Summary
ここでは、感染の血液期における マラリア原虫 に対する細胞性免疫のメカニズムを解明するのに役立つ新しい方法について説明します。これは、細胞傷害性リンパ球による感染した赤血球の死滅を測定する in vitro アッセイです。
Abstract
マラリアは公衆衛生上の大きな懸念事項であり、世界中で年間2億件以上の症例が発生しています。長年の科学的努力にもかかわらず、マラリアに対する防御免疫は、主に長期マラリア原虫培養、特に三日熱マラリア原虫の方法論的限界のために、まだよく理解されていません。ほとんどの研究は、マラリアの制御に重要な役割を果たす抗体によるマラリアに対する適応免疫防御に焦点を当てています。しかし、弱毒化マラリア原虫スポロゾイトワクチンによって誘導される無菌防御は、主にCD8+やガンマデルタT細胞(γδT)などの細胞傷害性Tリンパ球に対する細胞応答に関連しています。したがって、細胞性免疫応答の機能をよりよく理解し、将来の治療法とワクチン開発をサポートするために、新しい方法論を開発する必要があります。マラリア原虫の血液期感染に対するこの細胞性免疫を解析する新しい戦略を見つけるために、私たちのグループは、細胞傷害性リンパ球による感染赤血球(iRBC)の死滅を測定するin vitroアッセイを確立しました。このアッセイは、血液期のさまざまなマラリア原虫属に対する細胞性免疫応答メカニズムの研究に使用できます。自然免疫細胞および適応性細胞傷害性免疫細胞は、エフェクター:標的機構においてi赤血球および細胞内寄生虫を直接排除することができる。標的iRBCを標識して細胞生存率を評価し、エフェクター細胞(CD8+ T、γδ T、NK細胞など)と共培養します。溶解率は、フローサイトメトリーベースのアッセイにおける自然溶解制御と比較して、試験条件に基づいて計算されます。最終的に、この殺傷アッセイ法は、血液ステージマラリアに対する細胞性免疫の理解における大きな進歩であり、新しい潜在的な治療標的の発見とマラリアワクチンの開発の加速に役立ちます。
Introduction
マラリアは依然として世界的な健康危機であり、2020年には2億4,000万人以上の症例と627,000人のマラリア関連の死亡が報告されています1。現在、ヒトにマラリアを引き起こす可能性のある5つの寄生種があり、そのうち熱帯熱マラリア原虫と三日熱マラリア原虫が2つの最も一般的な種です。 マラリア原虫感染中、肝臓または前赤血球期は無症候性であり、症状は赤血球期の寄生虫の無性周期中にのみ発生します。この感染段階では、肝臓段階に由来する何千ものメロゾイトが血流に放出され、赤血球(RBC)に感染します。RBCでは、寄生虫は統合失調症によって栄養生物と分裂虫に分化し、分裂病が赤血球を破裂させ、新たに形成されたメロゾイトを放出し、この血流を繰り返します。侵入、複製、メロゾイト放出のサイクルが繰り返されると、寄生虫集団が指数関数的に増加し、最終的に病気の症状を引き起こします2。
マラリアに対する免疫応答を研究する上で重要な課題は、マラリア原虫属です。 ヒトに感染することは実験動物モデルには感染しない。したがって、マラリア原虫に感染した患者のサンプルは新鮮に収集し、直ちに処理および分析する必要があります。しかし、マラリア流行地域では、免疫学的および分子的メカニズムにアクセスするためのリソースは限られています。これらの制限により、げっ歯類は、マラリア原虫感染に対する免疫応答を調査するための実験モデルとして広く使用されています。P. bergheiとP. chabaudiは熱帯熱マラリア原虫感染の代用としてよく使用されますが、P. yoelii 17XNLの非致死性株は、網状赤血球制限感染など、三日熱マラリア原虫と共通する多くの特徴も持っています3,4。ヒトまたは動物モデル由来のサンプルに使用できるマラリア原虫in vitroアッセイの開発は、マラリアの病因をよりよく理解し、異なる種の寄生虫によって誘発される免疫学的応答を比較する上で価値があります。
抗マラリア防御免疫は、前赤血球期でも血液期でも完全には理解されていません。反復感染への曝露は部分的な獲得免疫をもたらすことが知られていますが、無菌免疫はほとんど発達しません5。何十年もの間、抗マラリア原虫防御免疫は主に、宿主細胞への寄生虫侵入を防ぐ、または抗原提示細胞による食作用を引き起こす中和抗体またはオプソニン化抗体の誘導にそれぞれ関連していました6。その結果、これまでの抗マラリアワクチン製造のほとんどの努力は、防御的で長持ちする抗体の誘導に依存してきました7,8。しかし、弱毒化スポロゾイトによるワクチン接種によって誘導される無菌防御は、細胞傷害性Tリンパ球の活性化および増殖と直接相関する8,9。
