Methodenartikel

Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

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DOI:

10.3791/63925

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17. Februar 2023

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1Division of Pulmonary Critical Care Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Engineering Management, Whiting School of Engineering, Johns Hopkins University

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Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die Etablierung eines infektiösen Modells der Lungenentzündung bei Mäusen und die entsprechende Charakterisierung der Verletzungsauflösung sowie Methoden zur Züchtung von Bakterien und zur intratrachealen Instillation. Ein neuartiger Ansatz mit Hilfe der hochdimensionalen Durchflusszytometrie zur Bewertung der Immunlandschaft wird ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) verursacht eine akute Lungenschädigung, die durch eine schnelle Alveolarschädigung und schwere Hypoxämie gekennzeichnet ist. Dies wiederum führt zu einer hohen Morbidität und Mortalität. Derzeit gibt es keine präklinischen Modelle, die die Komplexität des menschlichen ARDS rekapitulieren. Infektiöse Modelle der Pneumonie (PNA) können jedoch die wichtigsten pathophysiologischen Merkmale von ARDS replizieren. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Modell von PNA, das durch die intratracheale Instillation von lebenden Streptococcus pneumoniae und Klebsiella pneumoniae in C57BL6-Mäusen induziert wurde. Um das Modell zu evaluieren und zu charakterisieren, führten wir nach der Induktion von Verletzungen serielle Messungen des Körpergewichts und der bronchoalveolären Lavage (BAL) zur Messung von Markern für Lungenverletzungen durch. Darüber hinaus haben wir Lungen für die Zellzahl und Differentiale, die Quantifizierung von BAL-Proteinen, Cytospin, die Anzahl der bakteriellen koloniebildenden Einheiten und die Histologie entnommen. Zuletzt wurde eine hochdimensionale Durchflusszytometrie durchgeführt. Wir schlagen dieses Modell als Werkzeug vor, um die Immunlandschaft während der frühen und späten Auflösungsphasen von Lungenschäden zu verstehen.

Einleitung

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist nach wie vor ein häufiges letales und behinderndes Syndrom, von dem etwa 10 % der Patienten auf der Intensivstation (ICU) und bis zu 23 % der Personen unter mechanischer Beatmung betroffen sind, was zu einer Sterblichkeitsrate im Krankenhaus von 35 % bis 46 % führt1. Darüber hinaus hat die jüngste COVID-19-Pandemie erneut betont, wie wichtig es ist, ARDS zu studieren. COVID-19-positive Fälle haben zu einem Anstieg der ARDS-Mortalität geführt, was die Einschränkungen pharmakologischer Therapien verdeutlicht2.

Beim Menschen ist das ARDS gekennzeichnet durch das rasche Einsetzen einer Hypoxämie (PaO2/FiO2 < 300) und den Nachweis eines nicht-hydrostatischen bilateralen Lungenödems aufgrund einer übermäßigen alveolär-kapillären Permeabilität und Alveolitis3. Obwohl ARDS traditionell als ein Muster einer akuten Lungenschädigung (ALI) beschrieben wird, die auf eine Vielzahl von Beleidigungen zurückzuführen ist, gehört die bakterielle und virale Lungenentzündung (PNA) nach wie vor zu den häufigsten Ursachen. Es wurden drei pathophysiologische Hauptstadien beschrieben, nämlich das exsudative, das proliferative und das fibrotische Stadium, während die beiden Hauptmerkmale des ARDS die dysregulierte Entzündung und die alveolokapilläre Störung sind4. Während dieser Prozesse wird eine Alveolarverletzung durch die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen (z. B. Tumornekrosefaktor [TNF-α], Interleukin [IL-1β, IL-6, IL-8 usw.]), einen Einstrom von Neutrophilen und entzündlichen Makrophagen und die Überflutung von proteinreicher Flüssigkeit hervorgerufen. Letztendlich führen diese Ereignisse zu lückenhaften und beidseitigen Alveolarschäden 5,6,7,8.

Obwohl bedeutende Fortschritte beim Verständnis von frühen Lungenschäden und Entzündungen erzielt wurden, sind die Mechanismen, die der Auflösung von PNA zugrunde liegen, weniger bekannt und sollten im Mittelpunkt zukünftiger mechanistischer Untersuchungen stehen. Das Hauptziel dieser Methodenarbeit ist es, den Forschern ein Modell zur Verletzungsauflösung der infektiösen Pneumonie zur Verfügung zu stellen, das die wichtigsten pathophysiologischen Merkmale von ARDS replizieren kann. Wir schlagen vor, dass dieses Modell dazu beitragen wird, die biologischen Mechanismen, die der Auflösung von Lungenentzündungen und -reparaturen zugrunde liegen, besser zu verstehen und somit als Plattform für Rettungstherapeutika zu dienen.

Die wichtigsten physiopathologischen Stadien, die während der ARDS auftreten, können in präklinischen Tiermodellen der ALI repliziert werden, die einen histologischen Nachweis einer Entzündungsreaktion, einer Gewebeverletzung, einer physiologischen Dysfunktion, einer Alveolitis und einer Veränderung der Alveolen-Kapillar-Schranke enthaltensollten 9. Ein Mausmodell, das PNA und ALI induziert, ist aufgrund seiner hohen Reproduzierbarkeit, schnellen Züchtung und der Verfügbarkeit mehrerer Werkzeuge zur Durchführung mechanistischer und molekularer Studien von Vorteil. Es gibt kein einzelnes Modell, das alle Merkmale des menschlichen ARDS9 vollständig rekapituliert.

