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Methodenartikel

Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

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DOI:

10.3791/63979

⸱

17. Februar 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.

Zusammenfassung

Insulinresistenz ist eine verminderte Wirkung von Insulin auf seine Zielzellen, die in der Regel auf eine verminderte Signalübertragung der Insulinrezeptoren zurückzuführen ist. Insulinresistenz trägt zur Entwicklung von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen durch Fettleibigkeit verursachten Krankheiten mit hoher Prävalenz weltweit bei. Daher ist es von großer Relevanz, die Mechanismen zu verstehen, die der Insulinresistenz zugrunde liegen. Mehrere Modelle wurden verwendet, um die Insulinresistenz sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. Primäre Adipozyten stellen eine attraktive Option dar, um die Mechanismen der Insulinresistenz zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die diesem Zustand entgegenwirken, sowie die molekularen Ziele von insulinsensibilisierenden Medikamenten. In dieser Arbeit haben wir ein Insulinresistenzmodell mit primären Adipozyten in Kulturen etabliert, die mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden.

Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), die aus Kollagenase-verdautem subkutanem Fettgewebe der Maus mittels Magnetzelltrennungstechnologie isoliert wurden, werden in primäre Adipozyten differenziert. Die Insulinresistenz wird dann durch die Behandlung mit TNF-α induziert, einem proinflammatorischen Zytokin, das die Tyrosinphosphorylierung/-aktivierung von Mitgliedern der Insulinsignalkaskade reduziert. Die verminderte Phosphorylierung des Insulinrezeptors (IR), des Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) und der Proteinkinase B (AKT) wird mittels Western Blot quantifiziert. Diese Methode bietet ein hervorragendes Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln.

Einleitung

Insulin ist ein anaboles Hormon, das von den β-Zellen der Pankreasinsel produziert wird und der Schlüsselregulator des Glukose- und Fettstoffwechsels ist. Insulin reguliert unter anderem die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Gluconeogenese, die Proteinsynthese, die Lipogenese und die Lipolyse1. Das erste molekulare Signal nach der Interaktion von Insulin mit seinem Rezeptor (IR) ist die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität von IR2, was zu seiner Autophosphorylierung3 und der anschließenden Aktivierung einer Familie von Proteinen führt, die als Insulinrezeptorsubstrate (IRS) bekannt sind und an Adapterproteine binden, was zur Aktivierung einer Kaskade von Proteinkinasenführt 4 . Insulin aktiviert zwei Hauptsignalwege: die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Proteinkinase B (AKT) und die Ras-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK). Ersterer stellt einen wichtigen Verzweigungspunkt oder Knoten 4,5 für die Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter Effektoren dar, die an verschiedenen physiologischen Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Brennstoffhomöostase, während letzterer das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung reguliert 4,6. Die Insulinwirkung hängt letztendlich vom Zelltyp und dem physiologischen Kontext ab7.

Eines der wichtigsten insulinempfindlichen Stoffwechselgewebe ist das Fettgewebe. Weißes Fettgewebe ist die am häufigsten vorkommende Art von Fett bei Menschen und Nagetieren, verteilt in subkutanem Fett (zwischen Haut und Muskeln) und viszeralem Fett (um die Organe in der Bauchhöhle). Aufgrund ihres großen Volumens sind Adipozyten oder Fettzellen der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Fettgewebe. Diese Fettzellen können braun/beige (thermogen), rosa (in der Brustdrüse) und weiß sein 8,9. Weiße Adipozyten halten die wichtigsten Energiereserven im Körper in Form von Triglyceriden, einem insulinabhängigen Prozess. Insulin fördert den Glukosetransport und die Lipogenese, während es die Lipolyse oder den Lipidabbau hemmt 7,10. Es erleichtert auch die Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten – die reifen fettspeichernden Zellen11.