最近、新たに単離された患者サンプルおよび in vitro 培養に関するいくつかの研究は、CD8+ T10、γδ T11、およびNK細胞12のような自然または適応性の細胞傷害性免疫細胞が、 マラリア原虫に感染したRBCおよびその細胞内寄生虫をエフェクター:ターゲット比で直接排除できることを実証した。これらの独創的な発見は、マラリアの文脈における全く新しい免疫エフェクターメカニズムを定義しました。この新しい抗マラリア免疫を解剖するためには、自然感染やワクチン接種における感染赤血球(iRBC)に対するキラー細胞の細胞傷害性エフェクター機構を探索することが不可欠です。
ここでは、血液ステージのマラリアに対するリンパ球の細胞傷害活性を測定する in vitro アッセイを紹介します。このアッセイは、 マラリア原虫 赤血球期に対する細胞性免疫応答のメカニズムを解明するのに役立ちます。標的細胞であるiRBCをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識して細胞生存率を評価した後、細胞傷害性リンパ球(CTL)などのエフェクター細胞と共培養します。次に、この共培養をフローサイトメトリーで評価し、特定の細胞タイプの蛍光マーカーを使用します。最後に、CTLによるiRBC溶解の割合は、実験条件をRBCの自然破裂と、エフェクター細胞なしのインキュベーション中に発生する自然溶解制御で割ることによって計算されます。全体として、この殺傷アッセイ法は、細胞媒介性マラリア免疫のより良い理解に貢献することができます。
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Protocol
すべての手続きは、オズワルドクルス財団と国家倫理評議会(CAAE:59902816.7.0000.5091)の方針に従って実施されました。ヒトプロトコルは、研究への患者の登録を担当したロンドニア熱帯医学研究センター(CEPEM)の臨床研究グループと共同で開発されました。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。
動物実験については、全国動物実験管理評議会(CONCEA)の科学的および教訓的な目的のための動物の世話と使用に関するブラジルの実践ガイドの行動原則に従って手順が実施されました。プロトコルは、フィオクルス動物実験評議会(CEUAプロトコルLW15 / 20-2)によって承認されました。
1.ヒト血液サンプルの収集とPBMC分離
- マラリア原虫感染患者の血液を、ヘパリンナトリウムを含む10mLの排気採血管で採取します。マラリア患者はリンパ球減少症を示すため、10 mLの血液サンプルには5〜9 x 106個の末梢血単核細胞(PBMC)の範囲があります。CD8+ T細胞またはγδ T細胞はPBMCの~10%を占めるため、50〜100 mLの血液/患者を採取することが望ましい。
注:最低1 x 105 エフェクターセル/状態を考慮する必要があります。 - 以下に説明するように、血液塗抹標本によるiRBCの割合を計算します。
- 透明なスライドに5 μLの総血液を加え、血液塗抹標本を準備します。ロマノフスキー型パノプティック高速染色またはメイ・ギュンヴァルト・ギムザ染色を行います。ここでは、試薬A(固定)、試薬B(細胞質染色)、試薬C(核および細胞質鑑別染色)の3つの試薬で構成されるパノプティック高速染色キットが使用されます。
- スライドを溶液Aに10倍、次に溶液Bに4倍、最後に溶液Cに10倍ゆっくりと浸します。溶液Cに浸した後、スライドを水道水で洗い流し、乾燥させます。
- 100倍の油浸対物レンズを備えた正立光学顕微鏡下で、連続した正方形で1000 RBCを数え、次の式を使用して寄生虫の割合を計算します。
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で15 mLの血液を1:1の割合で希釈します。
- 15 mLのリンパ球分離培地(密度1.077g/mL)を50 mLチューブに加えます。30 mLの希釈血液サンプルを遠心分離媒体溶液に注意深く重ねます。サンプルを重ねるときは、血液サンプルとリンパ球分離培地を混ぜないでください。
- チューブを400 x g で22°Cで40分間、低加速度でブレーク設定なしで遠心分離します。
- 滅菌ピペットを使用して血漿を含む上層を引き抜き、単核細胞層を乱さないようにします。滅菌ピペットを使用して単核細胞(PBMC)の層を滅菌チューブに移します。
- 血液ペレットが入っているチューブは、後で感染したRBCの分離に使用されるため、廃棄しないでください。このステップでは、必ずRBCを室温(RT)に保ってください。決して冷まさないでください。
- PBSを加えて細胞を2回洗浄し、350 x g で10分間遠心分離します。ペニシリン/ストレプトマイシンと10%ウシ胎児血清(FBS;完全培地)を添加した5 mLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁します。.