Modelle von PNA bei Mäusen ermöglichen die Replikation der wichtigsten pathophysiologischen Mechanismen, die durch infektiöse ARDS beim Menschen hervorgerufen werden, wie z. B. das schnelle Auftreten, der Nachweis von Gewebeverletzungen in der Histologie, die Beeinträchtigung der Alveolokapillarbarriere, der Nachweis einer Entzündungsreaktion und der physiologischen Dysfunktion, während sie zu einer bescheidenen Mortalität führen10 . Infektiöse Modelle können durch lokale oder systemische Verabreichung des Erregers induziert werden, wobei die intranasale, intratracheale und intravenöse Verabreichung die häufigsten Verabreichungswege sind. Der intratracheale Weg ermöglicht die direkte Inokulation des Infektionserregers in die Lunge, wodurch die Aerosolisierung verringert und die Abgabe optimiertwird 11,12.

Die Methodik für ein präklinisches Mausmodell der PNA durch intratracheale Instillation von lebenden Streptococcus pneumoniae (Spn) oder Klebsiella pneumoniae (Kp) wird hier beschrieben. Diese Modelle stellen einen guten Ersatz für ARDS dar, das durch bakterielle PNA produziert wird, und besitzen mehrere Vorteile, darunter: häufige Ursachen von humanem PNA-ARDS (in der Gemeinschaft und im Krankenhaus erworben); hohe Reproduzierbarkeit; Mortalität und Verletzungen können leicht titriert werden (Modellierung verschiedener Grade von Lungenentzündungen), um eine robuste Entzündungsreaktion zu zeigen, die zu Alveolitis und alveolokapillärer Dysfunktion führt; die Bewertung der frühen und späten Phasen der Lungenverletzung und des Abklingens; und die Evaluierung therapeutischer Strategien in verschiedenen Stadien des PNA-ARDS.

Protokoll

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (ACUC) an der Johns Hopkins University, School of Medicine, für das Tierprotokoll MO21M160 genehmigt. Darüber hinaus wurden die Versuche nach den institutionellen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften für Tierversuche durchgeführt.

VORSICHT: Die Replikation aller unten beschriebenen Protokolle muss in einer Schrank der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt werden, wobei alle institutionellen BSL-2-Richtlinien der Biosicherheitswerkbank einzuhalten sind.

1. Beschichtung von Bakterienbeständen aus kommerziellen Kreisläufen

HINWEIS: Dieses Protokoll kann für die Züchtung von Bakterienstämmen für Spn (ATCC 49619) und Kpn (ATCC 43816) verwendet werden, beginnend mit den vom Anbieter erhaltenen Kulti-Schleifen (siehe Materialtabelle für Details).

  1. Eine 5%ige Agarplatte aus Schafsblut 15 min bei 37 °C in einem Inkubator erwärmen. Hierfür kann ein Zellinkubator verwendet werden.
  2. Entfernen Sie unter der Haube die Hülle aus der bakteriellen Impfschlaufe und verteilen Sie sie vorsichtig, indem Sie sie in einem Zick-Zack-Muster in die Agarplatte einstreichen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit einer separaten Platte als Duplikat. Bis zu fünf Platten können mit der gleichen Schlaufe durchstreift werden.
  3. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C, um ein optimales Bakterienwachstum zu erzielen. Lassen Sie die Bakterien 3 Tage lang täglich passieren. Erwärmen Sie die Blut-Agar-Platten für 15 min bei 37 °C, entnehmen Sie mit einer Einweg-Impfschlaufe zwischen 15 und 20 Kolonien aus der ersten Agar-Platte und verteilen Sie sie auf eine neue, vorgewärmte Agarplatte. Beschriften Sie die Platte entsprechend.

2. Bakterienwachstum und Lagerung für die zukünftige Verwendung

  1. Nach 3 Tagen entnehmen Sie bis zu 30 Kolonien von der Blutagarplatte mit einer Schlaufe und geben Sie sie direkt in einen 250-ml-Kolben mit Todd Hewitt Brühe (TH-Brühe). Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 250 U/min mit 5 % CO2 für ca. 4 h.
  2. Nehmen Sie alle 15 Minuten Aliquots, um den OD620 nm zu messen, bis er 0,3 erreicht, was etwa 3 x 108 koloniebildenden Einheiten (KBE) pro ml entspricht.
  3. Aliquotieren Sie 1 ml des neuen Bakterienbestands sofort in 2 ml-Kryofläschchen. Die frisch aliquotierten Fläschchen 5 Min. in flüssigem Stickstoff schockfrosten. Lagern Sie die Aliquoten der Bakterien in einem Gefrierschrank bei -80 °C (die Fläschchen können bis zu 6-8 Monate verwendet werden, bevor sie ihre Wirksamkeit verlieren).
  4. Nach 7 Tagen Einfrieren können die Aliquots für Tierversuche verwendet werden. Bestimmen Sie daher die neue Konzentration der Bakterien.

3. Auftauen von Bakterien für die intratracheale Instillation

  1. Eine Blut-Agar-Platte 10 min bei 37 °C in einem Shaker erwärmen. Nehmen Sie eines der neuen Vorratsfläschchen aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es unter leichtem Rühren im 37 °C warmen Wasserbad ca. 2 min auf. Vermeiden Sie es, den O-Ring oder die Kappe mit dem warmen Wasser zu berühren.
  2. Platte auf einer Blutagarplatte zum manuellen Zählen der Bakterienkolonien. Führen Sie eine Verdünnung von 1 x 10-6 durch und geben Sie 200 μl von der letzten Verdünnung in eine vorgewärmte Blutagarplatte. Tun Sie dies in Duplikaten.
  3. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C, um ein optimales Wachstum der Bakterien zu erzielen. Am nächsten Tag wenden Sie die folgende Formel an, um die neue Bakterienkonzentration zu bestimmen: KBE/ml = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen der Platte

4. Intratracheale Instillation von lebenden Bakterien

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde optimiert, um ein Volumen von 50 μl intratracheal zu instillieren. Bakterienvorräte können bis zu 6-9 Monate gelagert werden. Um sicherzustellen, dass die bakterielle KBE in jedem Fläschchen vorhanden ist, stellen Sie sicher, dass es vor jedem Experiment plattiert wird, berechnen Sie die bakterielle KBE wie oben beschrieben und verwenden Sie TH-Bouillon für nachfolgende Verdünnungen.

