Methodenartikel

Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur

DOI:

10.3791/63962

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17. März 2023

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1Inflammation Core Facility, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die AlPcS2a-vermittelte Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.

Zusammenfassung

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Intrazelluläre Vesikel (IVs) werden durch Endozytose von Vesikeln in das Zytoplasma gebildet. Die IV-Bildung ist an der Aktivierung verschiedener Signalwege durch Permeabilisierung von IV-Membranen und die Bildung von Endosomen und Lysosomen beteiligt. Eine Methode namens Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) wird angewendet, um die Bildung von Infusionen und die Materialien zur Steuerung der Infusionsregulation zu untersuchen. CALI ist eine bildgebende photodynamische Methode zur Untersuchung des durch Membranpermeabilisierung induzierten Signalwegs. Die Methode erlaubt es, die selektierte Organelle räumlich und zeitlich in einer Zelle zu permeabilisieren. Die CALI-Methode wurde angewendet, um bestimmte Moleküle durch die Permeabilisierung von Endosomen und Lysosomen zu beobachten und zu überwachen. Es ist bekannt, dass der Membranriss von IVs selektiv glykanbindende Proteine wie Galektin-3 rekrutiert. Hier beschreibt das Protokoll die Induktion einer IV-Ruptur durch AlPcS2a und die Verwendung von Galektin-3 als Marker zur Markierung beeinträchtigter Lysosomen, was nützlich ist, um die nachgeschalteten Effekte der IV-Membranruptur und ihre nachgeschalteten Effekte unter verschiedenen Situationen zu untersuchen.

Einleitung

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Endosomen, eine Art intrazellulärer Vesikel (IV), werden durch Endozytose gebildet und reifen dann zu Lysosomen heran. Verschiedene intrazelluläre Signalwege sind an der Bildung von Infusionen beteiligt; Darüber hinaus können unterschiedliche intrinsische und extrinsische Reize IVs schädigen (z. B. können Krankheitserreger während der Infektion aus der gebundenen Membran entweichen und in das Zytoplasma1 gelangen). Dies geht in der Regel mit der Ruptur endozytotischer Vesikeleinher 2. Daher können die Techniken zur gezielten und schädigenden Infusion in verwandten Studienverwendet werden 3.

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Protokoll

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1. AlPcS2a Stoffaufbereitung

  1. 10 mg AlPcS2a werden in 400 μl 0,1 M NaOH gelöst. Um die Löslichkeit zu verbessern, erhitzen Sie die Lösung auf 50 °C und wirbeln Sie sie.
  2. Mischen Sie die Lösung mit 4 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Filtrieren Sie dann die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter, um die unlöslichen Ausfällungen zu entfernen.
  3. Messen Sie die Konzentration der Lösung mit einem UV-Vis-Spektralphotometer. Der Extinktionskoeffizient von AlPcS2a bei 672 nm beträgt 4 x 104 cm-1 M-1. Verdünnen Sie die AlPcS2a-Lösung mit PBS, um eine 1-mM....

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Ergebnisse

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Eine schematische Abbildung, die die AlPcS 2a-induzierte Schädigung von IV, einschließlich Endosom und Lysosom, darstellt, wurde gezeigt (Abbildung 1).

Kommerziell erhältliche Marker können verwendet werden, um die AlPcS 2a-Färbebedingungen zu bestimmen. Zum Beispiel die Kolokalisation von AlPcS 2aPuncta und grünem Fluoreszenzfarbstoff22 (Abbildung 2).

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Diskussion

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AlPcS2a bindet an die Plasmamembran, wird dann durch Endozytose internalisiert und reichert sich schließlich in Lysosomen an. AlPcS2a kann somit durch Anpassung der Inkubationsdauer in den subzellulären Kompartimenten lokalisiert werden. Eine Einschränkung dieser Methodik besteht darin, dass nur eine Subpopulation von IVs durch Endozytose durch AlPcS2a markiert werden konnte, da es viele andere Membranquellen für IVs gibt, wie z.B. ER- und Golgi-Apparate. Darüber hinaus wäre die selektive.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

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Die Autoren danken der Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS, für die Unterstützung bei der Forschung. Die Core Facility wird durch das Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213) finanziert. Die Autoren danken der Common Equipment Core Facility des Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) für die Unterstützung bei der Bildaufnahme.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
Phthalocyaninchlorid-Disulfonsäure (AlPcS2a)Frontier ScientificP40632
Kulturschaleibidi812128-200
KulturmediumDMEM, ergänzt mit 10% FBS und 100 U/mL Penicillin G und 100 mg/ml Streptomycin
DMEMGibco11965092
FBSThermo Fisher ScientificA4736301
Gal3-GFP PlasmidAddgen
Lipofectamine 3000 KitThermo Fisher ScientificL3000008
LysoTracker Grün DND-26Thermo Fisher ScientificL7526grün fluoreszierender Farbstoff
Multiwall PlattePerkinelmerPK-6005550
NaOHThermo Fisher ScientificQ15895
OptiMEMThermo Fisher Scientific31985070
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco21600-069137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
Zelllinie
HeLa-ZelllinieATCCCCL-2Die Methoden sind für die meisten der angehängten Zelllinien anwendbar. Die Bedingungen müssen individuell festgelegt werden.
Ausrüstungen
0.22 µ m FilterMerckSLGV013SL
kollimierte LED-Leuchte  (660 nm)ThorlabsM660L3-C1 und DC2100Nahinfrarotlicht ist die ideale Basis für das Anregungsspektrum von AlPcS2a.
Konfokale MikroskopieCarl ZeissLSM 780Für die Langzeitbildgebung ist ein Inkubationssystem erforderlich.
NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerThermo Fisher Scientific
Red LED LichtTholabsM660L4-C1
Al(III)-

Referenzen

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  1. Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972(2014).
  2. Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective....

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Schlagwörter

Chromophor unterst tzte Laserinaktivierunglysosomale MembranpermeabilisierungEndozytosewegGalectin 3 MarkerKonfokalmikroskopieHeLa ZellkulturAlPcS2a FarbstoffEndosomenbildungphotodynamische Methode

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