

Ein Experiment zur akuten myokardialen Ischämie-Reperfusion (IR) mit einer Ligatur der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) bei Ratten ist eines der Tiermodelle, die mit dem klinischen Szenario vergleichbar sind, bei dem Patienten mit STEMI kurze Tür-zu-Ballon-Zeiten benötigen, um das Herz vor ischämischen Schäden zu retten. Chirurgisch induzierte STEMI bei Kleintieren ist jedoch oft eine technische Herausforderung, da es sich um eine komplexe Operation handelt, die mit einer hohen Mortalität und einer hohen Variation der Infarktgröße verbundenist 20,21,22,23,24. Um die technische Herausforderung zu meistern, wurde in der vorliegenden Studie ein umfassendes und effektives Tiermodell an Ratten (da sie größer als Mäuse sind) entwickelt, um durch technische Modifikation ein zuverlässiges und reproduzierbares akutes myokardiales IR-Forschungsprotokoll zu etablieren. Das vorgeschlagene Protokoll führt zu weniger chirurgischen Komplikationen, weniger Gewebeschäden und einer geringeren Sterblichkeitswahrscheinlichkeit während der Operation. Zusätzlich wurde ein Verfahren eingesetzt, um die Infarktgröße und das Area at Risk (AAR) zu messen und so die Qualität der Studienergebnisse zu verifizieren. Das vorgeschlagene Protokoll kann verwendet werden, um die pathophysiologischen Prozesse des akuten myokardialen IR-Stresses zu untersuchen, um neue therapeutische Strategien gegen die Schädigung zu entwickeln.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem von den US-amerikanischen National Institutes of Health herausgegebenen Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt (NIH-Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1996). Das Studienprotokoll wurde von und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der Fu-Jen Catholic University genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Operation

  1. Zubereitung von nassen Wattebällchen mit Kochsalzlösung
    1. Ziehen Sie eine chirurgische Maske und Handschuhe an.
    2. Kneifen Sie eine kleine Portion sterile Baumwolle ab und rollen Sie sie zu einem Ball. Wiederholen Sie diesen Vorgang.
    3. Tauchen Sie die Wattebällchen in sterile 0,9%ige Kochsalzlösung und drücken Sie überschüssige Kochsalzlösung aus.
    4. Bewahren Sie die Wattebällchen in einer sauberen Box auf, die mit 75% Ethanol sterilisiert ist.
  2. Vorbereitung der Haltehaken.
    1. Ziehen Sie eine chirurgische Maske und Handschuhe an.
    2. Sterilisieren Sie Clips und Gummibänder mit 75% Ethanol.
    3. Biegen Sie die Clips in die Form eines Hakens für die Brustwand und das Gewebe.
    4. Verbinden Sie die gebogenen Clips mit einem, zwei oder drei Gummibändern, um sicherzustellen, dass die Spannung der Wunde des Operationsfensters groß genug für die LAD-Ligatur ist.
    5. Bereiten Sie mindestens fünf selbstgemachte Haken vor und lagern Sie sie in einer sauberen Box, die mit 75% Ethanol sterilisiert ist.
  3. Vorbereitung einer Ligationsschlaufe.
    1. Legen Sie die Mitte eines 7-0-Seidenstichs in das 1/2 Kreis Größe 3 Federöhr einer sich verjüngenden, nicht gekneteten chirurgischen Nadel.
  4. Vorbereitung eines Snare-Loop-Controllers
    1. Schneiden Sie ein 5-mm-Rohr aus Polyethylen (PE)-10 mit einer Schere ab.
    2. Erhitzen und erweichen Sie das Rohr unter Flamme, um beide Kanten zu glätten.
  5. Zubereitung der Ratten
    1. Wählen Sie 8 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Mindestgewicht von 250 g aus.
    2. Unterbringe und halte die Ratten unter einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus bei kontrollierter Temperatur (21 °C ± 2 °C) mit freiem Zugang zu Futter, Standard-Mauspellets und Leitungswasser.
    3. Betäubung der Ratten mit Pentobarbital (50 mg/kg, intraperitoneal verabreicht).
      HINWEIS: Nach jeder Stunde sollte ein zusätzliches Anästhetikum (Pentobarbital, 30 mg/kg) verabreicht werden.
    4. Überprüfen Sie die Reflexe der Ratten, indem Sie den Schwanz und die Hinterfüße kneifen, um sicherzustellen, dass das Tier ausreichend betäubt ist.
    5. Öffnen Sie das Gewebe zwischen zwei Kartuschenringen unterhalb der Stimmritze mit einer Schere und führen Sie einen 3 cm langen PE-10-Schlauch ein, der als Endotrachealtubusfungiert 25.
    6. Schließen Sie den Endotrachealtubus manuell an ein Beatmungsgerät an.
    7. Untersuchen Sie die Brustbewegung des Tieres, die mit dem Atemzyklus synchronisiert ist, um sicherzustellen, dass die Lunge ausreichend belüftet ist.
    8. Öffnen Sie die Halsregion und kanülieren Sie die Halsvene26.