ACHTUNG: Führen Sie unter der Biosicherheitswerkbank ein Überlebensverfahren für Nagetiere mit sterilen chirurgischen Instrumenten durch.

  1. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 2,5 mg/kg Acetylpromazin. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Anzahl der Mäuse, die gleichzeitig injiziert werden.
    HINWEIS: Mäuse können Isofluran ausgesetzt werden, um den Umgang mit den Tieren zu erleichtern. Ein erfahrener Handler, der in der Lage ist, intraperitoneale Anästhetika zu injizieren, ohne die Tiere erheblich zu belasten, kann jedoch eine Isofluran-Exposition vermeiden. Die Anzahl der zu injizierenden Mäuse hängt von der Expertise des Chirurgen ab.
  2. Nachdem alle Mäuse unter angemessener Narkose stehen, bestätigen Sie die Anästhesie durch Schwanzkneifen. Legen Sie die betäubte Maus auf eine saubere und sterilisierte Oberfläche, hängen Sie das Tier an den Schneidezähnen auf und kleben Sie die Vordergliedmaßen vorsichtig ab (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Um das Wohlbefinden der Tiere zu gewährleisten, sorgen Sie bei allen anästhesierten Tieren für eine Hornhautschmierung. Es können Carboxymethylcellulose-Augentropfen verwendet werden, wobei ein Tropfen pro Auge aufgetragen wird.
  3. Rasieren Sie die Halsregion und desinfizieren Sie die Stelle mit Chlorhexidin und 70% Alkohol. Führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1 cm langen oberflächlichen Schnitt an der Mittellinie des Halses durch, um die Luftröhre sichtbar zu machen (Abbildung 1B). Ein kleiner Schnitt sollte ausreichen, aber wenn viel Fettgewebe zu sehen ist, präparieren Sie das Fettgewebe vorsichtig vertikal, um die Luftröhre sichtbar zu machen.
    HINWEIS: Verwenden Sie sterile Handschuhe und sterile Instrumente mit der Nur-Tipps-Technik. Das Infektionsrisiko ist minimal, wenn der Eingriff unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird.
  4. Intubieren Sie jede Maus mit einer Pinzette. Ziehen Sie die Zunge vorsichtig nach außen und führen Sie einen 20 G Angiokatheter durch den Mund ein, wodurch der Katheter in die Luftröhre vorgeschoben wird. Üben Sie sanften Druck auf die Luftröhre aus, um die Intubation zu erleichtern.
    HINWEIS: Da sich die Luftröhre vor dem Mauskörper befindet, beugen Sie die Spitze des Katheters leicht, da dies dazu beiträgt, den Winkel für eine erfolgreiche Intubation der Maus zu erhalten. Der Halsschnitt wird hauptsächlich zu Visualisierungszwecken durchgeführt; Alternativ kann der Bediener die Luftröhre blind intubieren.
  5. Schließen Sie die Maus nach der Intubation an ein Beatmungsgerät an, um die Intubation zu bestätigen. Die regulären Beatmungsparameter, die bei diesem Verfahren verwendet werden, sind 200 μl Hubvolumen und 200 Hübe pro Minute. Drehen Sie die Beatmungsrate kurz nach oben und/oder unten, um eine schnelle und einfache Bestätigung zu erhalten.
  6. Trennen Sie die Maus nach Bestätigung der Intubation vom Beatmungsgerät und injizieren Sie vorsichtig 50 μl des bakteriellen Erregers durch den Angiokatheter mit einer 200 μl Pipettengelladespitze. Bei Kontrollmäusen sind 50 μl sterile TH-Brühe zu injizieren.
  7. Nachdem Sie den bakteriellen Erreger eingeflößt haben, schließen Sie die Maus wieder an die Atemschutzmaske an, um die Atmung wieder aufzunehmen. Lassen Sie die Maus 30-60 Sekunden lang auf der Atemschutzmaske. Überwachen Sie nach der Injektion aller Mäuse ihre Atmung. Wenn es ein langsames Atemmuster gibt, schließen Sie die Mäuse wieder an die Atemschutzmaske an.
  8. Schließen Sie den Schnitt, indem Sie einen kleinen Tropfen Kleber auf die Haut auftragen. Bringen Sie die Hautfalten zusammen und üben Sie leichten Druck aus, bis der Kleber getrocknet ist.
  9. Legen Sie die Mäuse zur Genesung auf ein Heizkissen und überwachen Sie sie genau, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt haben. Setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig um, sobald sie vollständig genesen sind. Zur postoperativen Schmerz-/Stressbehandlung können die Mäuse mit Buprenorphin mit einer Dosis von 0,05-0,1 mg/kg subkutan (SC) behandelt werden.
    HINWEIS: Tiere mit einem Gewichtsverlust von mehr als 20 % oder erheblichen Beschwerden nach dem Eingriff wie Lethargie, Unfähigkeit, Wasser oder Nahrung zu erreichen, Atembeschwerden, beeinträchtigte Reaktion auf äußere Reize oder verminderte geistige Wachsamkeit sollten eingeschläfert werden.