- トリパンブルー溶液の存在下でPBMCをカウントし、血球計算盤(ノイバウアーチャンバー)または自動セルカウンターを使用して細胞の生存率を確認します。青色に染色された細胞は、トリパンブルーを吸収する死にかけている細胞を表すため、数えないでください。
- 完全培地を使用して細胞濃度を107 細胞/mLに調整します。試薬メーカーのプロトコルに従って磁気ビーズ単離を使用して、目的の細胞傷害性リンパ球集団(CD8+ T細胞、NK細胞、γδT細胞)を精製します。
2. ヒト赤血球の分離
注:ヒトに感染した赤血球を分離するには、最低2%の寄生虫血症の血液サンプルから開始することをお勧めします。
- PERCOLL(以下、密度勾配分離媒体と称する)を、以下に述べる推奨濃度で調製する。
- 90 mLの100%密度勾配分離媒体と10 mLの10x PBSを加えて、90%等張密度勾配分離媒体を得ます。
- 三日熱マラリア原虫感染網状赤血球分離のために、45%密度勾配分離培地を準備します。50 mLの90%等張密度勾配分離媒体と50 mLの1x PBSを加えて、45%密度勾配分離媒体を得ます。
- 熱帯熱マラリア原虫感染赤血球分離のために、65%密度勾配分離培地を調製する。72 mLの90%等張密度勾配分離媒体と28 mLの1x PBSを加えて、65%密度勾配分離媒体を得ます。
- 非感染網状赤血球分離のために、70%密度勾配分離培地を調製する。78 mLの90%等張密度勾配分離媒体と22 mLの1x PBSを加えて、70%密度勾配分離媒体を得ます。
- 密度勾配分離媒体を水浴中で37°Cに温める。
- PBMC層を除去した後、細胞に触れずに遠心分離培地の最上層をできるだけ慎重に除去します。ガラスパスツールピペットを使用して、RBCペレットを乱さずに上部の好中球層を慎重に除去し、ペレット量を推定します。RT完全培地のRBCペレット容量の4倍を加え、再懸濁します。
- 2 本目の 50 mL コニカルチューブに、単離する細胞の種類に応じて、45%、65%、または 70% の密度勾配分離培地のペレット容量の 5 倍を追加します。RBC懸濁液を密度勾配分離媒体層の上に慎重に重ねます。
- 850 x gで15分間回転し、低加速度でブレーク設定はありません。上清と密度勾配分離媒体の間にある白濁した赤/茶色の層を5 mLピペットで回収します。滅菌した15 mLチューブに移します。
- 最大15 mLのRT完全培地を加えて細胞を洗浄し、860 x gで10分間スピンダウンします。10 mLのRT完全培地を加えて洗浄を繰り返し、スピンダウンします。上清を廃棄し、ペレットから血液塗抹標本を準備して、ステップ1.2に従ってiRBC濃縮を確認します。
- ペレットを1 mLのRT完全培地に再懸濁し、細胞をカウントしながら室温で静置します。血球計算盤(ノイバウアーチャンバー)に10 μLの細胞懸濁液を加え、25個の中正方形に細分された中央領域の赤血球をカウントします。RT完全培地中の細胞濃度を1 x 107 iRBC/mLに調整します。
3. マウスにおける実験的マラリア感染
- MR4/ATCCから得られたGFP発現株である凍結保存P. yoelii 17XNL:PyGFP(MRA-817)のアリコートを解凍し、8週齢の雌C57BL/6マウスに100 μLの腹腔内注射(i.p.)します。
- 尾静脈穿刺採血により3日ごとに寄生虫血症の負担に従ってください。
- 針を斜めにして血管を穿刺し、尾の遠位端から浅い角度で静脈に入ります。
- ピペットまたは毛細管で最大5または10 mLの血液サンプルを収集し、手動圧力を加えて出血を停止します。
- 寄生虫血症が感染した赤血球の10%〜15%に達するまで、血液塗抹標本を準備します(ステップ1.2で説明)。
- 尾静脈穿刺で10 μLの血液を採取し、100 μLのPBSに希釈して、2番目のドナーマウスにi.p.注射します。
注:凍結保存された寄生虫は、実験的感染に使用する前に、解凍してマウスに2回渡す必要があります。 - 2回目の継代が寄生虫血症の15%に達したら、テールクリッピング法で5滴の血液を採取し、1 mLのPBSで希釈します。滅菌PBS中で濃度を1 x 106 iRBC/mLに調整して感染溶液を調製し、実験に必要な各マウスに100 μL(1 x 105 iRBC)の溶液を注入します。
- 寄生虫血症は、感染後約12日で発生する~30%のiRBCに達するまで、2〜3日ごとに監視します。マウスが所望の寄生虫血症に達したら、以下に説明するように心臓穿刺によって血液を採取する。