Eine Insulinresistenz tritt auf, wenn ein normaler Insulinspiegel eine abgeschwächte biologische Reaktion hervorruft, was zu einer kompensatorischen Hyperinsulinämie führt12. Insulinresistenz ist eine Erkrankung, die mit Übergewicht und Adipositas einhergeht5 und in Kombination zu Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen Stoffwechselerkrankungen führt13. Hyperinsulinämie kompensiert die Insulinresistenz im peripheren Gewebe, um einen normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten14. Ein eventueller Verlust oder eine Erschöpfung β Zellen führt jedoch zusammen mit einer verschlimmerten Insulinresistenz zu erhöhten Blutzuckerspiegeln, die mit T2D5 übereinstimmen. Daher können Insulinresistenz und Hyperinsulinämie zur Entwicklung von Adipositas-bedingten Stoffwechselerkrankungen beitragen15. Darüber hinaus kann Adipositas eine chronische, niedriggradige lokale Entzündung verursachen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe fördert15,16,17. Darüber hinaus führen durch Fettleibigkeit verursachte Veränderungen des Fettgewebes, wie z. B. Fibrose, Entzündungen und eine verminderte Angiogenese und Adipogenese, zu niedrigeren Adiponektin-Serumspiegeln (einem Insulinsensibilisator) und einer erhöhten Sekretion von Faktoren wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1), freien Fettsäuren und Exosomen in den Blutkreislauf, was die Insulinresistenz verschlimmert17.

Viele Aspekte, die der Insulinresistenz zugrunde liegen, sind noch unbekannt. In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden entwickelt, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz in wichtigen Zielgeweben, einschließlich des Fettgewebes, vermitteln. Der Vorteil von In-vitro-Modellen besteht darin, dass die Forscher die Umweltbedingungen besser kontrollieren und die Insulinresistenz in bestimmten Zelltypen beurteilen können. Insbesondere Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) weisen den individuellen Phänotyp des Spendergewebes auf, der die Physiologie besser widerspiegeln könnte als Adipozyten-Zelllinien. Ein Hauptfaktor, der die Insulinresistenz in vitro induziert, ist der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von Adipozyten und Makrophagen im Fettgewebe sezerniertwird 18. Während es für den korrekten Umbau und die Expansion des Fettgewebes erforderlich ist19, induziert eine langfristige Exposition gegenüber TNF-α eine Insulinresistenz im Fettgewebe in vivo und in Adipozyten in vitro20. Die chronische TNF-α-Behandlung verschiedener Zelltypen führt zu einer erhöhten Serinphosphorylierung sowohl von IR als auch von IRS-1, wodurch eine verminderte Tyrosinphosphorylierung gefördertwird 21. Eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 auf Serinresten hemmt die Aktivität der IR-Tyrosinkinase und könnte einer der Schlüsselmechanismen sein, durch die eine chronische TNF-α-Behandlung die Insulinwirkung beeinträchtigt22,23. TNF-α aktiviert Signalwege, die den Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor der nukleären Faktor-ĸB-Kinase β (IKKβ) und der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) betreffen24. JNK induziert ein komplexes proinflammatorisches Transkriptionsprogramm, phosphoryliert aber auch direkt IRS-16.

Das Verständnis der Pathogenese der Insulinresistenz wird immer wichtiger, um die Entwicklung zukünftiger Therapien gegen T2D zu steuern. APCs haben sich als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Fettzellbiologie, einschließlich der Sensitivität und Resistenz gegenüber Insulin, und für die Identifizierung der intrinsischen Eigenschaften von Adipozyten unabhängig von der systemischen Umgebung erwiesen. APCs können leicht aus verschiedenen Fettdepots gewonnen und unter geeigneten Bedingungen in reife Adipozyten differenziert werden. Mit dieser Methode können direkte Effekte auf die Insulinresistenz/-sensitivität in Adipozyten untersucht werden.

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Protokoll

Alle Nagetierexperimente wurden von der Bioethikkommission des Instituts für Neurobiologie der UNAM, Protokollnummer 075, genehmigt.