5. Bronchoalveoläre Lavage und Lungenentnahme

  1. Euthanasieren Sie die Maus, indem Sie sie in einen geschlossenen Behälter mit 5 % Isofluran legen. Setzen Sie die Isofluran-Exposition für 1 Minute fort, nachdem die Maus aufgehört hat zu atmen. Führen Sie eine Thorakotomie durch, um die Sterbehilfe zu bestätigen.
    HINWEIS: Bestätigen Sie die Euthanasie durch visuelle und körperliche Untersuchung. Das Herz muss aufgehört haben zu schlagen und die Mäuse nicht mehr atmen. Die Schleimhäute sollten weiß oder blass sein.
  2. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein sauberes OP-Brett und hängen Sie sie an den Schneidezähnen auf. Besprühen Sie die Maushaut mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen kleinen oberflächlichen Schnitt in der Mittellinie des Halses, um die Luftröhre der Maus sichtbar zu machen.
  3. Kanülieren Sie die Luftröhre mit einem 20 G Katheter. Geben Sie vorsichtig 1 ml kalziumfreie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) intratracheal mit einer 1 ml-Spritze hinzu. Lassen Sie die Lunge vollständig expandieren und saugen Sie dann die Flüssigkeit mit derselben Spritze ab. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 2 ml.
  4. Übertragen Sie das BAL in ein 2 mL Aliquot. Führen Sie diesen Schritt zweimal für ein Endvolumen von 2 ml durch. Spülen Sie die Lunge nicht mit mehr als 1 ml auf einmal, da das Risiko einer Störung des Alveolarraums hoch ist.
  5. Öffnen Sie die Brusthöhle und legen Sie Lunge, Herz und Luftröhre mit Schere und Pinzette frei. Präparieren Sie vorsichtig das Zwerchfell und entfernen Sie den Brustkorb. Achten Sie darauf, das Lungengewebe nicht einzuklemmen.
  6. Die Bauchschlagader durchschneiden, um eine Ausblutung zu ermöglichen. Persolidieren Sie das Lungengewebe, indem Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt von ca. 2 mm in den rechten Ventrikel vornehmen und 5 ml kaltes PBS mit einem 20-g-Katheter injizieren. Das PBS sollte die Lunge perfundieren. Wenn eine ausreichende Perfusion durchgeführt wird, wird das Lungengewebe weiß blass und das PBS verlässt das intravaskuläre Kompartiment durch die Bauchaorta.
  7. Entnehmen Sie vorsichtig die Lunge und präparieren Sie sie aus der Luftröhre, um entweder eine Histologie oder eine Weiterverarbeitung zur Einzelzellsuspension durchzuführen.
  8. Bei der Verarbeitung für die Histologie führen Sie vorsichtig einen 20-G-Katheter ein, um die Lunge bis zu 25 cm H2O mit Formalinlösung (neutral gepuffert 10%) aufzublasen. Sobald die Lunge insuffliert ist, führen Sie einen etwa 5 cm langen Nahtfaden 3.0 unter der Luftröhre durch und binden Sie ihn zweimal fest, um sicherzustellen, dass das Formalin im Lungengewebe bleibt. Präparieren Sie vorsichtig die Lunge vom Rest des Gewebes und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 ml Formalinlösung.

6. Verarbeitung der bronchoalveolären Lavage

  1. Zentrifugieren Sie den BAL bei 500 x g bei 4 °C für 5 min. Den zellfreien Überstand in einem separaten Röhrchen entfernen und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Weitere Analysen können im BAL-Überstand durchgeführt werden, einschließlich Proteinquantifizierung (z. B. BCA-Assay13) oder Messung spezifischer Biomarker oder Zytokine (ELISA-Assays und mehrere Assays mit Plattformen wie MSD und Luminex).
  2. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie 100 μl Lysingpuffer für 1 Minute hinzufügen. Neutralisieren Sie die Lysingreaktion durch Zugabe von 1 ml PBS. Zentrifugieren Sie den BAL bei 500 x g bei 4 °C für 5 min und entfernen Sie den Überstand.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS (100-300 μl; basierend auf der Zellpelletgröße). Führen Sie eine Zellzählung mit 0,4 % Trypanblau-Färbung durch manuelle oder automatisierte Zellzählung durch. Verwenden Sie das verbleibende Pellet für die Durchflusszytometrie-Färbung und/oder Kryokonservierung (durch Resuspendieren in Kryokonservierungslösung) in flüssigem Stickstoff für weitere Tests.

7. Lungenaufbereitung für Einzelzellsuspension

  1. Trennen Sie die Lunge vorsichtig vom restlichen Gewebe und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml kaltem PBS. Entferne die Lunge von PBS und trockne sie mit einem Papiertuch ab.
  2. Bereiten Sie einen Verdauungscocktail vor, indem Sie 1 mg DNase und 5 mg Kollagenase in 1 ml glukosearmes Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) geben. Übertragen Sie die Lunge in ein C-röhrchen mit 1 ml Verdauungscocktail.
  3. Übertragen Sie den C-Schlauch in den Gewebedissoziator und befolgen Sie das standardisierte Protokoll für die Verarbeitung von Lungengewebe14.
  4. Geben Sie 10 mL kaltes PBS in das C-Röhrchen und mischen Sie es gut. Filtrieren Sie die Einzelzellsuspension mit einem 70-μm-Zellsieb auf einem konischen 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die Filtration zweimal durch.
  5. Die Suspension bei 500 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig dekantieren und 1 ml Lysingpuffer 1 Minute lang bei Raumtemperatur zugeben. Fügen Sie 10 ml kaltes PBS hinzu, um die Lysereaktion zu stoppen und den Überstand zu entfernen.
  6. Die Suspension bei 500 x g bei 4 °C 5 min zentrifugieren. Den Überstand vorsichtig dekantieren und 10 mL kaltes PBS hinzufügen.
  7. Führen Sie eine Zellzählung mit Trypanblau-Färbung durch manuelle oder automatisierte Zellzählung durch. Verwenden Sie ein Zellpellet für die Durchflusszytometrie-Färbung und/oder Kryokonservierung in flüssigem Stickstoff für weitere Tests.

