Charakterisierung von RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen mittels Massenspektrometrie

Summary

Posttranskriptionelle Modifikationen der RNA stellen eine wenig untersuchte Schicht der Translationsregulation dar, die kürzlich mit der Plastizität des zentralen Nervensystems in Verbindung gebracht wurde. Hier wird die Probenvorbereitung und der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Ansatz zur gleichzeitigen Charakterisierung zahlreicher RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen beschrieben.

Abstract

Posttranskriptionelle Modifikationen (PTMs) von RNA stellen einen wenig untersuchten Mechanismus dar, der an der Regulation der Translation im zentralen Nervensystem (ZNS) beteiligt ist. Jüngste Erkenntnisse haben spezifische neuronale RNA-Modifikationen mit Lern- und Gedächtnisparadigmen in Verbindung gebracht. Leider sind herkömmliche Methoden zum Nachweis dieser epitranskriptomischen Merkmale nur in der Lage, hochreichlich vorhandene RNA-Modifikationen in Massengeweben zu charakterisieren, was die Bewertung einzigartiger PTM-Profile ausschließt, die für einzelne Neuronen innerhalb der aktivierten Verhaltensschaltkreise existieren können. In diesem Protokoll wird ein Ansatz beschrieben – die RNA-Modifikationsanalyse einzelner Neuronen mittels Massenspektrometrie (SNRMA-MS) –, um gleichzeitig zahlreiche modifizierte Ribonukleoside in einzelnen Neuronen nachzuweisen und zu quantifizieren. Der Ansatz wird unter Verwendung einzelner Neuronen der marinen Molluske Aplysia californica validiert, beginnend mit der chirurgischen Isolierung und enzymatischen Behandlung der wichtigsten ZNS-Ganglien, um Neuronenzellkörper freizulegen, gefolgt von einer manuellen Einzelneuronenisolierung mit scharfen Nadeln und einer Mikropipette. Als nächstes wird eine mechanische und thermische Behandlung der Probe in einem kleinen Puffervolumen durchgeführt, um RNA aus einer einzelnen Zelle für den anschließenden RNA-Aufschluss freizusetzen. Modifizierte Nukleoside werden dann identifiziert und mit einer optimierten Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Methode quantifiziert. SNRMA-MS wird verwendet, um RNA-Modifikationsmuster für einzelne, identifizierte Neuronen von A. californica zu etablieren, die bekannte Morphologien und Funktionen aufweisen. Es werden Beispiele für qualitative und quantitative SNRMA-MS vorgestellt, die die heterogene Verteilung von RNA-Modifikationen auf einzelne Neuronen in neuronalen Netzwerken verdeutlichen.

Introduction

Modifikationen in den kanonischen Nukleosiden der RNA wurden zunehmend für ihre unzähligen Rollen bei der Regulation der Proteintranslation anerkannt. Bisher wurden über 150 einzigartige RNA-Modifikationen berichtet, deren Komplexität von der Methylierung, der Heteroatomaddition bis zur Konjugation mit zellulären Metaboliten reicht ^1,2. Dieses erweiterte RNA-Alphabet, auch Epitranskriptom genannt, wird von enzymatischen Autoren erzeugt und ist verantwortlich für die Veränderung der Stabilität³, der Faltung⁴ und der Translationseffizienz ^5,6 von zellulären RNAs. Ausgewählte RNA-Modifikationen können auch über enzymatische Radiergummis^7,8 rückgängig gemacht werden, während andere an RNAs substoichiometrisch ^9,10 angehängt werden^, was eine komplexe Landschaft modifizierter und unmodifizierter RNA-Sequenzen in biologischen Systemen ergibt.

Die Bedeutung von RNA-Modifikationen für die biologische Funktion wird durch die ungleiche Verteilung der Modifikationen auf verschiedene Organe und Gewebe, einschließlich Subregionen des zentralen Nervensystems (ZNS)¹¹, angezeigt. Diese chemische Heterogenität wurde mit der ZNS-Entwicklung 12, der Stressantwort¹³ und der aktivitätsabhängigen Plastizität¹⁴ in Verbindung gebracht. Die ZNS-Subregionen umfassen ferner heterogene Zellpopulationen, in denen einzelne Zellen unterschiedliche chemische Profile aufweisen^15,16,17,18. Selbst einzelne Zellen des gleichen Typs können einzigartige Transkriptome aufweisen, was zum Teil auf Gewebemikroumgebungen¹⁹ und stochastische Genexpression²⁰ zurückzuführen ist. Während die Charakterisierung des einzelligen Transkriptoms jedoch etwas routinemäßig ist, gibt es keine analogen Methoden zur Etablierung von Einzelzellepitranskriptomen für multiple RNA-Modifikationen. Neue Ansätze, die in der Lage sind, die Verteilung von RNA-Modifikationen in einzelnen Zellen zu profilieren, sind für eine umfassende Analyse der zellulären Heterogenität und des regulatorischen Einflusses von posttranskriptionellen Modifikationen (PTMs) im ZNS und anderen biologischen Systemen erforderlich.