1. Isolierung von Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus

  1. 8-10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse einschläfern (z. B. durch CO2 -Inhalation und anschließende Zervixluxation) (vier Tiere pro Isolierung). Desinfizieren Sie die Mäuse durch Einreiben mit 70%igem Ethanol und erhalten Sie das Fettgewebe sofort nach der Opferung.
    Anmerkungen: Isolieren Sie nach der Euthanasie von Nagetieren sofort das Fettgewebe und führen Sie alle Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Haube durch. Mäuse werden unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten.
  2. Präparieren Sie das inguinale subkutane Fettgewebe jeder Maus. Entfernen Sie nur das Fettgewebe, vermeiden Sie die Entfernung von Muskeln, Haut oder anderem Gewebe und sammeln Sie es in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Kollagenaselösung Typ 1 (1,5 mg/ml) auf Eis. Lösen Sie Typ-1-Kollagenase in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit hohem Glukose-1%-Kälberserumalbumin (BSA) auf und filtrieren Sie durch 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter.
  3. Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere in kleine Stücke und verdauen Sie die Proben durch Inkubation mit Kollagenaselösung Typ 1 bei 37 °C in einem Orbitalschüttler (150 U/min) für 30 min (legen Sie das Röhrchen mit Fett und Kollagenase in eine horizontale Position, um eine größere Schüttelfläche zu erhalten). Überprüfen Sie die Verdauung alle 10 Minuten, um sicherzustellen, dass sie funktioniert (Gewebeabbau ist sichtbar) und um eine Überverdauung zu verhindern (siehe ergänzende Abbildung S1).
  4. Filtern Sie mit einer 200-μm-Netzspritze (zuvor autoklaviert), um Gewebe zu entfernen, das nicht mit Kollagenase verdaut wurde. Führen Sie den Filter über den Rand des Röhrchens, um so viele Zellen wie möglich in die Lösung zu entleeren. Fügen Sie 15 ml kaltes DMEM-1% BSA hinzu, um den Aufschluss zu stoppen, und zentrifugieren Sie bei 400 × g für 10 min bei 4 °C.
  5. Saugen Sie die oberste Schicht mit reifen Adipozyten und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht ab. Vermeiden Sie es, das Pellet zu berühren oder zu stören. Fügen Sie 20 ml kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) - 2 % fötales Kälberserum (FBS) hinzu und resuspendieren Sie das Pellet. Bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  6. Entfernen Sie den Überstand und saugen Sie zuerst die obere Schicht ab, um die verbleibenden Adipozyten und das Fett zu entfernen. Das Pellet wird in 1 ml Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer (ACK) (zur Lyse der roten Blutkörperchen) resuspendiert und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. 10 ml PBS-2% FBS zugeben, mischen und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  7. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl Anti-Fc-Lösung (gereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 der Ratte, verdünnt in PBS-2% FBS [1:150]), um die Fc-Rezeptor-vermittelte Bindung durch interessierende Antikörper zu reduzieren. 5 Minuten auf Eis inkubieren. Die Zellsuspension wird in ein 5-ml-Röhrchen überführt, das in die vorgekühlten Racks eines Magnetzellenseparators passt, und bei 400 × g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
  8. Den Überstand entfernen, 200 μl der Mischung aus monoklonalem CD31(PECAM-1)-Antikörper (390)-Biotin (1:100) und monoklonalem CD45-Antikörper (30-F11)-Biotin (1:100) zugeben, gut mischen und 15 min auf Eis inkubieren (Antikörperverdünnungen in Anti-Fc-Lösung vorbereiten; siehe Tabelle 1). 400 μl PBS-2% FBS zugeben und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: CD31 und CD45 sind Marker von Endothelzellen bzw. hämatopoetischen Zellen.
  9. Den Überstand absaugen und in 100 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen (1:5) 15 min auf Eis inkubieren (Antikörperverdünnungen in Anti-Fc-Lösung vorbereiten, siehe Tabelle 1). 400 μl PBS-2% FBS zugeben und bei 400 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
  10. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 350 μl PBS-2% FBS. Entfernen Sie Zellaggregate oder große Partikel mit einem Vorzerlegungsfilter (70 μm) aus den Einzelzellsuspensionen. Aktivieren Sie zuerst den Filter mit 100 μl PBS-2% FBS, führen Sie die Zellsuspension durch den Filter (sammeln Sie sie in einem sauberen Röhrchen) und waschen Sie den Filter schließlich mit 100 μl PBS-2% FBS.
  11. Führen Sie die magnetische Trennung von Zellen mit der negativen Trennstrategie mit einem magnetischen Zellseparator durch.
    1. Platzieren Sie die Probe in Position A des Kühlracks (stellen Sie sicher, dass das Rack vorgekühlt ist) und zwei leere Röhrchen in Position B und C, um die nicht markierten bzw. markierten Zellen zu gewinnen.
    2. Füllen Sie den Waschpuffer und den Laufpuffer in die entsprechenden Flaschen, bevor Sie das Gerät einschalten. Programmieren Sie das Gerät so, dass es die magnetische Trennung von Zellen mit dem DEPLETE-Protokoll durchführt.
      HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Depletion im Standardmodus zur Entfernung von Zellen mit normaler Antigenexpression (in diesem Fall Zellen, die mit anti-CD31 und anti-CD45 markiert sind) vorgesehen, wenn die Wiederherstellung die höchste Priorität hat.
    3. Wählen Sie im Abschnitt "Trennung" die Anzahl der zu trennenden Proben aus und wählen Sie das DEPLETE-Protokoll aus. Drücken Sie auf Ausführen und starten Sie die Trennung. Am Ende des Programms werden die unmarkierten Zellen zurückgewonnen und bei 400 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert.
  12. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Wachstumsmedium (Tabelle 1).
  13. Die APCs werden in einer Vertiefung einer 12-Well-Platte ausgesät, die zuvor mit einer 2,5-prozentigen Basalmembranmatrix beschichtet wurde (es werden ca. 50.000 bis 75.000 Zellen gewonnen). Fügen Sie 400 μl 2,5 % Basalmembranmatrix hinzu, um die gesamte Oberfläche jeder Vertiefung abzudecken. Lassen Sie die Platte unmittelbar nach dem Entfernen der überschüssigen Lösung und nur einer kleinen Schicht (ohne Deckel) mindestens 1 Stunde lang in der Laminar-Flow-Haube trocknen. Inkubieren bei 37 °C in einer 5%igen CO2 -Atmosphäre. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
  14. Bei einer Konfluenz von 80 % das Medium vollständig entfernen und mit 350 μl PBS-2 % FBS waschen. Die Zellen werden mit 350 μl 0,05%igem Trypsin-EDTA für 2 min bei 37 °C geerntet. Fügen Sie 2 ml Wachstumsmedium hinzu und sammeln Sie die Zellen in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen, dann zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 × g .
  15. Passage der APCs zu 12-Well-Platten (10.000-20.000 Zellen pro Well), die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet wurden. Inkubieren bei 37 °C mit 5% CO2. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
    HINWEIS: Schützenpanzer können einmal durchgelassen werden. In der Folge verlieren sie ihre Fähigkeit, sich zu vermehren und zu differenzieren. Sehen Sie sich den Workflow für den APC-Isolationsprozess in der ergänzenden Abbildung S2 an.

