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Methodenartikel

Bekämpfung von Aedes albopictus Mückenlarven mit Carpesium abrotanoides L.

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DOI:

10.3791/63976

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23. August 2022

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1Qiannan Medical College for Nationalities, 2Key Laboratory of Human Parasitic Diseases in Qiannan Prefecture, 3Guizhou Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Verwendung der Pflanze Carpesium abrotanoides L. zur Bekämpfung von Mückenlarven kann die Population der Aedes albopictus-Mücke effektiv reduzieren und eine Grundlage für die Entwicklung pflanzlicher Insektizide bilden.

Zusammenfassung

Als lebenswichtiger Überträger von Dengue-Fieber, Gelbfieber und anderen durch Mücken übertragenen Krankheiten kann Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) weltweit weit verbreitet sein und eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit darstellen. Angesichts der schnell aufkommenden Insektizidresistenz bei der Mücke ist die Entwicklung neuer botanischer Insektizide zur Bekämpfung und Reduzierung von Ae. albopictus bis heute dringend und entscheidend. Um die Abkochwirkung der Pflanze C. abrotanoides L. auf die Abtötung von Mückenlarven zu untersuchen, haben wir daher die Mortalität von Larven nach Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen (60 mg/ml, 120 mg/ml und 180 mg/ml) Abkochung innerhalb einer Reihe von Zeitpunkten (12 h, 24 h, 36 h und 48 h) nachgewiesen. Wir fanden heraus, dass eine 24-stündige Behandlung mit 180 mg/ml C. abrotanoides L. Abkochung 92,35% der Mücken im Vergleich zur Kontrollbehandlung tötete. In der Zwischenzeit könnten 36 h mit 120 mg/ml auch mehr als 90% der Mücken töten. Darüber hinaus waren die Populationen von Carassius auratus 36 Stunden lang einer Abkochung von 120 mg/ml C. abrotanoides L. ausgesetzt und starben nicht. Die Mortalitätsbewertung ergab, dass diese Konzentration kein schädliches Maß an ökologischer Umweltbelastung darstellt. Diese Studie liefert einen möglichen Pflanzenkandidaten, der für die Entwicklung von Insektiziden pflanzlichen Ursprungs verwendet werden könnte. Darüber hinaus können diese Methoden verändert und auf andere Mückenarten angewendet werden.

Einleitung

Aedes albopictus, auch bekannt als "Asiatische Tigermücke", kann eine Vielzahl von Krankheiten wie Dengue-Fieber, Chikungunya-Fieber und Zika-Viruskrankheit übertragen, indem es menschliches und tierisches Blut saugt1. Aufgrund der weiten Verbreitung von Ae. albopictus hat sich die epidemische Situation durch durch Stechmücken übertragene Krankheiten wie das Dengue-Fieber in den letzten Jahren immer weiter verschärft und stellt eine ernsthafte Bedrohung für das Leben und die Gesundheit der Menschen weltweit dar2. Derzeit gibt es für die meisten durch Mücken übertragenen Krankheiten keinen wirksamen Impfstoff oder ein spezifisches therapeutisches Medikament. Das Töten von Mücken mit chemischen Insektiziden ist nach wie vor das wichtigste Mittel zur Bekämpfung von durch Mücken übertragenen Krankheiten3. Die chemische Bekämpfungsmethode mit chemischen Insektiziden kann Mücken schnell und effizient töten und hat sich zum Hauptmittel zur Bekämpfung von Mückenvektoren entwickelt4. Der langfristige und großflächige Einsatz von Insektiziden hat jedoch zu einem Rückgang der Empfindlichkeit von Ae. albopictus gegenüber Insektiziden und der Insektizidresistenz geführt, was zum größten Hindernis bei der Bekämpfung von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten geworden ist. Daher ist es von großer praktischer Bedeutung, eine neue Art von Mückeninsektiziden mit hoher Effizienz, Sicherheit und Umweltschutz zu entwickeln.