Die gleichzeitige Messung zahlreicher RNA-Modifikationen in Massenzellen / Geweben kann leicht mit Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Techniken (LC-MS/MS) durchgeführt werden. Für die LC-MS/MS-Analyse von modifizierten Ribonukleosiden wird RNA aus Zellen (typischerweise 10 3-10 ⁶ Zellen) extrahiert, durch Ausfällung und Resuspension gereinigt und anschließend zu Nukleosiden verdaut. Die Probenmischung, bestehend aus kanonischen und modifizierten Nukleosiden, wird dann zur Analyttrennung und -detektion in das LC-MS-System injiziert, was zur Bestimmung des vollständigen Komplements der RNA-Modifikationen in einem Organismus^21,22,23 führt. LC-MS/MS wurde kürzlich verwendet, um 26 RNA-Modifikationen im ZNS des neurobiologischen Modells Aplysia californica (A. californica) zu bestimmen. Die Häufigkeit einiger dieser epitranskriptomischen Markierungen zeigte eine zeit- und regionsabhängige Dynamik, die mit Verhaltensänderungen beim Tier korrelierte²⁴. RNA-Modifikationen in Großproben mit >10³ Zellen konnten jedoch aufgrund der begrenzten Sensitivität der Methode nur nachgewiesen werden. Diese größeren Proben verdeckten wahrscheinlich einzigartige und funktionell wichtige RNA-Modifikationsprofile einzelner Zellen mit Populationsdurchschnitten. Obwohl eine sorgfältige Kontrolle der Probenvorbereitungsbedingungen die Nachweisgrenzen für RNA-Modifikationen in kleinvolumigen Proben^25,26,27,28 verbessert hat, besteht nach wie vor ein Bedarf an analytischen Methoden^, die mehrere modifizierte Ribonukleoside in einzelnen Zellen nachweisen und quantifizieren können.

Dieses Protokoll führt die Einzelneuronen-RNA-Modifikationsanalyse durch Massenspektrometrie (SNRMA-MS) ein, die den Nachweis von über einem Dutzend RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen aus dem ZNS von A. californica²⁹ ermöglicht. Der Ansatz besteht aus der chirurgischen Isolierung einzelner, identifizierter Zellen aus großen ZNS-Ganglien, gefolgt von einem optimierten Probenvorbereitungs-Workflow mit mechanischer Zelllyse, RNA-Denaturierung und enzymatischer Hydrolyse in einem MS-kompatiblen Puffer. Die Identifizierung und Quantifizierung posttranskriptionell modifizierter Nukleoside erfolgt dann mittels LC-MS/MS. SNRMA-MS erfüllt einen ungedeckten Bedarf auf dem Gebiet der RNA-Modifikationsanalyse, indem es die Erfassung posttranskriptioneller RNA-Modifikationsprofile für einzelne Neuronen erleichtert und Potenzial für die zukünftige Anwendung auf andere Zelltypen hat.

Protocol

1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen

1. Bereiten Sie künstliches Meerwasser (ASW) mit 460 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 22 mM MgCl₂, 26 mM_{MgSO 4} und 10 mM HEPES in Wasser aus einem strengen Reinigungssystem vor. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M NaOH oder HCl auf 7,8 ein. Bereiten Sie in der Regel 1 l ASW vor und lagern Sie es bis zur Verwendung bei 14 °C.
2. Bereiten Sie eine ASW-Antibiotika-Lösung mit 10.000 E/ml Penicillin G, 10 μg/μL Streptomycin und 10 μg/μL Gentamicin vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Unmittelbar vor dem Experiment tauen und verdünnen Sie die gefrorene Antibiotika-Stammlösung 1:100 in 20-40 ml ASW. Die endgültige Konzentration von Antibiotika in der arbeitenden ASW-Lösung beträgt 100 U / ml Penicillin G, 100 μg / ml Streptomycin und 100 μg / ml Gentamicin.
3. Bereiten Sie einen RNA-Verdauungspuffer vor, indem Sie 1 μL 10 μg/μL Rinderserumalbumin, 0,5 μL 0,5 μg/μL Pentostatin, 0,495 μL 2 U/μL alkalische Phosphatase, 1 μL 0,1 U Phosphodiesterase I (in 10 mM_MgCl2) und 0,38 μL Endonuklease aus Serratia marcescens (25 E) pro Probe kombinieren. Wenn Sie mehrere Proben analysieren, bereiten Sie ein Master-Mix in einem separaten Röhrchen vor, das das Volumen jedes Reagenzes multipliziert mit der Anzahl der zu analysierenden Proben sowie eine weitere enthält, um den zufälligen Reagenzienverlust durch Pipettentransferschritte zu berücksichtigen.
4. Bereiten Sie mehrere scharfe Nadeln (entweder Glas oder Metall) für die manuelle Isolierung von Neuronen vor. Machen Sie Metallnadeln im Haus, indem Sie Wolframdraht wie in³⁰ elektrochemisch ätzen oder kaufen Sie sie. Bereiten Sie Glasnadeln aus dicken oder Standard-Wand-Borosilikatglaskapillaren (1 mm Außendurchmesser) mit einem Mikropipettenabzieher vor. Bei der vorliegenden Methode ist der Nadelspitzendurchmesser zwischen 1-5 μm und einer Halslänge von 100-150 μm zu halten.
   HINWEIS: Die Herstellung von Metall- und Glasnadeln kann optimiert werden, um Werkzeuge herzustellen, die den individuellen Bedürfnissen des Forschers und dem spezifischen biologischen Modell, das untersucht wird, entsprechen.