2. Adipozytendifferenzierung und Induktion der Insulinresistenz

HINWEIS: Halten Sie die Zellen bei 37 °C in 5% CO2 und führen Sie Schritte durch, die einen Medienwechsel und Behandlungen mit TNF-α und Insulin in einer sterilen Haube umfassen.

  1. Beginnen Sie bei 80 % Konfluenz mit dem Differenzierungsprozess. Saugen Sie ein beliebiges Nährmedium ab und ersetzen Sie es durch 500 μl Differenzierungsmedium (Tabelle 1), das in jeder Vertiefung 3,3 nM knochenmorphogenetisches Protein (BMP4) enthält.
  2. Nach 48 h wird das Medium durch das Differenzierungsmedium (500 μl pro Well) und den Differenzierungscocktail ersetzt (Tabelle 1).
  3. Entfernen Sie das Medium 72 h später und geben Sie 100 nM Insulin in 500 μl frisches Differenzierungsmedium.
    Anmerkungen: Die Zellen beginnen ein rundes Aussehen mit kleinen Lipidtröpfchen im Inneren zu zeigen.
  4. Saugen Sie ein beliebiges Differenzierungsmedium ab und ersetzen Sie es 48 h später durch 500 μl einfaches Medium-2% FBS (Tabelle 1). Induzieren Sie eine Insulinresistenz mit 4 ng/ml TNF-α. Kontrollvertiefungen ohne TNF-α-Behandlung.
  5. Nach 24 h Inkubation werden 4 ng/ml TNF-α in einfachem mittel-0%igem FBS zugegeben (Tabelle 1). Aufrechterhaltung der Kontrollbrunnen ohne TNF-α-Behandlung.
  6. 24 h später wird der Insulin-Signalweg durch Zugabe von 100 nM Insulin aktiviert und 15 min bei 37 °C in einer 5%igen CO2 -Atmosphäre inkubiert. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit 500 μl PBS. Integrieren Sie Kontrollvertiefungen ohne Insulinbehandlung.

