Die AlPcS2a-vermittelte Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Intrazelluläre Vesikel (IVs) werden durch Endozytose von Vesikeln in das Zytoplasma gebildet. Die IV-Bildung ist an der Aktivierung verschiedener Signalwege durch Permeabilisierung von IV-Membranen und die Bildung von Endosomen und Lysosomen beteiligt. Eine Methode namens Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) wird angewendet, um die Bildung von Infusionen und die Materialien zur Steuerung der Infusionsregulation zu untersuchen. CALI ist eine bildgebende photodynamische Methode zur Untersuchung des durch Membranpermeabilisierung induzierten Signalwegs. Die Methode erlaubt es, die selektierte Organelle räumlich und zeitlich in einer Zelle zu permeabilisieren. Die CALI-Methode wurde angewendet, um bestimmte Moleküle durch die Permeabilisierung von Endosomen und Lysosomen zu beobachten und zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Membranriss von IVs selektiv glykanbindende Proteine wie Galektin-3 rekrutiert. Hier beschreibt das Protokoll die Induktion einer IV-Ruptur durch AlPcS2a und die Verwendung von Galektin-3 als Marker zur Markierung beeinträchtigter Lysosomen, was nützlich ist, um die nachgeschalteten Effekte der IV-Membranruptur und ihre nachgeschalteten Effekte unter verschiedenen Situationen zu untersuchen.
Einleitung
Endosomen, eine Art intrazellulärer Vesikel (IV), werden durch Endozytose gebildet und reifen dann zu Lysosomen heran. Verschiedene intrazelluläre Signalwege sind an der Bildung von Infusionen beteiligt; Darüber hinaus können unterschiedliche intrinsische und extrinsische Reize IVs schädigen (z. B. können Krankheitserreger während der Infektion aus der gebundenen Membran entweichen und in das Zytoplasma1 gelangen). Dies geht in der Regel mit der Ruptur endozytotischer Vesikeleinher 2. Daher können die Techniken zur gezielten und schädigenden Infusion in verwandten Studienverwendet werden 3.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. AlPcS2a Stoffaufbereitung
- 10 mg AlPcS2a werden in 400 μl 0,1 M NaOH gelöst. Um die Löslichkeit zu verbessern, erhitzen Sie die Lösung auf 50 °C und wirbeln Sie sie.
- Mischen Sie die Lösung mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Filtrieren Sie dann die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter, um die unlöslichen Ausfällungen zu entfernen.
- Messen Sie die Konzentration der Lösung mit einem UV-Vis-Spektralphotometer. Der Extinktionskoeffizient von AlPcS2a bei 672 nm beträgt 4 x 104 cm-1 M-1. Verdünnen Sie die AlPcS2a-Lösung mit PBS, um eine 1-mM....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Eine schematische Abbildung, die die AlPcS 2a-induzierte Schädigung von IV, einschließlich Endosom und Lysosom, darstellt, wurde gezeigt (Abbildung 1).
Kommerziell erhältliche Marker können verwendet werden, um die AlPcS 2a-Färbebedingungen zu bestimmen. Zum Beispiel die Kolokalisation von AlPcS 2aPuncta und grünem Fluoreszenzfarbstoff22 (Abbildung 2).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
AlPcS2a bindet an die Plasmamembran, wird dann durch Endozytose internalisiert und reichert sich schließlich in Lysosomen an. AlPcS2a kann somit durch Anpassung der Inkubationsdauer in den subzellulären Kompartimenten lokalisiert werden. Eine Einschränkung dieser Methodik besteht darin, dass nur eine Subpopulation von IVs durch Endozytose durch AlPcS2a markiert werden konnte, da es viele andere Membranquellen für IVs gibt, wie z.B. ER- und Golgi-Apparate. Darüber hinaus wäre die selektive.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Die Autoren danken der Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS, für die Unterstützung bei der Forschung. Die Core Facility wird durch das Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213) finanziert. Die Autoren danken der Common Equipment Core Facility des Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) für die Unterstützung bei der Bildaufnahme.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz | |||
| Phthalocyaninchlorid-Disulfonsäure (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Kulturschale | ibidi | 812128-200 | |
| Kulturmedium | DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 100 U/mL Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP Plasmid | Addgen | ||
| Lipofectamine 3000 Kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Grün DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | grün fluoreszierender Farbstoff |
| Multiwall Platte | Perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 |
| Zelllinie | |||
| HeLa-Zelllinie | ATCC | CCL-2 | Die Methoden sind für die meisten der angehängten Zelllinien anwendbar. Die Bedingungen müssen individuell festgelegt werden. |
| Ausrüstungen | |||
| 0.22 µ m Filter | Merck | SLGV013SL | |
| kollimierte LED-Leuchte (660 nm) | Thorlabs | M660L3-C1 und DC2100 | Nahinfrarotlicht ist die ideale Basis für das Anregungsspektrum von AlPcS2a. |
| Konfokale Mikroskopie | Carl Zeiss | LSM 780 | Für die Langzeitbildgebung ist ein Inkubationssystem erforderlich. |
| NanoDrop 2000/2000c Spektralphotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED Licht | Tholabs | M660L4-C1 |
Referenzen
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