In der Natur sind Pflanzen die Hauptproduzenten. Insekten und viele Tiere fressen Pflanzen. Wenn Pflanzen unter verschiedenen "Naturkatastrophen und menschengemachten Katastrophen" leiden, produzieren sie Sekundärmetaboliten, um zu überleben. Diese Substanzen haben oft die Fähigkeit, der Nahrungs-, Krankheits- und Insektenresistenz anderer Organismen zu widerstehen. Sie wirken nicht nur auf eine Vielzahl von Schädlingen, sondern haben auch ein geringes Risiko für Umwelttoxizität5. Carpesium abrotanoides L. ist ein mehrjähriges Kraut der Gattung Carpesium abrotanoides der Compositae, die auch als "Krötenblau", "Hirschgras", "wilder Tabak" usw. bekannt ist. Es ist in China und Ostasien weit verbreitet. Seine Stängel und Blätter können in diesen Bereichen als Insektizide zur Behandlung von Schürfwunden und Fieber eingesetzt werden6. Seine Frucht ist in China lokal als "Bei-He-Shi" bekannt und wird in der Volksmedizin zur Behandlung von Bandwürmern und Ascaris lumbricoiden verwendet 7,8. Es wurde berichtet, dass die Pflanze reich an Monoterpenen, Sesquiterpenen, Phenolen und anderen charakteristischen Bestandteilen ist und wirksame pharmakologische Wirkungen hat, wie z. B. entzündungshemmende, antimykotische, antiparasitäre, antitumorale und antivirale Wirkungen7. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es eine antifütternde Wirkung auf Spodoptera exigua9, eine Kontakttoxizität für Sitophilus zeamais10, eine abtötende Fähigkeit für cysticercus cellulosae von Taenia asiatica8, eine antifütternde Wirkung und eine Kontakttoxizität für Heerwürmer und Plutella xylostella11 hat. Erste Fortschritte wurden bei der Untersuchung der toxischen Wirkungen von C. abrotanoides L. auf einige Parasiten, landwirtschaftliche Schädlinge und sanitäre Schädlinge erzielt, die zur Bekämpfung der Larven von Aedes albopictus eingesetzt werden können.

In dieser Studie wird das Protokoll zur Kontrolle von Ae. albopictus-Larven mit C. abrotanoides L. diskutiert. In diesem Protokoll wurde die Abkochung von C. abrotanoides L. verwendet, um auf die Larven des vierten Stadiums von Ae. albopictus einzuwirken, und der Tod der Larven wurde nach Behandlung mit C. abrotanoides L. Abkochung in verschiedenen Konzentrationen (60 mg/ml, 120 mg/ml und 180 mg/ml) zu einer Reihe von Zeitpunkten (12 h, 24 h, 36 h, und 48 h). Die Bestimmung der abtötenden Wirkung von C. abrotanoides L. Abkochung auf Ae. albopictus-Larven bietet eine neue Idee für eine weitere Mückenbekämpfung mit hoher Effizienz, geringer Toxizität und dem Einsatz umweltfreundlicher pflanzlicher Insektizide.

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Protokoll

Das Ziegenblut, das zur Fütterung weiblicher Mücken verwendet wird, wurde in einem örtlichen Schlachthof in Duyun City, Guizhou, China, gesammelt und gemäß den ethischen Richtlinien und Vorschriften des Key Laboratory of Human Parasitic Diseases in der Präfektur Qiannan, Duyun, Guizhou, China, verwendet.

1. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Geräte, Reagenzien und anderen Verbrauchsmaterialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

  1. Extraktion und Identifizierung von C. abrotanoides L.
    1. Sammeln Sie das ganze Gras von C. abrotanoides L. Das ganze Gras von C. abrotanoides L. in dieser Studie wurde im April 2021 im Autonomen Kreis Sandu Shui in der Provinz Guizhou (N: 25,95, E: 107,87) gesammelt.Die Fotos von der Sammelstelle für C. abrotanoides L. in Abbildung 1.
      ANMERKUNG: Entsprechend der Ressourcenverteilung, den medizinischen Eigenschaften, der Gewebestruktur und den physikalischen und chemischen Identifizierungsmerkmalen von C. abrotanoides L. ist die Identifizierung von C. abrotanoides L. war wie folgt: Die ganze Pflanze ist 30-100 cm hoch, mit aufrechten Stielen, viele Zweige im oberen Teil, abwechselnde Blätter im unteren Teil des Stängels, leicht gestielt, ovale Blätter, 10-15 cm lang und 5-8 cm breit, voll oder unregelmäßig gezackt, Blätter im oberen Teil des Stängels sind fast sitzend, lang oval, Nach oben hin allmählich kleiner, und der Kopf ist axillär, fast sitzend, mit hängenden Blüten, besonderem Gas, leichtem Geschmack und scharf. Die Pflanze wurde von Lehrern, die sich auf traditionelle chinesische Medizin spezialisiert haben, an unseren Standorten als C. abrotanoides L. identifiziert.
  2. C. abrotanoides L. Reinigen, Trocknen und Zerkleinern
    1. Entfernen Sie die gesammelten C . abrotanoides L. von den verunreinigten Blättern und Erde und reinigen Sie sie. 10-15 Tage an der Luft unter belüfteten Bedingungen trocknen lassen oder im trockenen Ofen bei 95 °C für 6 h trocknen.
      HINWEIS: Während des Trocknungsprozesses von C. abrotanoides L. muss es umgedreht werden, damit es gleichmäßig trocknen kann. Wenn das Gewebe von C. abrotanoides L. während des Zerkleinerungsprozesses nicht leicht zerkleinert werden kann, kann es erneut getrocknet und dann zerkleinert werden.
  3. Zubereitung von C. abrotanoides L. Essenz-Abkochung
    1. 360 g raffiniertes Pulver von C. abrotanoides L. abwiegen, 1000 ml destilliertes Wasser hinzufügen und 2 h lang bei langsamem Feuer (Leistung 800 W) dekotieren.
    2. Filtern Sie den Sud mit gewöhnlichem Filterpapier und konzentrieren Sie ihn dann in einem Rotationsverdampfer, um ein Extraktum herzustellen. Verdünnen Sie das Extraktum mit destilliertem Wasser auf 1000 ml und bereiten Sie einen C. abrotanoides L vor.Abkochung mit raffiniertem Wasser mit 360 mg/ml des ursprünglichen Arzneimittels.
    3. Nehmen Sie 50 ml, 100 ml und 150 ml C. abrotanoides L. verfeinerten Wassersud und verdünnen Sie sie, um Wasserabkochungen herzustellen, die 120 mg/ml, 240 mg/ml und 360 mg/ml der ursprünglichen medizinischen Materialien enthalten, jeweils 150 ml für den Standby-Modus.
      HINWEIS: Während des Kochvorgangs sollte die Hitze gut kontrolliert werden. Nach dem Kochen wurde die Hitze reduziert und die Flüssigkeit auf 100 °C gehalten und leicht gekocht.