3. Evaluierung des Insulin-Signalwegs mittels Western Blot

  1. Proteinextraktion und -quantifizierung
    1. Waschen Sie jede Vertiefung der Zellen mit 500 μl PBS und lassen Sie sie auf Eis, um die Zellen in 50 μl RIPA-Puffer (Tabelle 1) zu lysieren, der 1 % Protease-Inhibitor-Cocktail enthält, der kurz vor der Probenisolierung hinzugefügt wurde. Kratzen Sie die gesamte Oberfläche der Vertiefung mit einer Spitze ab und übertragen Sie das Lysat in ein 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (auf Eis aufbewahren).
    2. 1 h bei 4 °C in einem rotierenden Schüttler inkubieren, durch Vortexen mischen und bei 8.000 × g 15 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand zurückgewinnen (auf Eis aufbewahren).
    3. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay (verdünnen Sie die Probe nicht, um sie zu quantifizieren).
    4. Das erforderliche Volumen entsprechend 40-60 μg entnehmen und mit 6x Laemmli-Puffer (Tabelle 1) denaturieren, indem bei 97 °C für 15 min unter Schütteln mit 550 U/min inkubiert wird. Bis zur Verwendung einfrieren.
  2. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
    1. Führen Sie eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel mit einer Dicke von 1,5 mm durch. Geben Sie das Gel in den Tank und füllen Sie es mit laufendem Puffer (Tabelle 1).
    2. Geben Sie 3 μl vorgefärbten Proteinstandard in die erste Vertiefung des Gels und laden Sie jede Probe in nachfolgende Vertiefungen.
    3. Lassen Sie das Gel ca. 15 Minuten lang bei 80 V laufen, um sicherzustellen, dass die Probe in die Gelmatrix des Polyacrylamidkonzentrators gelangt. Danach erhöhen Sie die Spannung für 2,5 h auf 90 V oder bis der 37 kDa Molekulargewichtsmarker am unteren Rand des Gels zu sehen ist.
    4. Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran in einer halbtrockenen Kammer für 35 Minuten bei 25 V. Tauchen Sie zuvor das Gel, die Membran und die Filter für einige Minuten in Transferpuffer (Tabelle 1).
  3. Westlicher Fleck
    1. Nach dem Transfer wird die Membran mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (Tabelle 1) 3 Minuten lang unter Schütteln bei 30 U/min gewaschen.
    2. Blockieren Sie die Membran mit Blockierlösung (Tabelle 1) bei 4 °C für 1 h in konstanter Rotation.
    3. Schneiden Sie die Membran entsprechend dem Molekulargewichtsmarker in drei Teile, um über Nacht mit verschiedenen Primärantikörpern (verdünnt in Blockierungslösung) bei 4 °C in konstanter Rotation zu inkubieren: Phospho-IRS1 (Tyr608)-Antikörper (1:1.000), erwartete Bande bei 180 kDa; Phospho-Insulinrezeptor-β Antikörper (Tyr1150/1151) (1:1.000), erwartete Bande bei 95 kDa; Phospho-Akt (Ser473)-Antikörper (1:1.000), erwartete Bande bei 60 kDa.
    4. Waschen Sie die Membranen 5x für je 5 min mit TBS-T 0,1%.
    5. Inkubieren Sie die Membranen mit dem entsprechenden Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper (verdünnt in Blockierlösung) für 2 h bei Raumtemperatur in ständiger Rotation: Peroxidase affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5.000).
    6. Waschen Sie die Membranen 5x für je 5 min mit TBS-T 0,1%.
    7. Weisen Sie die Proteine mit dem Chemilumineszenz-Detektionssystem nach. Bereiten Sie den Untergrund gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    8. Legen Sie den Blot in eine Plastiktüte und fügen Sie 200 μl chemilumineszierendes Substrat hinzu, um die Membran vollständig zu bedecken. Überschüssiges Substrat abtropfen lassen und alle Luftblasen entfernen.
    9. Belichten Sie jeden Blot für 30-60 s in einem leistungsstarken Bildgebungssystem, das mit Chemilumineszenz kompatibel ist.
    10. Entfernen Sie die Membranen (Schritte 10-13 des Western-Blot-Abschnitts), um die Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen zu unterbrechen und so die Nitrozellulosemembranen erneut zu blotten. Erholen Sie die Membranen und waschen Sie sie 3x für je 5 min mit TBS-T 1% bei 50 U/min.
    11. 7 min mit 10 ml 0,2 M NaOH bei 50 U/min inkubieren.
    12. 3x für je 5 min mit Leitungswasser bei 50 U/min waschen.
    13. 10 min mit TBS-T 1% bei 50 U/min waschen.
    14. Wiederholen Sie die Schritte 2-9 des Western-Blot-Abschnitts, um die Membran mit Anti-Beta-Tubulin (55 kDa) als Beladungskontrolle mit einer Verdünnung von 1:1.000 zu inkubieren.
    15. Führen Sie eine densitometrische Analyse25 für jedes Protein mit der ImageJ-Software (https://imagej.nih.gov/) durch.