- 100 μLのヘパリン溶液(30 U / mL)を26 Gの針で1 mLのシリンジに吸引します。
- 5%イソフルランを吸入してマウスに麻酔をかけ、反射がないことを確認する。マウスを横に置き、針を肘のすぐ下、肋骨を通して心臓に垂直に挿入します。シリンジプランジャーをゆっくりと引き出し、0.5〜1 mLの血液が得られるまで針を回転させます。
- 麻酔下で頸部脱臼による人道的安楽死を行う。マウスの左側を70%エタノールで無菌的に洗浄します。外科用ハサミで、皮膚と腹膜を通過するマウスの左側に切り込みを入れます。脾臓を見つけて取り除きます。
- マウスの脾臓を5 mLの完全培地を入れたシャーレに入れて、目的のエフェクター細胞集団(CD8+ T細胞など)を精製します。
4. 新鮮なマウス全脾細胞の取得
- ペトリ皿で、はさみまたはかみそりを使用して脾臓を慎重に小片に切ります。
- 100 μMのセルストレーナーを50 mLのコニカルチューブの上に置き、摘出した脾臓をピペットでセルストレーナーに移します。シリンジプランジャーでストレーナーを通して脾臓をマッシュアップします。
- ストレーナーを通して細胞を10 mLの完全培地で洗浄します。細胞を300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
- 細胞ペレットを2 mLの冷たい1x RBC溶解バッファーに再懸濁します。懸濁液を氷上で5分間インキュベートします。
- 細胞懸濁液を10 mLの4°C完全培地で洗浄します。洗浄ステップを3回繰り返し、 マラリア原虫に感染したマウスから脾臓の洗浄の間に細胞血栓を取り除きます。
- 細胞を400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
注: マラリア原虫に感染した脾臓は肥大し、分解されたヘモグロビンとヘモゾインを含む食細胞で満たされます。 - エフェクター細胞の磁気ビーズ単離中の問題を回避するには、次の手順を使用して、ヘモゾインに富む食細胞とヘモゾインを除去します。脾細胞をMACSバッファーで再懸濁し、濃度を1 x 108 細胞/mLに調整します。LSまたはLDカラムを磁場に配置します。3 mLのMACSバッファーですすいでカラムを調製します。
- 細胞懸濁液をカラムに塗布します。カラムを 3 mL の MACS バッファーで 3 回洗浄します。脾細胞を含むフロースルーを収集します。
- トリパンブルー溶液中の脾細胞をカウントし、血球計算盤(ノイバウアーチャンバー)または自動セルカウンターで細胞生存率を確認します。RT完全培地中の細胞濃度を1 x 107 細胞/mLに調整します。
5.細胞傷害性エフェクター細胞の精製(CD8a + T細胞ネガティブセレクション)
注:細胞傷害性エフェクター細胞(CD8+ T、γδ T、NK、iNKT、MAIT細胞)を精製できる多くのポジティブおよびネガティブ選択試薬があります。このプロトコルでは、脾臓CD8a + T細胞のネガティブセレクションを使用し、製造元の指示に従います。
- すべての脾細胞を400 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞ペレットを40 μLのMACSバッファーに再懸濁します。
- ビオチン抗体カクテル10 μLを加えます。よく混ぜて氷の上で5分間インキュベートします。
- 30 μL の MACS バッファーを追加します。20 μLの抗ビオチンマイクロビーズを追加します。よく混ぜて氷の上で10分間インキュベートします。
- 400 μLのMACSバッファーを添加し、磁気細胞分離に進みます。MACS LSカラムを磁場サポートに配置します。3 mLのMACSバッファーですすいでカラムを調製します。
- 細胞懸濁液をカラムに塗布します。カラムを 3 mL の MACS バッファーで 3 回洗浄します。濃縮されたCD8a+ T細胞であるすべての非標識細胞を含むフロースルーを収集します。
- トリパンブルー溶液中のCD8a+ T細胞をカウントし、血球計算盤(ノイバウアーチャンバー)または自動セルカウンターで細胞生存率を確認します。RT完全培地中の細胞濃度を1 x 107 細胞/mLに調整します。
6. P. yoelii感染 赤血球分離
- 採取した血液を1.5 mLチューブに入れて850 x g で3分間遠心分離します。血清を廃棄し、FBSを含まない1 mLの1 x RPMIに血液を再懸濁します。