2. Isolierung einzelner Neuronen

1. Eine 0,33 M_{MgCl 2-Lösung} wird auf 14 °C abgekühlt. Anästhesien Sie A. californica (150-250 g) mit einer 50-ml-Spritze, indem Sie die MgCl_2-Lösung in die Körperhöhle des Tieres injizieren. Die besten Ergebnisse werden mit einem Verhältnis von 1:3 des Lösungsvolumens (ml) zur tierischen Körpermasse (g) erzielt. Warten Sie etwa 3 Minuten, bis sich das Tier entspannt hat, und stellen Sie sicher, dass es keine Körperkontraktionen als Reaktion auf taktile Stimulation aufweist.
2. Legen Sie die ventrale Seite des Tieres (Fußseite) nach oben in eine Sezierschale. Sezieren Sie das Tier mit einer chirurgischen Schere mit einer stumpfen Spitze, die in Richtung des Tieres positioniert ist, und machen Sie vorsichtig einen Längsschnitt durch den Fuß.
3. Heften Sie die rostralen, kaudalen und lateralen Seiten des Tierkörpers an, um die inneren Organe und ZNS-Ganglien in der Körperhöhle freizulegen. Isolieren Sie wichtige ZNS-Ganglien vom Tier, indem Sie die Nerven und einige Bindemittel, die von den Ganglien stammen, chirurgisch durchtrennen.
4. Tauchen Sie die Ganglien in eine Proteaselösung Typ XIV aus Streptomyces griseus (10 mg/ml in ASW-Antibiotika-Lösung) und inkubieren Sie bei 34 °C für 30 min oder 1 h (für Hirnganglion).
   HINWEIS: Die Dauer der Inkubation hängt von der Jahreszeit, der Größe und dem Zustand des Tieres sowie den Zielneuronen ab. Die Isolierung einiger Neuronen erfordert eine längere Inkubation als andere und sollte experimentell bestimmt werden.
5. Spülen Sie die Ganglien 6x mit ASW-Antibiotika-Lösung ab und übertragen Sie alle Ganglien in eine silikonpolymerbeschichtete Schale, die mit ASW-Antibiotika-Lösung gefüllt ist, mit einer Polypropylen-Transferpipette, die auf eine Öffnung von ~ 5 mm geschnitten wurde. Behandeln Sie die Pipette mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin in ASW, um das Anhaften der Ganglien an der Pipette zu minimieren (optional). Halten Sie Ganglien jederzeit in ASW eingetaucht.
   HINWEIS: Die enzymatische Behandlung reduziert die mechanische Stabilität von Neuronen und umgebendem Bindegewebe und infolgedessen können neuronale Membranen durch Lufteinwirkung während des Ganglientransfers beschädigt werden.
6. Stecken Sie die Ganglien fest und verwenden Sie Mikroscheren und feine Pinzetten, um Ganglienscheiden zu entfernen. Verwenden Sie bei ausreichend starker enzymatischer Behandlung Glas- oder Metallnadeln zur Entmantelung.
7. Visuelle Identifizierung von A. californica-Neuronen von Interesse. In dieser Arbeit wurden die folgenden Zellen untersucht: R2 im abdominalen Ganglion, LPl1 im Pleuraganglion, metazerebrale Zellen (MCCs) im zerebralen Ganglion und B2-Zellen im Ganglion buccalis. Nehmen Sie optische Bilder aller neuronalen und ganglionären Präparate mit einem kalibrierten Mikroskop bei 20-facher Gesamtvergrößerung auf, um die Größe und das Volumen jedes Zelltyps zu bestimmen.
8. Isolieren Sie die identifizierte Zelle vorsichtig mit einer gezogenen Glaskapillare oder scharfen Wolframnadeln vom Bulk-Ganglion.
9. Ziehen Sie eine kleine Menge (1 μL) ASW in eine Kunststoff-Mikropipette und übertragen Sie dann die isolierte Zelle in ein PCR-Probenröhrchen, das 4 μL 0,365 M Ammoniumacetat (pH 9,2) enthält. Für Blindmessungen 5 μL Aliquots der ASW-Antibiotika-Lösung aus der Schale mit dem Ganglion entnehmen und mit Verdauungspuffer (siehe unten) mischen.

3. Zelllyse und RNA-Verdauung für SNRMA-MS

1. Die isolierten Neuronen werden durch wiederholte Aspiration und Verzicht auf eine Mikropipette (~100 μm Innendurchmesser) in 0,365 M Ammoniumacetat lysiert. Einige kleinere Zellen können nicht sofort reißen; Um sie zu lysieren, üben Sie Druck über den Durchmesser der Zelle mit einer gezogenen Glaskapillare aus.
2. Verwenden Sie einen Thermocycler, um die Proben mit dem folgenden Temperaturprogramm zu erwärmen: 95 °C für 3 min, 10 °C für 3 min, halten bei 10 °C. Entfernen Sie das Probenröhrchen aus dem Thermocycler.
3. Fügen Sie 3,375 μL RNA-Aufschlusspuffer für jede Probe hinzu und mischen Sie die Lösung mit einer Mikropipette, indem Sie die Lösung mehrmals zurückziehen und dosieren. Verwenden Sie eine Miniatur-Tischzentrifuge bei 2700 x g für 30 s, um alle Flüssigkeitströpfchen abzudrehen, die an den Wänden der PCR-Röhre haften.
4. Die Proben werden im Thermocycler bei 37 °C für 3 h inkubiert, gefolgt von einem Halt bei 10 °C (beheizter Deckel auf ON eingestellt). Unmittelbar nachdem die Probe auf 10 °C abgekühlt ist, werden 7 μL der Lösung in eine Durchstechflasche mit einem 250 μL Einsatz des Autosamplers überführt, wobei darauf zu achten ist, dass sich im Autosampler-Röhrchen keine Blasenbildung bildet.

4. Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

HINWEIS: Analysieren Sie die Einzelneuronen-Digests und authentischen modifizierten Nukleosidstandards mit einem LC-MS/MS-System, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle und einem Sechs-Port-Weichenventil ausgestattet ist.

1. Zur Vorbereitung des LC-Systems für die Trennung von kanonischen und modifizierten Nukleosiden wird eine C18-Säule (150 mm x 2,1 mm, 2,2 μm Partikelgröße, 120 Å Porendurchmesser) mit 99% mobiler Phase A (5 mM Ammoniumacetat, pH 5,6) und 1% mobiler Phase B (60/40 mobile Phase A/Acetonitril (ACN)) bei einer Durchflussrate von 0,2 ml/min für 12 min bei 36 °C ausgeglichen. Verwenden Sie LC-MS-Lösungsmittel zur Vorbereitung mobiler Phasen.
2. Während das LC ausgleicht, kalibrieren Sie das Massenspektrometer, indem Sie eine 1 mM Lösung von Natriumacetat in 50/50 ACN/Wasser über eine Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 5 μL/min in das Massenspektrometer einführen. Schließen Sie nach der Kalibrierung den LC-Durchfluss wieder an das Massenspektrometer an.
3. Programmieren Sie die folgenden linearen Gradientenparameter: 1% B für 0-5 min, 5% B bei 9 min, 7% B bei 11 min, 10% B bei 13 min, 15% B bei 32 min, 40% B bei 38 min, 50% B bei 43 min, 100% B bei 50 min, 100% B bei 60 min, 1% B bei 61 min, und eine 12-minütige Regleichgewichtung bei 1% B vor der nächsten Injektion.
4. Betreiben Sie das MS-Gerät im positiven Modus mit den folgenden Parametern: Kapillarspannung eingestellt auf 4.500 V, Trocknungstemperatur 275 °C,_N2 Trocknungsgas 5 L/min und Vernebelungsgas 1 bar. Stellen Sie das Weichenventil für die ersten 2 Minuten der Analyse auf Abfall und für den Rest des Laufs auf Quelle ein.
5. Sammeln Sie Massenspektren über einen m/z-Bereich von 110-600. Wählen Sie Ionen für eine kollisionsinduzierte Dissoziation bei 35-40 eV über eine Zykluszeit von 3 s unter Verwendung einer bevorzugten Massenliste, die mit der Datenbank 2 und einem Isolationsfenster von ±^0,5 erstellt wurde. Verwenden Sie den aktiven Ausschluss, um Ionen nach drei Spektren von der Fragmentierung auszuschließen.
6. Legen Sie die dynamische MS/MS-Spektrenerfassung für Ionen mit Intensitäten über und unter 50.000 Zählungen bei 4 Hz bzw. 1 Hz und eine Mindestschwelle für die Ionenauswahl bei 1.990 Zählungen fest.
7. Für quantitative SNRMA-MS konstruieren Sie Kalibrierkurven unter Verwendung von extrahierten Ionenchromatogramm-Peakflächen (EIC), die für modifizierte Nukleosidstandards in mindestens fünf Konzentrationen erhalten wurden, um eine Interpolation unbekannter endogener Analytkonzentrationen zu ermöglichen.
   HINWEIS: Neuronen, die von Tieren mit Körpermassen von 150-250 g gewonnen werden, erfordern typischerweise Kalibrierkurven für modifizierte Nukleoside im Bereich von 0,02 pmol bis 2 pmol, aber diese Werte können je nach Empfindlichkeit des Instruments variieren.

5. Datenanalyse

1. EICs für modifizierte Nukleoside (m/z aus Datenbankwerten²) generieren. Überprüfen Sie die Identitäten von mutmaßlich modifizierten Nukleosiden, indem Sie ihre MS2-Spektren und LC-Retentionseigenschaften mit Datenbankwerten² vergleichen. Siehe Tabelle 1 für eine Liste typischer RNA-Modifikationen, die in einzelnen Neuronen von A. californica nachgewiesen wurden.
2. Integrieren Sie manuell Peaks, die modifizierten und kanonischen Nukleosiden entsprechen, und erfassen Sie diese Werte in einer Tabelle. Normalisieren Sie den Peakbereich für jedes modifizierte Nukleosid mit der Summe der Peakbereiche für kanonisches Cytidin, Uridin und Guanosin, die in der Probe nachgewiesen wurden.
   HINWEIS: Adenosin ist aufgrund seiner Rolle im ZNS als dynamischer Neuromodulator³¹ nicht in der Normalisierung enthalten.
3. Erstellen Sie eine Datenmatrix, die aus jeder Einzelneuronenprobe und den entsprechenden normierten Peakbereichen für modifizierte Nukleoside besteht, die Signal-Rausch-Verhältnisse >10 aufweisen. Führen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis, PCA) durch und zeigen Sie die ersten beiden Hauptkomponenten im Score-Diagramm an. Konstruieren Sie lineare Kalibrierkurven aus den EIC-Peakbereichen, die aus der seriellen Verdünnung von Nukleosidstandards erhalten wurden, und berechnen Sie die Konzentrationen der nachgewiesenen Analyten.