Ergebnisse

Die oben beschriebenen Verfahren ermöglichten es, die pathophysiologischen Mechanismen zu modellieren, die einer bakteriellen Lungenentzündung bei Mäusen zugrunde liegen. Um mit der Modellierung zu beginnen, wurden C57BL/6-Wildtyp-Mäuse (WT) aus dem Jackson Laboratory gewonnen und in der Tiereinrichtung des Instituts gezüchtet. Männliche WT C57BL/6 Mäuse, 8 Wochen alt, wurden intratracheal entweder mit TH-Bouillon (Kontrolle), 3 x 106 KBE lebendem Spn oder 200 KBE lebendem Kpn geimpft. Nach der Infektion wurden die Mäuse 6 bzw. 10 Tage lang auf Spn bzw. Kpn überwacht. Obwohl die infizierten Gruppen im Vergleich zur nicht infizierten Kontrolle ein geringeres Körpergewicht aufwiesen, erholte sich das Körpergewicht der Spn-Gruppe zum Ausgangswert, während Kpn-infizierte Mäuse nach 6 Tagen der Infektion eine langsame Genesung zeigten (Abbildung 2A). Während der Dauer der Studie mussten keine Mäuse aufgrund eines Körpergewichts von über 20 % eingeschläfert werden, und es gab keine Hinweise auf Schmerzen und Beschwerden.

Wir haben die Lungenschädigung über verschiedene Intervalle gemessen. Die BAL-Proteinkonzentration und die Gesamtzellzahl sowohl für die BAL als auch für die Lunge waren in den infizierten Gruppen deutlich höher (Abbildung 2). Repräsentative histologische Schnitte, die den Entzündungsprozess in beiden Modellen zeigen, wurden an Tag 2, 4 und 6 nach der Inokulation erhalten (Abbildung 3), die Hinweise auf eine anhaltende alveoläre Entzündung bei den Kpn-infizierten Mäusen (Abbildung 4) auch an Tag 10 zeigen. Kpn-infizierte Mäuse setzten die Schädigung bis zum 10. Tag fort (Abbildung 2 und Abbildung 4), während Spn-infizierte Mäuse die Lungenentzündung bis zum 6. Tag abbildeten (Abbildung 2 und Abbildung 3).

Lungeneinzelzellsuspensionen wurden verwendet, um die Immunlandschaft durch hochdimensionale Durchflusszytometrie am Tag 6 nach der Infektion im Spn-Modell unter Verwendung eines 18-Farben-Panels in der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu unterscheiden. Mit Hilfe der t-verteilten stochastischen Nachbareinbettung (t-SNE) können allgemeine Unterschiede in der Zusammensetzung der Immunzellen sichtbar gemacht werden, die sich durch eine erhöhte Anzahl von Granulozyten (CD45+, CD11b+, CD24+, MHC-II-), interstitiellen Makrophagen (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-), Monozyten (CD45+, CD11b+, MHC-II-, CD24-, CD64-), B-Zellen (CD45+, CD19+) und T-Zellen (CD45+, CD3+), einschließlich natürlicher Killerzellen (CD45+, CD3+, NK1.1+), bemerkenswert erklären. wie in Abbildung 5 dargestellt. Gating-Strategien sind in Abbildung 6 dargestellt.