2. LAD-Ligatur

  1. Ziehen Sie eine chirurgische Maske und Handschuhe an.
  2. Berühren Sie die Brust und finden Sie das Manubrium und den Brustbeinwinkel (die Verbindung von Manubrium und Brustbeinkörper).
  3. Identifizieren Sie die linke Rippe, die mit dem Brustbeinwinkel (Rippe A) verbunden ist, indem Sie sie manuell berühren.
  4. Identifizieren Sie den Zwischenrippenraum unmittelbar unter Rippe A. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette mit feiner Spitze sanft in der Nähe des Zwischenrippenraums an. Verwenden Sie dann ein chirurgisches Skalpell mit einer Klinge, um einen 1 cm langen schrägen Schnitt entlang der Hautspannungslinien von der Stelle etwa 5 mm links vom Brustbeinkörper zu erstellen.
  5. Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Haut- und Muskelschichten sanft vom Schnitt zu trennen. Haken Sie die Muskelschichten außerhalb der linken vorderen Brustwand mit gebogenen Klammern nach unten ein, um die darunter liegenden Rippen freizulegen.
  6. Identifiziere die Rippe unter Rippe A (Rippe B). Schneiden Sie Rippe B mit einer stumpfen Schere aus der Mitte des Rippenknorpels ab (ca. 2-3 mm vom Brustbeinkörper entfernt). Berühren und komprimieren Sie die Wunde einige Sekunden lang sanft mit einem feuchten Wattebausch mit Kochsalzlösung, wenn Blutungen auftreten.
  7. Öffnen Sie den Brustkorb vorsichtig vom Schnitt der Rippe B mit vier gebogenen Clips. Jeder gebogene Clip sollte den Zwischenrippenmuskel und die Rippen einhaken, um die Brustwand sanft in vier Richtungen zu spreizen (nämlich oben und dann links, oben dann rechts, links nach unten und rechts nach unten) und ein rechteckiges chirurgisches Fenster zu schaffen.
  8. Haken Sie vorsichtig gegen die linke Lunge und andere benachbarte Gewebe und bedecken Sie den Perikard mit einem weiteren gebogenen Clip, um versehentliche Gewebeschäden während des Eingriffs zu vermeiden.
  9. Legen Sie das Herz frei, indem Sie den dünnen Herzbeutel vorsichtig mit einer Pinzette entfernen. Identifizieren Sie den 1. Ast der linken Hauptkoronararterie (LMCA), der sich normalerweise zwischen der Pulmonalarterie und der linken Ohrmuschel befindet. LMCA und LAD präsentieren sich als oberflächliche, leuchtend rote Linie, die vom Rand der linken Ohrmuschel in Richtung Spitze verläuft.
  10. Verwenden Sie die vorbereitete chirurgische Nadel, um eine offene Ligaturschlaufe zu erzeugen, indem Sie den Seidenstich an einer Stelle unmittelbar distal des 1. Astes der LMCA in Richtung von links zur rechten Seite der LAD einführen und unter die LAD führen, um eine versehentliche Punktion der linken Ohrmuschel zu vermeiden. Mit einer einzigen Naht wird der offene Kreislauf erzeugt. Tupfen Sie vorsichtig die Oberfläche des Herzens ab, um die Koronararterien sichtbar zu machen, wenn der LAD unsichtbar ist, weil Flüssigkeit oder Blut die Herzoberfläche bedeckt.
  11. Halten Sie eine Seite der Naht fest und trennen Sie die Nadel vorsichtig mit einem Nadelhalter von der Naht.
  12. Führen Sie die beiden Enden der Seidennaht auf der einen Seite der offenen Schlaufe in den Kreis auf der anderen Seite ein, um eine Schlingenschlaufe zu bilden.
  13. Führen Sie die beiden Enden der Seidennaht des Snare-Loops in den vorbereiteten Snare-Controller ein, bevor Sie den Loop schließen.
  14. Schieben Sie den Snare-Loop-Controller entlang der Seidennaht, während Sie die Seide vorsichtig dehnen, um die Snare-Schlaufe zu schließen. Stoppen Sie den koronaren Fluss des LAD, um eine vorübergehende Myokardischämie für 1 Stunde zu induzieren.
  15. Halten Sie die Seide fest, um die Position des Snare-Loop-Controllers mit einer Kelly-Pinzette zu fixieren, sobald der Loop sicher gebunden ist. Legen Sie das andere Ende der Kelly-Pinzette während der LAD-Ligatur auf den OP-Tisch.
  16. Decken Sie das chirurgische Fenster während der LAD-Ligatur mit salzhaltigen, nassen Wattebällchen ab.
  17. Öffne die Kelly-Pinzette.
  18. Lassen Sie den Snare-Loop-Controller für die Reperfusion des Koronarflusses für 2 h los.
  19. Untersuchen Sie das Herz entlang der Basis und der Gefäßränder sorgfältig und vermeiden Sie es, das Gewebe zu greifen.
    HINWEIS: Euthanasieren Sie die Ratte mit CO2 bei einer Flussrate von 40 % Käfigvolumen/min.