Results

SNRMA-MS beinhaltet die manuelle Isolierung identifizierter Neuronen in kleine Probenvolumina für Lyse, Verdauung und LC-MS/MS-Analyse (Abbildung 1A). Dieser Workflow detektierte routinemäßig über ein Dutzend RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen aus dem ZNS von A. californica (Abbildung 1B), was einer Abdeckung von fast der Hälfte des bekannten Epitranskriptoms dieses Tieres 24 in einer einzigen^Zelle entspricht. Zum Beispiel führte die Probenahme des LPl1-Neurons (~ 500 μm Durchmesser) zu SNRMA-MS zum Nachweis von 15 ± 1 RNA-Modifikationen (n = 3). Modifizierte Nukleoside wurden auf der Grundlage von drei Attributen positiv identifiziert: LC-Retentionseigenschaften, exakte Masse und MS2-Fragmentierungsprofile im Vergleich zu den in der Datenbank^{angegebenen Werten 2}. Tabelle 1 zeigt eine Liste aller RNA-Modifikationen, die im LPl1-Neuron nachgewiesen wurden. Das für diese Experimente verwendete hochauflösende Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer ermöglichte eine Massengenauigkeit von 4 ppm sowie den Nachweis des charakteristischen MS2-Fragmentions bei m/z 164 für das modifizierte Nukleosid N6,6-Dimethyladenosin (m⁶⁶A, Abbildung 1B). In Kombination mit den LC-Trenndaten, die mit den in der Datenbank hinterlegten Befunden übereinstimmen (m 66 A eluiert nachN6-Methyladenosin (m 6 A)), zeigte der SNRMA-MS-Ansatz die korrekte Zuordnung von modifizierten Nukleosididentitäten.

Die SNRMA-MS-Plattform kann genutzt werden, um RNA-Modifikationsprofile einzelner Neuronen zu erstellen und ihre Beziehung zu Massengeweben zu untersuchen. R2-Neuronen sind große (~ 500 μm im Durchmesser) cholinerge Zellen, die sich im Bauchganglion befinden. SNRMA-MS wurde verwendet, um RNA-Modifikationen in R2-Neuronen sowie im umgebenden abdominalen Ganglion zu analysieren (Abbildung 2A). Normalisierte Peakbereiche für RNA-Modifikationen in jeder Neuronen-/Ganglienprobe (n = 7) wurden als Eingaben für PCA verwendet, was zeigt, dass R2-Neuronen im Vergleich zu den Ganglien, in denen sie sich befinden, unterschiedliche RNA-Modifikationsprofile aufweisen (Abbildung 2B). Dies wird durch Datenpunkte für R2-Neuronen und Bauchganglien belegt, die verschiedene Regionen des PCA-Score-Diagramms einnehmen. Weitere Unterstützung für einzigartige modifizierte Nukleosidmuster wurde von einer separaten Kohorte von Tieren (n = 7) erhalten, in der paarweise Vergleiche für 13 RNA-Modifikationen durchgeführt wurden, die üblicherweise sowohl in den einzelnen Neuronen als auch im Massengewebe nachgewiesen wurden (Abbildung 2C). Zwei modifizierte Nukleoside, Pseudouridin (Ψ) und 2'-O-Methylguanosin (Gm), wiesen im Vergleich zu R2-Neuronen eine signifikant höhere Häufigkeit in den Bauchganglien auf. Bei der Betrachtung einer Teilmenge der RNA-Modifikationen mit den angegebenen R2-Neuron-Ganglien-Paaren wiesen alle abdominalen Ganglien höhere Konzentrationen von Ψ und Gm auf, und alle bis auf eines der R2-Neuronen wiesen höhere Häufigkeiten von 2'-O-Methyladenosin (Am) auf als ihr entsprechendes Ganglion (Abbildung 2D). Insgesamt zeigen die SNRMA-MS-Ergebnisse zum ersten Mal, dass RNA-Modifikationsprofile einzelner Zellen von Massenzellen im selben Gewebe abweichen können.