2. Vorbereitung der Mückenprobe

  1. Quelle der Mücken
    1. Sammlung von Ae. albopictus-Larven . In dieser Studie wurden die Larven von Ae. albopictus im August 2020 in der Wohngegend der Stadt Duyun (N: 26.25, E: 107.52) in der Provinz Guizhou gesammelt.
    2. Entsprechend der Verbreitung, der morphologischen Merkmale der Larven und adulten Tiere von Ae. albopictus ergab sich die Identifizierung von Aedes albopictus wie folgt: Die Basis von Ctenophora von Aedes albopictus-Larven hat eine feine Ausdehnung; unvollständiger Hecksattel; Der Beatmungsschlauch ist schwarz, kurz und dick; Die erwachsenen Tiere von Aedes albopictus sind kleine bis mittelgroße Mücken. Die weibliche Mücke ist mittelgroß und schwarz. Das mittelthorakale Scutellum hat einen weißen Längsstreifen, der sich in der Regel nach hinten hin allmählich verjüngt und sich im vorderen Bereich des kleinen Scutellums gabelt. Das Fußgelenk hat einen weißen Basisring, und das gesamte oder der größte Teil des Gelenks 5 ist weiß. Die Mücken wurden von den Lehrern für Parasitologie und Mückenspezialisierung an unseren Standorten als Ae. albopictus identifiziert.
    3. Halten Sie die konventionelle Fütterung bei einer Temperatur von 25 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 70 % ± 10 % aufrecht und verwenden Sie eine 80-W-Leuchtstofflampe als Lichtquelle (hell: dunkel = 14 h:10 h).
    4. Füttern Sie die Larven mit Hühnerleberpulver und erwachsene Mücken mit 10 % Zuckerwasser.
  2. Sammeln von Mückeneiern
    1. Wenn die Larven von Ae. albopictus zu Puppen herangewachsen sind, saugen Sie die Puppen mit einer Einweg-Pasteurpipette aus Kunststoff aus und übertragen Sie sie in den Käfig der erwachsenen Mücke.
    2. Nach 3-5 Tagen des Schlüpfens der adulten Mücken paaren sich die weiblichen und männlichen Mücken. Füttern Sie zu diesem Zeitpunkt die weiblichen Mücken 4-8 Stunden lang mit Blut.
      HINWEIS: Das mit Antikoagulans versetzte Blut wurde in eine Kulturschale gegeben, mit 37 °C warmem Wasser erhitzt und mit einer Schicht Mulltuch bedeckt, damit weibliche Mücken Blut saugen konnten.
    3. Sammeln Sie die Eier von Aedes albopictus mit einem Eierauffangbecher (selbstgemacht: 300 ml gerader, undurchsichtiger Plastikbecher mit 250 ml destilliertem Wasser, und dann wurde das Filterpapier zur Hälfte um den inneren Rand des Bechers eingetaucht).
      HINWEIS: Die Eier von Ae. albopictus können 3-6 Monate gelagert werden.
  3. Schlüpfen und Füttern von Mücken
    1. Während des Experiments schlüpfte Ae. albopictus in der Regel 1 Woche vor dem Experiment. Legen Sie die Eier von Aedes albopictus auf eine Emailleplatte, fügen Sie 1000 ml Leitungswasser hinzu und lassen Sie es länger als 24 Stunden stehen. Aus den Eiern schlüpfen in 1-2 Tagen Larven.
    2. Die Larven häuteten sich alle 1-2 Tage, d.h. sie nahmen um ein Stadium zu. Selektieren Sie 1000 Larven am Ende des dritten oder zu Beginn des vierten Stadiums, nachdem Sie 2-3 Generationen lang gezüchtet haben, ohne für den Test mit chemischen Insektiziden im Labor in Berührung zu kommen.
      HINWEIS: Wenn die Dichte der Larven zu hoch ist, teilen Sie sie in Platten auf, damit die Larven normal wachsen können.