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Abbildung 1: Chirurgisches Vorgehen zur intratrachealen Instillation lebender Bakterien. (A) Position der Maus im sterilen Operationsbereich, hängend an den Schneidezähnen. (B) Exposition des Inzisionsbereichs und der Luftröhre. (C) Intubationsprozess durch Einführen des 20-g-Katheters. Mit Biorender.com erstellte Figur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Profile der akuten Lungenschädigung (ALI) nach Pneumoniemodellen. (A) Körpergewicht im Zeitverlauf im Vergleich zum Ausgangswert, Kontrolle versus Kpn und Spn (n = 4, pro Gruppe). (B) Quantifizierung des BAL-Gesamtproteins durch BCA-Assay (n = 4, pro Gruppe). (C) BAL-Gesamtzellzahlen in der Kontrolle (n = 3), Kpn (n = 4) und Spn (n = 3). (D) Gesamtzellzahlen der Lunge bei Kontrolle (n = 3), Kpn (n = 4) und Spn (n = 3). (E-G) BAL-Zelldifferenzierung durch manuelle histologische Zählung des BAL-Zytospins in der Kontrolle (n = 3), Kpn (n = 4) und Spn (n = 3). Statistische Tests wurden durch individuelle t-Tests durchgeführt, wobei die nicht infizierte Kontrolle mit den infizierten Gruppen verglichen wurde. *p < 0,05. Die Daten werden mit dem Standardfehler (SE) für jedes Diagramm angezeigt. Die y-Achse zeigt für alle Panels die Tage nach der Infektion. Abkürzungen: BAL = bronchoalveoläre Lavage; Spn = Streptococcus pneumoniae; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Histopathologische Befunde der Lunge während der Spn-Infektion . Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von histologischen Schnitten eines repräsentativen BAL- und Lungenschnitts nach der intratrachealen Infektion von Spn und an den Tagen 2, 4 und 6. BAL-Vergrößerung = 100x; Lungenvergrößerung = 10x. Abkürzungen: BAL = bronchoalveoläre Lavage; Spn = Streptococcus pneumoniae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Histopathologische Befunde der Lunge während einer Kpn-Infektion . Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von histologischen Schnitten eines repräsentativen BAL- und Lungenschnitts nach der intratrachealen Infektion von Kpn an den Tagen 2, 4, 6 und 10. Die Bilder zeigen eine hohe Vergrößerung (Maßstabsbalken = 50 μm). Abkürzungen: BAL = bronchoalveoläre Lavage; Kpn = Klebsiella pneumoniae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: Immunzelllandschaft mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie nach 6 Tagen Spn-Infektion . (A) Die T-verteilte stochastische Nachbarneinbettung (t-SNE) wurde verwendet, um die Immunzellpopulationen (CD45+) der Lunge zu visualisieren und die nicht infizierte Kontrollgruppe mit der infizierten Gruppe zu vergleichen. (B) Zusammenfassung der Immunzellfrequenzen aus der Gesamtzahl der CD45+-Zellen in der Lunge. (C) Gesamtzellzahl jeder einzelnen Population. Statistische Vergleiche wurden durch t-Tests zwischen der Kontrolle und den Infizierten durchgeführt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Die Daten werden mit dem Standardfehler (SE) für jedes Diagramm angezeigt. Abkürzungen: BAL = bronchoalveoläre Lavage; Spn = Streptococcus pneumoniae. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Gating-Strategien zur Identifizierung der Immunzell-Subpopulation in der Lunge zu Studienbeginn und nach Lungenentzündung. BAL und Lungenzellsuspension wurden für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie gefärbt. Die Trümmer wurden zuerst mit SSC-A und FSC-A abgegrenzt, und die einzelnen Zellen wurden mit zwei Strategien (SSC-W vs. SSC-H und FSC-W vs. FSC-H) abgeschirmt. Die Identifizierung lebender Zellen erfolgte unter Verwendung eines Lebend/Tot-Diskriminators gegenüber SSC-A. Nachfolgende Zellpopulationen wurden durch zuvor identifizierte Marker identifiziert 15. Abkürzung: BAL = bronchoalveoläre Lavage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

Experimentelle Mausmodelle von PNA bieten eine Plattform, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu bewerten, die der Schädigung und Auflösung von ARDS zugrunde liegen. Zu den pathophysiologischen Komponenten, die bewertet werden können, gehören frühe Entzündungswege, bakterielle Clearance, dynamische Veränderungen der Immunlandschaft, Auflösung von Entzündungen, Fibroproliferation sowie epitheliale und vaskuläre Reparatur16. Bei der Planung der Replikation dieses Modells der durch Lungenentzündung induzierten Lungenschädigung müssen jedoch mehrere Aspekte berücksichtigt werden, darunter Alter, Geschlecht, Mausstamm, intrinsische Wirtsfaktoren (z. B. immungeschwächter Zustand), die verwendete spezifische Erreger- und Bakterienlast und die Erfahrung des Personals, das den Eingriff durchführt.

PNA gehört zu den Hauptursachen für ARDS. Wir entschieden uns für die Verwendung von lebendem Spn und Kpn, die bei Menschen jeweils häufig als Ursache für ambulant bzw. im Krankenhaus erworbene PNA auftreten17. Wir schlagen vor, bakterielle Modelle von PNA zu optimieren, indem Dosen lebender Bakterien titriert werden, um das gewünschte Mortalitäts- und Verletzungslösungsprofil zu erreichen, das am besten zur Hypothese des Prüfarztes passt. Wir haben eine intratracheale Bakterieninokulation von 3 x 106 KBE für Spn und 200 KBE für Kpn bei Mäusen optimiert, die eine alveoläre Entzündung, eine Störung der alveolokapillären Barriere und eine Organdysfunktion verursachte (Abbildung 2). Bakterienchargen aus unterschiedlichen Quellen oder sogar innerhalb doppelter Schleifen können jedoch unterschiedliche Entzündungs- und Verletzungsgrade aufweisen, selbst wenn derselbe Stamm und dieselbe KBE verwendet werden.

Um die in diesem Manuskript vorgestellten Ergebnisse zu replizieren, sollten Forscher daher mit der hier beschriebenen Bakterienkonzentration beginnen. Es kann jedoch sein, dass sie die Dosis erhöhen oder verringern müssen, um ein ähnliches Modellprofil zu erhalten. Daher muss jede neue Charge von Bakterien, die verwendet wird, auf ihre potenzielle Wirkung bei der Verletzungsauflösung optimiert werden. Wir präsentieren ein robustes Modell der PNA mit zwei unterschiedlichen Auflösungsergebnissen, einem selbstauflösenden (Spn) und einem langsam/nicht auflösenden (Kpn), das als Plattform für Forscher dienen kann, um immunologische Mechanismen zu evaluieren und therapeutische Interventionen zu testen, insbesondere bei oder nach dem Höhepunkt der Infektion (z.B. 2 Tage nach der Infektion).