Die Verwendung von SNRMA-MS zur Untersuchung des Modelltieres A. californica bietet eine einzigartige Gelegenheit, RNA-Modifikationsprofile in identifizierten, funktionell unterschiedlichen Neuronen zu charakterisieren. RNA-Modifikationen wurden von SNRMA-MS in vier identifizierten Zellen untersucht: R2 und LPl1 (homologe, cholinerge Zellen, die an der defensiven Schleimfreisetzung beteiligt sind⁾³², MCCs (serotonerge modulatorische Neuronen, die an der Fütterung beteiligt sind)33 und B2-Zellen (peptiderge Neuronen, die an der Darmmotilität beteiligt sind⁾³⁴. PCA von sechs RNA-Modifikationen in diesen identifizierten Neuronen, die entweder unmittelbar nach der enzymatischen Behandlung isoliert oder in einem Ganglienpräparat für 48 h kultiviert wurden, zeigten die Stabilität und Dynamik von Einzelzellepitranskriptomen. RNA-Modifikationen in funktionell unterschiedlichen Zellen bildeten einzigartige Cluster im Score-Plot, während homologe R2/LPl1-Neuronen ko-geclustert wurden (Abbildung 3A). Das Belastungsdiagramm zeigt, dass die Unterschiede in erster Linie durch die Häufigkeit von Positionsisomeren von Methyladenosin verursacht wurden, einschließlich 2'-O-Methyladenosin (Am) und N1-Methyladenosin (^m1A) (Abbildung 3B). In der gleichen Analyse wurde ein Vergleich von frisch isolierten Zellen und Zellen, die in situ (d.h. in ihren jeweiligen Ganglien) für 48 h kultiviert wurden, durchgeführt. Wie im PCA-Score-Diagramm gezeigt, blieben funktionell verschiedene Zellen durch ihre RNA-Modifikationsprofile unterscheidbar.

Quantitative SNRMA-MS können verwendet werden, um absolute Mengen ausgewählter RNA-Modifikationen zu bestimmen, für die authentische Standards verfügbar sind. Externe Kalibrierkurven wurden für m¹A, Ψ, 2'-O-Methylcytidin (Cm), Am und m⁶A erzeugt, und die Menge jedes modifizierten Nukleosids in den MCC- und R2/LPl1-Zellpaaren wurde durch Interpolation bestimmt (Abbildung 4A-E). Die intrazellulären Größen von m¹A und Ψ in zwei Paaren symmetrischer MCCs schienen ähnlich zu sein, während größere Unterschiede in den Mengen dieser Modifikationen in drei Paaren von R2 / LPl1-Zellen beobachtet wurden. Um Unterschiede aufgrund der physikalischen Größe der untersuchten Zellen zu berücksichtigen, wurden die RNA-Modifikationsmengen durch Zellvolumina normalisiert, die aus der optischen Messung von Zelldurchmessern berechnet wurden, um intrazelluläre Konzentrationen von modifizierten Nukleosiden zu erhalten. Signifikante Unterschiede in den intrazellulären Konzentrationen von Cm und Am wurden zwischen MCCs und R2/LPl1-Neuronen beobachtet. Insgesamt ermöglicht SNRMA-MS sowohl die qualitative als auch die quantitative Profilierung von RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen.

Abbildung 1: SNRMA-MS-Workflow und Nachweis multipler RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen durch LC-MS/MS . (a) Fotos von entmanteltem bukkalem Ganglion und Einzelneuronenisolierung in ein Probenröhrchen. Maßstabsleiste = 200 μm, Pfeile zeigen identifizierte B1-Zelle an. Ein Diagramm des Probenvorbereitungsverfahrens für die LC-MS/MS-Analyse wird ebenfalls gezeigt. (B) Überlagerte EICs für RNA-Modifikationen in einem einzelnen LPl1-Neuron, wobei der Einschub MS1- und MS2-Spektren für N6, N6-Dimethyladenosin (m⁶⁶A) zeigt. Siehe Tabelle 1 für m/z-Werte , die zur Erzeugung von EICs für modifizierte Nukleoside verwendet werden. Diese Zahl wurde von²⁹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: SNRMA-MS unterscheidet RNA-Modifikationsprofile von einzelnen Neuronen und Massengewebe. (A) Schematische Darstellung des ZNS von A. californica und des Arbeitsablaufs zur Analyse von R2-Neuronen und dem umgebenden Abdominalganglion. Das Foto zeigt das abdominale Ganglion und das R2-Neuron (injiziert mit Fast Green-Farbstoff für Sichtbarkeit). (B) Relative Peakflächen aus 13 RNA-Modifikationen wurden verwendet, um den PCA-Score (oben) und das Laden (unten) Diagramme zu generieren. (C) Paarweiser Vergleich von RNA-Modifikationen im abdominalen Ganglion und R2-Neuron. Fehlerbalken stellen ±1 Standardabweichung (SD), *p < 0,05, ***p < 5 x 10⁻⁴, gepaart mit Bonferroni−Holm-Korrektur dar. (D) Vergleich ausgewählter RNA-Modifikationen aus Panel C, in dem R2-abdominale Ganglienpaare für jedes Tier mit Droplines gezeigt werden. Diese Zahl wurde von²⁹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Profilierung von RNA-Modifikationen in identifizierten, funktionell unterschiedlichen Neuronen aus dem ZNS von A. californica. (A) PCA-Score-Diagramm für MCCs und B2-, R2- und LPl1-Zellen, die entweder frisch isoliert oder isoliert wurden, nachdem sie 48 h lang in situ gekulturt wurden (gekennzeichnet durch cMCC, cB2, cR2, cLPl1), und (B) Ladediagramme für sechs RNA-Modifikationen, die üblicherweise in diesen Zellen nachgewiesen wurden. Diese Zahl wurde von²⁹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Quantitative SNRMA-MS in Neuronen von A. californica. Die quantitative SNRMA-MS liefert absolute Mengen und intrazelluläre Konzentrationen für mehrere modifizierte Nukleoside in einzelnen, identifizierten A. californica-Neuronen. Fotos von (A) linken und rechten MCCs (LMCC bzw. RMCC) im Hirnganglion und (B) R2 im abdominalen Ganglion und LPl1 im Pleuraganglion. Die Zellen werden eingekreist, um die Sichtbarkeit zu verbessern. Lineare Kalibrierdiagramme für (C) m¹A und (D) Ψ (Dreiecke) zur Interpolation modifizierter Nukleosidgrößen in einzelnen Zellen (farbige Punkte). Zellpaare von jedem Tier sind mit 1-3 gekennzeichnet. (E) intrazelluläre Konzentrationen von fünf modifizierten Nukleosiden in MCC- und R2/LPl1-Zellpaaren. Dicke Linien verbinden Zellpaare. *p < 0,05, **p < 0,005, gepaarter t-Test mit Bonferroni−Holm-Korrektur, n = 2 Tiere (vier Zellen insgesamt) für MCCs und n = 3 Tiere (sechs Zellen insgesamt) für R2/LPl1. Diese Zahl wurde von²⁹ geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