3. Nachweis der toxischen Wirkung von C. abrotanoides L. Abkochung auf Larven von Ae. albopictus durch die Tauchmethode

  1. Gruppierung festlegen
    1. Stellen Sie die Versuchsgruppe ein: Bereiten Sie C . abrotanoides L. Abkochungen (50 mL) mit drei Wirkstoffkonzentrationen (120 mg/ml, 240 mg/ml und 360 mg/ml) vor.
    2. Blanko-Kontrollgruppe: Verwenden Sie entchlortes Wasser (hausgemacht: Leitungswasser mit einer Standzeit von mehr als 24 Stunden) mit dem gleichen Volumen wie das Medikament.
    3. Positive Kontrollgruppe: Bereiten Sie das Medikament Deltamethrin, ein gängiges chemisches Insektizid, in einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml vor.
  2. Zugabe von flüssigen Medikamenten
    1. Verwenden Sie mehrere Einweg-Plastikbecher mit einem Volumen von mehr als 200 ml und geben Sie 35 Ae. albopictus-Larven am Ende des dritten oder zu Beginn des vierten Stadiums zu 50 ml entchlortem Wasser.
    2. In der Versuchsgruppe 50 ml C. abrotanoides L. verfeinertes Wasser Desud jeder Konzentration hinzufügen, leicht schütteln und gleichmäßig mischen, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erhalten. Die Endkonzentrationen der Abkochung von raffiniertem Wasser in C. abrotanoides L. betragen 60 mg/ml, 120 mg/ml und 180 mg/ml.
    3. Geben Sie in der Blindkontrollgruppe 50 mL entchlortes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 100 mL hinzu und markieren Sie sie als Blindkontrolle.
    4. In der Positivkontrollgruppe werden 50 ml Deltamethrinlösung mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml zugegeben, vorsichtig geschüttelt und gleichmäßig über ein Gesamtvolumen von 100 ml bis zu einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml gemischt und als Positivkontrolle gekennzeichnet.
  3. Beobachtungen
    1. Bringen Sie die markierten Plastikbecher vorsichtig in den Beobachtungsraum mit der gleichen Fütterungsumgebung und notieren Sie den Tod von Ae. albopictus-Larven in jeder Versuchs- und Kontrollgruppe nach 12 Stunden, 24 Stunden, 36 Stunden bzw. 48 Stunden. Beobachten Sie die toten Individuen unter dem Mikroskop und vergleichen Sie sie mit den normalen Larven von Ae. albopictus .
    2. Wenn die Larven zum oben genannten Beobachtungszeitpunkt mit einer scharfen, feinen Nadel gerührt wurden und nicht entkommen konnten oder nicht reagierten, betrachten Sie sie als tot. Wiederholen Sie den Test dreimal.
      HINWEIS: Wenn die Mortalität der Larven in der Kontrollgruppe 20 % überstieg, waren die Testergebnisse ungültig und mussten wiederholt werden. Der Gesamtansatz ist in Abbildung 2 zusammengefasst.

4. Simulationsexperiment im Freien

  1. Wenden Sie die drei Konzentrationen von C. abrotanoides L. Abkochung auf Ae. albopictus-Larven unter Freilandbedingungen an, um das Absterben der Larven zu beobachten. Vergleichen Sie, ob es einen Unterschied zwischen der toxischen Wirkung und der im Labor gibt.
  2. Wenden Sie die drei Konzentrationen von C. abrotanoides L. verfeinerter Wasserabkochung auf wilde Karausche unter Freilandbedingungen an, um zu beobachten, ob dies das Wachstum der Karausche beeinflusst. Damit soll vorläufig beurteilt werden, ob die C. abrotanoides L.Die Abkochung von raffiniertem Wasser schädigt die ökologische Umwelt.
    HINWEIS: Die Konzentrationen entsprachen den in Schritt 3.2.2 genannten Konzentrationen. Die verwendeten Zeitpunkte sind 12 h, 24 h, 36 h bzw. 48 h. Die Wirkung des Feldsimulationsexperiments wurde durch den Vergleich der Mortalität von Ae. albopictus, die mit C . abrotanoides L. Abkochung behandelt wurden, unter Laborfütterungsbedingungen und natürlichen Bedingungen im Freien beurteilt.