Alter, Geschlecht, Stamm und genetische Faktoren beeinflussen die Kinetik der Verletzungslösungsmuster16. Zum Beispiel führt das Geschlecht bei Frauen im Vergleich zu Männern zu einer beschleunigten Auflösung18; Daher führt eine Zunahme der bakteriellen Belastung bei Männern im Vergleich zu Frauen zu einer erhöhten Mortalität und verzögerten Auflösung. Das Altern ist ein weiterer Faktor, der bei der Titration der KBE der verwendeten Bakterien zu berücksichtigen ist. Alternde Mäuse zeigten eine Mortalität von 100 %, wenn wir die angegebene Spn-Dosis verwendeten (hier nicht gezeigt). Junge Mäuse werden am häufigsten in den Pneumokokken-PNA-Modellen verwendet (im Bereich von 6 bis 14 Wochen), während gealterte Mäuse (19-26 Monate alt) eine veränderte Immunantwort zeigen und zur Untersuchung der Rolle des Alterns bei PNA verwendet werden11 . Wir mussten die KBE auf 300 % senken, um das Überleben bei alternden Tieren zu erreichen (hier nicht gezeigt). In dieser Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse (8-12 Wochen alt) verwendet und 6 bis 10 Tage nach der Infektion beobachtet. Signifikante Unterschiede in der Anfälligkeit können auch zwischen den Stämmen gefunden werden; Inzuchtstämme wie BALB/C und C57BL6/J reagieren unterschiedlich auf eine Infektion11,19.

Die direkte intratracheale Inokulation von Bakterien ermöglicht eine präzisere Abgabe des Inokulums (bis zu 99%) in die Lunge12, was eine Alternative für weniger virulente Serotypen darstellt und die Aerosolisierung von Bakterien verringert11. Es kann jedoch argumentiert werden, dass es sich um ein invasives Verfahren handelt. Die Intubation kann eine Herausforderung darstellen, eine systemische Anästhesie erfordern und zu einem Trachealtrauma mit anschließendem Atemwegsödem und Stridor führen. Mäuse können einen vasovagalen Reflex entwickeln, der zu Apnoe führt, für den ein kleines Mausbeatmungsgerät erforderlich ist, um bei Bedarf zusätzliche Unterstützung durch das Beatmungsgerät zu bieten. Das Fachwissen des Chirurgen, der den Eingriff durchführt, ist eine entscheidende Komponente, um eine erfolgreiche Intubation zu gewährleisten11. In unserer Studie mussten keine Mäuse aufgrund der entsprechenden Schmerzbehandlung und eines Gewichtsverlusts von mehr als 20 % eingeschläfert werden. Es wurden keine Anzeichen von Schmerzen und Leiden wie Lethargie, Unfähigkeit, Wasser oder Nahrung zu erreichen, Atembeschwerden oder verminderte geistige Wachsamkeit beobachtet. Alternative Methoden der direkten bakteriellen Abgabe in die Lunge ist die oropharyngeale Aspiration, obwohl die Auflösung der Lungenverletzung schneller zu erfolgen scheint und einige Bakterien im Magen und im Magen-Darm-Trakt enden können20.

Präklinische Modelle von PNA ermöglichen es Forschern, die Immunlandschaft zu bewerten. Bronchoalveoläre und interstitielle Kompartimente können auf dynamische Veränderungen in Immunzellen untersucht werden16. Darüber hinaus können Zellen ex vivo kultiviert und stimuliert werden, um ihre spezifische Produktion von Zytokinen und Chemokinen zu bestimmen. Hier konzentrieren wir uns auf die Erforschung der Immunzelllandschaft in der Lunge und BAL mit Hilfe der Mehrfarben-Durchflusszytometrie. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung kann auch durchgeführt werden, um die zellspezifischen transkriptomischen Signaturen in verschiedenen Stadien der Verletzungsauflösung zu verstehen.

PNA-ARDS-Modelle erzeugen systemische Effekte, die durch die Messung des Körpergewichts im Verlauf der Erkrankung frühzeitig erkannt werden können10. Obwohl wir die systemischen Auswirkungen von ARDS nicht direkt messen, kann die Organdysfunktion auch durch Blutmessung von Chemieprofilen und durch die Entnahme verschiedener Gewebe wie Milz, Niere und Leber für die Histologie beurteilt werden. Systemische Wirkungen von Pneumokokken-PNA-ARDS wurden zuvor von anderen Gruppen beschrieben, die denselben Bakterienstammverwendeten 21.