RNA-Modifikation	Abkürzung	Elution-Auftrag (C18)	m/z für EIC	m/z für MS2
Dihydrouridin	D	1	247.09	115
Pseudouridin	Y	2	245.08	209/179/155
3-Methylcytidin	m3C	3	258.11	126
N1-Methyladenosin	m1A	4	282.12	150
5-Methylcytidin	m5C	5	258.11	126
N7-Methylguanosin	m7G	6	298.12	166
2'-O-Methylcytidin	Zentimeter	7	258.11	112
Inosin	I6A	8	269.09	137
2'-O-Methylguanosin	Gm	9	298.12	152
N2-Methylguanosin	m2G	10	298.12	166
N2,N2,N7-Trimethylguanosin	m227G	11	326.15	194
N2,N2,-Dimethylguanosin	m22G	12	312.13	180
2'-O-Methyladenosin	Bin	13	282.12	136
N6-Methyladenosin	m6A	14	282.12	150
N6,N6-Dimethyladenosin	m66A	15	296.14	164
N6-Isopentenyladenosin	i6A	16	336.17	204/136/148

Tabelle 1: RNA-Modifikationen in einzelnen Neuronen von A. californica nachgewiesen. Es werden Attribute zur Charakterisierung modifizierter Nukleoside bereitgestellt, einschließlich LC-Retentionsreihenfolge, m/z für die Erzeugung von EICs und entsprechenden CID-Fragmenten.

Discussion

SNRMA-MS nutzt einen optimierten Probenvorbereitungsansatz, der zu einem kleinen, MS-kompatiblen Probenvolumen führt, das an die LC-MS-Plattform geliefert werden kann. Die anfängliche enzymatische Vorbehandlung von ZNS-Ganglien bestimmt sowohl die Leichtigkeit, mit der sie entmantelt werden können, als auch die Haltbarkeit einzelner Neuronen während der Isolation. Das Hirnganglion erfordert aufgrund seiner relativ dicken Hülle im Vergleich zu den bukkalen, pleuralen und abdominalen Ganglien oft eine erweiterte enzymatische Behandlung. Einzelne Forscher, die die Einzelneuronenisolationen durchführen, haben möglicherweise unterschiedliche Präferenzen dafür, wie langlebig die Hülle sein sollte, wenn Mikroscheren und feine Pinzetten verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, dass die Ganglien nicht überverdaut werden, da dies zu einem Verlust ihrer strukturellen Integrität, einem Verlust von Positionsinformationen, die für die Identifizierung von Zielzellen entscheidend sind, und / oder einer Zelllyse führen kann. Nach der Isolierung aus dem Ganglion ist es wichtig sicherzustellen, dass beim Transfer des Neurons in das Probenröhrchen ein minimales Volumen an Isolationsmedium abgesaugt wird. Das ASW-Medium enthält eine hohe Konzentration an Salzen, die während der RNA-Hydrolyse Verdauungsenzyme stören können und auch die Probe verdünnen.

Während des mechanischen Lyseschritts ist es üblich, dass große Neuronen (>250 μm Durchmesser) bei wiederholtem Passieren einer Mikropipette reißen. Kleinere Neuronen können zusätzliche Aufmerksamkeit erfordern, um die Zelllyse sicherzustellen, bei der typischerweise eine Glaskapillare auf die Zelle gedrückt wird. In diesem Fall ist es möglich, dass ein Teilvolumen des Probenpuffers aufgrund von Kapillarkräften in die Kapillare gezogen wird. Dieses Volumen kann durch Druck auf das Ende der Glaskapillare zurück in das Probenröhrchen abgegeben werden, um sicherzustellen, dass keine Probe verloren geht.