5. Statistische Analyse

  1. Drücken Sie die quantitativen Daten im Mittelwert ± SD und die Zähldaten in Prozent (%) aus.
    HINWEIS: Die hier verwendete statistische Inferenzmethode betrug p < 0,05, und die Differenz war statistisch signifikant.
  2. Verwenden Sie geeignete Software für die statistische Analyse der Daten, und die Toxizitäten von drei verschiedenen Konzentrationen von C. abrotanoides L. decoction gegenüber Ae. albopictus-Larven wurden verwendet, um vorläufig zu bestimmen, welche Abkochkonzentration die beste Toxizität für Ae. albopictus-Larven aufwies.

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Ergebnisse

Hier wurde ganzes Gras von C. abrotanoides L. in dieser Studie aus der Wildnis gesammelt (Abbildung 1). Nach der Identifizierung von C. abrotanoides L. wurde die Abkochung von C. abrotanoides L. nach der Abkochmethode (Abbildung 2) erhalten und in verschiedenen Konzentrationen (60 mg/ml, 120 mg/ml und 180 mg/ml) hergestellt. Es wurde auf Ae. albopictus-Larven mit der Larventauchmethode angewendet. Es...

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Diskussion

Derzeit gehört Ae. albopictus zu den 100 invasivsten Arten der Welt. Laut Statistiken der Weltgesundheitsorganisation (WHO) werden im Jahr 2020 die am stärksten von Ae. albopictus betroffenen Gebiete in Asien etwa 70 % der weltweiten Krankheitslast ausmachen12. Als lebenswichtiger Überträger von Dengue-Fieber, Gelbfieber und anderen durch Mücken übertragenen Krankheiten kann Ae. albopictus weltweit weit verbreitet sein und eine ernsthaft...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken Dr. Xin-Ru Wang von der University of Minnesota für ihre aufschlussreichen Vorschläge und Anleitungen. Diese Arbeit wurde durch den wissenschaftlichen Forschungsfonds des Qiannan Medical College for Nationalities (Qnyz202112, QNYZ202205) und den Wissenschafts- und Technologiefonds der Gesundheitskommission der Provinz Guizhou (qwjh [2022] Nr. 101, Projekt gzwkj2023-251) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aceton (analytische Reinheit)Shanghai Shenbo Chemical Co., Ltd
Karausche KarpfenGuangzhou Yunfeng Aquaculture Co., Ltd
Hühnerleberpulverselbst hergestellt
Entchlortes Wasserselbst hergestelltDas Leitungswasser steht mehr als 24 Stunden
Deltamethrin technischNanjing Lesheng Biotechnology Co. , LtdReinheit: 94,62%
Einweg-PlastikbecherGuizhou Fuqiang Technologie Packaging Co., Ltd220ML-A1
Eierauffangbecherselbst gemacht
Elektrischer SchnelltrocknungsofenHangzhou Aipu Instrument Equipment Co., LtdWGLL-230BE
Elektrische WasserdestillerieBeijing Xinrun Kono Instrument Co., LtdTT-98-II
GraphPad PrismGraphPad SoftwareDatenverarbeitungs- und Grafiksoftware
Integriertes DigitalmikroskopChongqing Aote Optical Instrument Co., LtdSMARTe-500
Moskito-FütterungskäfigNanjing Lesheng Biotechnology Co., Ltdnach Maß
Multifunktionaler InduktionsherdGuangdong Midea Living Appliance Manufacturing Co., LtdC21-WK2102maßgeschneidertes
qualitatives FilterpapierHangzhou Fuyang Beimu Zellstoff und Papier Co., Ltd15cm-102
RotationsverdampferHenan Jingbang Instrument Equipment Co., LtdR-1010
Kleiner BrecherJinhua Mofei Haushaltsgeräte Co., LtdCHY-6001
SPSS Version 25.0IBMstatistische Software
Standard-ProbensiebHebei Hengshui Anping lvruo Drahtgeflechtprodukte Co., Ltd100-30maßgeschneidertes
Zuckerwasser, 10%selbst gemacht

Referenzen

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