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Ergebnisse

Die zunehmende Prävalenz von Adipositas und T2D hat in den letzten Jahren zu einer intensiven Suche nach den Mechanismen geführt, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können APCs in reife Adipozyten differenziert werden, um die Insulinresistenz und -sensitivität zu bewerten. Sobald die APCs die Konfluenz erreicht haben, dauert es 10 Tage, bis ihre Differenzierung in reife Adipozyten und ihre TNF-α-vermittelte Induktion der Insulinresistenz abgeschlossen sind (

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Diskussion

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Insulinresistenz vorgestellt, bei der primäre Adipozyten in Kulturen verwendet werden, die mit TNF-α behandelt wurden. Dieses Modell hat den Vorteil, dass primäre Adipozyten unter definierten Bedingungen über lange Zeiträume mit einer strengen Kontrolle zellulärer Umweltfaktoren kultiviert werden können26. Die Testdauer beträgt 15-20 Tage, obwohl es zwischen den Experimenten zu Abweichungen im Prozentsatz der differenzierten Adipozyten kommen...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla und María Antonieta Carbajo für ihre technische Unterstützung und Jessica Gonzalez Norris für die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Dieses Protokoll wurde vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), dem Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (an Y.M.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1. Isolierung von Maus-Adipozyten-VorläuferzellenACK-Lysingpuffer
 LONZA10-548E
Anti-Biotin Mikrokügelchen Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi
Basalmembranmatrix (Matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Wachstumsfaktor
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Monoklonaler Antikörper (30-F11) - BiotineBioscience13-0451-85
Kollagenase, Typ 1Worthington BiochemLS004197
DexamethasonSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM Low GlucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Wachstumsfaktor
FBSGIBCO26140-079
ITS-MixSigmaI3146
L-Ascorbinsäure 2-phosphatSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Wachstumsfaktor
Linolsäure-AlbuminSigmaL9530
MCDB 201 MediumSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Wachstumsfaktor
Penicilin-StreptomycinBioWestL0022-100
Vorabscheidefilter (70 & Mikro; m)Miltenyi130-095-823
Gereinigte Ratte Anti-Maus CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Trypsin-EDTA GIBCO25300062
2. Adipozytendifferenzierung und Induktion der Insulinresistenz
3-Isobutyl-1-methylxanthin [IBMX]SigmaI5879Differenzierungscocktail
BMP4R& D Systems5020-BP-010Differenzierungscocktail
DexamethasonSigmaD1756Differenzierungscocktail
InsulinSigmaI9278
RosiglitazonCayman71742Differenzierungscocktail
TNFαForschung & Forschung D Systems210-TA-005 
3. Bewertung des Insulin-Signalwegs mittels Western Blot
ProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Laemmli Puffer
Glycin SigmaG7126Lauf- und Transferpuffer
IgepalSigmaI3021RIPA Puffer
2- MercaptoethanolSigmaM3148Laemmli Puffer
MethanolJT Baker907007Transfer Puffer
NaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379RIPA Puffer
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762RIPA Puffer
Na3VO4SigmaS6508RIPA Puffer
Nitrozellulosemembran BioRad1620112
Fettfreie TrockenmilchBioRad1706404Blockierungslösung
Vorgefärbtes Protein StandardBioRad1610395
Proteasehemmer Cocktail SigmaP8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Phospho-Insulinrezeptor Β  Zellsignalisierung3024
Phospho-Akt (Ser473) AntikörperZellsignalisierung9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) AntikörperMillipore9432
Saccharose JT Baker407205RIPA-Puffer
SDSBioRad1610302Lauf- und Laemmli-Puffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-SubstratThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Lauf-, Transfer- und Laemmli-Puffer
Tris-HClJT Baker4103-02RIPA-Puffer - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T
Anti-Beta-Tubulin-Antikörper Abcam ab6046 Bromphenolblau BioRad 161-0404 Laemmli-Puffer EDTA Sigma E5134 RIPA-Puffer EGTA Sigma E4378 RIPA-Puffer FluorChem E-System

Referenzen

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
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