Die besten Ergebnisse werden erzielt, indem ein Erwärmungsschritt vor der Zugabe von Enzymen für den RNA-Aufschluss einbezogen wird. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass das Erhitzen bei 95 °C RNA-Sekundärstrukturen denaturiert, die die Aktivität von^{RNases 35} behindern und die Menge an Nukleosiden verringern können, die aus RNA-Biopolymeren freigesetzt werden. Kontrollexperimente mit Proben mit stabilem isotopenmarkiertem Methionin wurden zuvor durchgeführt, um zu untersuchen, ob hitzeinduzierte RNA-Modifikationsartefakte die Ursache für die erhöhten Peakbereiche waren, die für RNA-Modifikationen im Vergleich zu einem No-Heat-SNRMA-MS-Protokoll²⁹ beobachtet wurden. Es wurde keine solche Markierung beobachtet, was darauf hindeutet, dass die verbesserten Signale für RNA-Modifikationen mit der optimierten SNRMA-MS-Methode auf eine überlegene Verdauung von RNA zurückzuführen waren.

Herkömmliche Methoden zur Isolierung der gesamten RNA aus Zellen umfassen die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) mit Phenol-Chloroform und die anschließende RNA-Ausfällung, das Waschen und die Reuspension. Diese Ansätze haben sich als nützlich für Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktionsexperimente erwiesen, bei denen die Expression ausgewählter Gene in identifizierten A. californica-Neuronen leicht überwacht werden kann^36,37. LLE-Methoden können jedoch keine ausreichende RNA für den Nachweis modifizierter Ribonukleoside durch LC-MS gewinnen, während die hierin beschriebene SNRMA-MS-Methode den Nachweis zahlreicher RNA-Modifikationen^{ermöglicht 29}. Um Modifikationsprofile spezifischer RNA-Typen (z. B. rRNA, tRNA, mRNA) in Schüttgewebe-/Zellproben, Anionenaustausch-Festphasenextraktion²⁴, Hybridisierungssonden-basierte Anreicherung³⁸ und chromatographische Fraktionierung³⁹ zu bewerten, wurden Ansätze angewendet, aber ähnliche Methoden sind für die Einzelzell-RNA-Aufreinigung noch nicht verfügbar. Die Entwicklung von RNA-Fraktionierungsansätzen, die in der Lage sind, bestimmte RNA-Typen aus einzelnen Zellen zu isolieren, würde zusätzliche Einblicke in die Funktion von RNA-Modifikationen liefern.

SNRMA-MS zeigte bisher uncharakterisierte Heterogenität in der RNA-Modifikationslandschaft einzelner Neuronen in A. californica und es ist denkbar, dass ähnlich unterschiedliche PTM-Profile in Säugetierzellen existieren. Da Säugetierzellen im Vergleich zu den großen A. californica-Neuronen , die in diesem Protokoll analysiert werden, relativ klein sind, sind Verbesserungen im Umgang mit kleinen Probenvolumina erforderlich, um niedrigere Nachweisgrenzen zu ermöglichen. Obwohl SNRMA-MS derzeit auf Volumina von ~ 5 μL beschränkt ist, wird erwartet, dass durch die Integration von mikrofluidischen Liquid-Handling-Geräten in den Workflow erhebliche Verbesserungen erzielt werden können. Darüber hinaus würde die Implementierung automatisierter oder halbautomatischer Zellisolierungen den Probendurchsatz erhöhen und eine Einzelzell-RNA-Modifikationsanalyse größerer Zellpopulationen ermöglichen. Durch die Anbindung an Nanoflow-LC-Trennungen²⁷ wird die Charakterisierung epitranskriptomischer Markierungen in noch kleineren Zellen möglich sein.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animals
Aplysia californica	National Resource for Aplysia (Miami, FL)		150– 250 g (Erwachsene)
Tischgerät
Glas-Kapillarabzieher	Sutter	P-97
Milli-Q Wasseraufbereitungssystem	Millipore
Minizentrifuge für PCR-Röhrchen	LW Scientific	ZS-1
Optisches Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000C
Thermocycler		Techne EW-93945-01
HPLC-Säule und Verbrauchsmaterialien
Acclaim RSLC 120 C18 Säule	Thermo Scientific	71399
Autosampler-Fläschchen	Thermo Scientific	C4011-13
LC und MS Instrumentierung und Software
DataAnalysis 4.4 Software	Bruker
Dionex Ultimate 3000 nanoLC	Thermo Scientific		Ausgestattet mit Online-Entgaser, Autosampler und thermostatisiertem Säulenfach
Impact HD UHR QqTOF-Massenspektrometer	Bruker		Ausgestattet mit ESI-Quelle
RStudio	RStudio
Mikrodissektionswerkzeuge
Mikroschere extra feine Vannas 3,5"	Roboz	RS-5640
Wolframnadeln	Roboz	RS-6065
Reagenzien/Materialien
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethan-sulfonsäure (HEPES)	Fisher Scientific	H3375
Alkalische	Phosphatase Worthington Biochemical Corp.
Ammoniumacetat	Honeywell	17836
Benzonase (Endonuklease aus S. marcescens)	EMD Millipore	70746-4
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A2153
Calciumchlorid	Sigma-Aldrich	C4901
Gentamycinsulfat	Fisher Scientific	G1264
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	208094
Nukleoside Testmischung	Sigma-Aldrich	47310-U
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P7794
Pentostatin	Sigma-Aldrich	SML0508
Phosphodiesterase I	Worthington Biochemical Corp.
Protease Typ XIV aus Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	P5147
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888
Standard-Glaskapillaren	A-M Systems	626000	1 mm Außendurchmesser, 0,5 mm Außendurchmesser, 4 Zoll
Streptomycinsulfat	Sigma-Aldrich	S9137