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Ergebnisse

Am Ende der myokardialen Ischämie und Reperfusion sollte die Qualität der LAD-Ligatur vor weiteren biochemischen oder molekularen Analysen beurteilt werden.

Die Suffizienz der LAD-Okklusion durch Ligatur wurde durch Injektion von 1 ml 2%igem Evan-Blau-Farbstoff durch den zentralen Venenkatheter bestimmt. Dann wurde das Myokard mit koronarer Perfusion blau gefärbt, verglichen mit der nicht perfundierten Region, die rot blieb (Abbildung 1A). Der rote Bereich ist der...

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Diskussion

Das vorgeschlagene Protokoll weist mehrere charakteristische Merkmale auf, wie z. B. die Identifizierung der genauen Position für die LAD-Ligatur, die Entwicklung eines Geräts zur Steuerung einer Schlingenschleife in einer einzigen Naht und die Unterstützung eines modifizierten chirurgischen Manövers zur Reduzierung von Gewebeschäden, wodurch die Forscher in die Lage versetzt werden, die LAD genau, sicher und konsistent zu ligieren und den Zustand der Schlingenschleife für die akute myokardiale IR-Forschung sofort zu kon...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.

Danksagungen

Dieses Modell wurde mit finanzieller Unterstützung des taiwanesischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie entwickelt (MOST 109-2320-B-030-006-MY3).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Evan' s blauSigma AldrichE2129
PinzetteShinva
PentobarbitalSigma Aldrich1507002
SkalpellklingenShinvas2646
SkalpellgriffeShinva
SeidennähteSharpointTMDC-2150N
Chirurgische NadelAnchorTM
Lösung aus Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)SolarbioT8170-1
BeatmungsgerätHarvard Beatmungsgerät
für Nagetiere

Referenzen

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