Hier wird ein Modell der experimentellen PNA beschrieben, das einigen der wichtigsten pathophysiologischen Befunde ähnelt, die dem humanen ARDS zugrunde liegen. Obwohl es keine idealen Modelle gibt, die die Komplexität und Heterogenität von humanem ARDS9 vollständig rekapitulieren, sind diese Modelle relevant und reproduzierbar für die Untersuchung der Mechanismen von Lungenverletzungen und -reparaturen und dienen auch als Plattform für die Identifizierung neuer potenzieller pharmakologischer Ziele, die sich auf die Beschleunigung der Auflösung von Lungenentzündungen und die Förderung der Lungenreparatur konzentrieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch den NIH-Zuschuss R01 HL131812 und R01HL163881 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-200 &Mikro; L Runde 0,5 mm dicke Pipettenspitzen zum GelladenCorning4853
2 mL KryofläschchenCorning Incorporated4314202 mL selbststehend, runder Boden, rote Kappe, Polypropylen
2 mL Eppendorf  Snap-Cap Mikrozentrifuge Biopur Safe-Lock RöhrchenFisherscientific05-402-24CForm:  Rund, Länge (metrisch):  38mm, Durchmesser (metrisch) außen:  10mm, Kapazität (metrisch):  2mL
70 & Mikro; m Cell StrainerFalcon352350Weiß, steril, einzeln verpackt
96-Well, klarer BodenFalcon353077  TC-behandelte Zellkultur-Mikroplatte, mit Deckel, einzeln verpackt, sterile
Acepromizinmaleat-Injektion, USP 500 mg/50 mL (10 mg/ml)PhoenixNDC 57319-604-04JEDER ml ENTHÄLT: Acepromazinmaleat 10 mg, Natriumcitrat 0,36%, Zitronensäure 0,075%, Benzylalkohol 1% und Wasser zur Injektion.
Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysing BufferQualität Biologisch118-156-7214 x 100 mL
Anti-Maus I-A/I-EBiolegend107628APC/Cyanin7 Anti-Maus I-A/I-E [M5/114.15.2]; Isotyp: Ratte IgG2b
BCA-Protein-Assay-KitThermo Scientific23225
BD Trypticase-Soja-Agar BD-Biosciences90001-2765% Schafsblut Prepared Media Stacker Plates, BD Diagnostics
Biotix Einweg-ReagenzreservoireBiotix89511-194
RinderserumalbuminSigma-AldrihA4503
CD103Invitrogen509723Integrin alpha E) Armenischer Hamster Anti-Maus, FITC, Klon: 2E7
CD11bInvitrogenRM2817PE-Texas Red, Klon: M1/70.15, Invitrogen
CD11cBD Biosciences565872Hamster Anti-Maus, APC-R700, Klon: N418, BD Horizon
CD19Biolegend152410APC Anti-Maus CD19 [1D3/CD19]; Isotyp: Ratte IgG2a, κ
CD24BD Biosciences563450Ratte Anti-Maus, Brillantviolett 711, Klon: M1/69
CD4BD Biosciences563790BUV395; Klon: GK1.5
CD45Biolegend103157Brilliant Violet 750 Anti-Maus CD45 [30-F11]; Isotyp: Ratte IgG2b, κ;
CD8aBD Biosciences612759Ratte anti-murine, brillantes Ultraviolett 737, Klon: 53-6,7
Zellzählfolien Bio-rad1450017Für TC20 Cell Counter
Cell Sieb 70 & micro; L NylonFalcon198718REF 352350
Kollagenase Typ1 Worthington Biochemical CorporationLS004197
Culti-Loop Streptococcus pneumoniae Thermo ScientificR4609015ATCC 4961
Desoxyribonuklease I aus der Bauchspeicheldrüse des RindersSigma-AldrihDN25
Einweg-Impfösen/-nadelnFisherbrand22-363-603Farbe blau; Band 1 &Mikro; L
DMEM (Dulbecco' s Modifizierter Adler" Corning10-014-CV
Fc BlockBD Biosciences553142CD16/CD32 Ratte Anti-Maus, Unmarkiert, Klon: 2.4G2
FormalinlösungSigma-AldrihHT501640Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%
Mullschwämme, CovidienCurity2146-gentleMACS
C RöhrchenMACS Miltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS DissoziatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235SN: 4715
Hema 3 Manuelles Färbesystem und Stat PackThermo Scientific
Isofluran Flüssigkeit InhalationHenry Schein1182097
IV KATHETER JELCO 20GX1.25"Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc405611
Ketamin HCl InjektionHenry Schein1049007Ketamin HCl Injektion MDV 100mg/mL 10mL 10/Box
Klebsiella pneumoniae ATCC43816subsp. pneumoniae (Schroeter) Trevisan
Loctite 409ElektronenmikroskopieWissenschaften 7257009
Ly-6CBiolegend128036Brilliant Violet 605 Anti-Maus Ly-6C [HK1.4]; Isotyp: Ratte IgG2c
Ly-6GBD Biosciences740157Ratte Anti-Maus, Brilliant Violet 510, Klon: 1A8, BD Optibuild
MiniVent Type 845Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus4694D-79232 März (Deutschland)
NK-1.1BD Biosciences553165Maus Anti-Maus, PE, Klon: PK136,
BD Phase HämazytometerHausser Scientific1475
Phosphatgepufferte KochsalzlösungCorning21-040-CV1X ohne Calcium und Magnesium,
Sarstedt55.476.305
Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden Falcon352235mit Schnappverschluss für das Zellsieb, 5 mL
SealRite 1,5 mL Natürliches MikrozentrifugenröhrchenUSA Scientific1615-5500Frei von nachweisbarer Rnase, DNase, DNA und Pyrogenen.
Shandon EZ Single CytofunnelEprediaA78710003
Siglec-FBD Biosciences562681Anti-Mouse, Brilliant Violet 421, Klon: E50-2440
Silk Black Braided 30" (75 cm) Steriles, nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial U.S.P.EthiconK-8340 (3,5 metrisch)
Edelstahl-GleitclipEpredia59910052
sterile Einweg-VakuumfiltereinheitenThermo Scientific1660045
Spritze steril, Einmalgebrauch, 1 mLBD-Biosciences309628
TC20 Automatischer ZellzählerBio-Rad508BR05740
TipOne 200 ul gelbe Pipette Nachfüllpackung USAScientific1111-0706
TODD HEWITT BRÜHERPIT47500 
TPX ProbenkammerEprediaA78710018
TPX Einzelprobenkammer, Kappen und FilterkartenEpredia5991022
Trypan BlueBio-rad1450022
U-100 InsulinspritzenBD-Biosciences329461
nassgeschütztes elektrisches Heizkissen mit mehreren HeizartenCullusModell PR7791AB120 volst AC; 45 Watt; Gelistet 562B/E26869
23123869

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia
Posted by JoVE Editors on 6/13/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Host infection response graphs; body weight, protein, cell counts vs. days; infection comparison.

to:

Body weight and immune cell count graphs; infection time course; statistical analysis; infection study.

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Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen
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