- LSカラムを磁場サポートに入れ、3 mLの1x RPMIですすいでください。RBC 懸濁液をカラムに通します。より多くのiRBCを単離するには、フロースルー(3 mLのRPMIと1 mLの希釈血液)をカラムに再塗布します。
- 5 mLの1 x RPMIで2回洗浄します。カラムリザーバーが空になったらすぐにバッファーアリコートを添加して洗浄ステップを実行します。カラムを乾かさないでください。
- 5 mLのRPMIを添加し、カラムを取り外し、iRBCを新しい15 mLチューブにパージします。i赤血球を数え、濃度を1 x 107 RBC / mLに調整します。
7. 赤血球のCFSE標識とフローサイトメトリーの調製
注:CFSE標識ステップに続く洗浄ステップで細胞の~50%が失われるため、実験に使用する細胞の2倍の数でRBCラベリングプロトコルを開始します。赤血球/iRBCの自家蛍光を確立するには、非標識細胞の対照サンプルを含めます。
- CFSEをFBSを含まない1x RPMIで最終濃度10 mMに希釈します。15 mLチューブ内のFBSを含まない1x RPMIで細胞を1回洗浄します。
- 赤血球をFBSを含まない500 μLの1x RPMIに再懸濁し、500 μLの希釈CFSEを追加します。光から保護されたRTで8分間インキュベートします。
- 14 mLの完全培地(10%FBS RPMI)を加えて3回洗浄した後、850 x g で10分間遠心分離します。細胞を完全培地に1〜5 x 106 / mLの濃度に再懸濁します。RTで1時間インキュベートします。
8. 細胞傷害性リンパ球/赤血球共培養およびフローサイトメトリーの調製
注:特定の受容体または分子の関与を測定する場合は、共培養の前に、特異的ブロッキング抗体およびアイソタイプコントロール抗体(10 mg/mL)をエフェクター細胞と30分間インキュベートします。
- 細胞を96ウェル丸底プレートにプレートします。精製リンパ球およびCFSE標識iRBCを所望のエフェクター-標的細胞比で最終容量200 μLまで添加し、ホモジナイズします。各条件を三重に準備します。
注:iRBC濃度を1〜5 x 104 細胞/ mLに調整し、精製細胞数に基づいて比率を選択することをお勧めします(例:0.5:1、2.5:1、および5:1)。 - エフェクターを含まない標的iRBCである自然溶解制御を含めて、自発溶解を評価し、100%細胞生存率状態を表すために使用されます。
- プレートを360 x g で1分間スピンダウンして、細胞接触を最大化します。37°C、5%CO2で4時間インキュベートします。
注:熱帯熱マラリア原虫培養に体系的に使用される低酸素条件(低O2)は、エフェクター細胞がこの環境では生き残れないため、使用しないでください。対照的に、マラリア原虫は、5%CO2中の周囲空気中で最大12時間生存可能である。 - 850 x g で5分間回転させ、プレートを裏返して上清を除去します。
注:必要に応じて、上清を使用して、共培養で放出される可溶性因子を測定することができます。 - 抗マウスTer119 1:200(またはヒトサンプルの場合は抗ヒトCD235 1:100)で赤血球を標識し、抗CD8 1:200または抗CD3 1:200抗体(抗マウスまたはヒト)でCD8+ T細胞を3%FBS(FACSバッファー)を含む1x PBS中で4°Cで30分間標識します。
注:抗体蛍光色素は、細胞トレーサー/細胞増殖試薬(CFSE標識iRBC、APC-Cy7抗Ter119、PerCP-Cy5.5抗CD8aなど)に基づいて選択する必要があります。 - 細胞をFACSバッファーで洗浄し、850 x gで5分間スピンダウンします。 サンプルをFACSチューブに移し、30 μLの計数ビーズを個々のチューブに加えます 。 カウントビーズを30秒間ボルテックスして均質化します。
9. フローサイトメトリー
- 405/488/561/640レーザー機器を使用してサンプルを分析します。
- CFSE(FITC)、PE 抗ヒトγδ TCR、およびPE-Cy7抗ヒトCD235a抗体で標識したヒト細胞の場合は、3レーザー(青、赤、黄緑)構成のサイトメーターで530/30(FITC)、575/25(PE)、および780/60(PE-Cy7)フィルターを使用します。
- CFSE(FITC)、PerCP-Cy5.5抗マウスCD8a、およびAPC-Cy7抗マウスTer119で標識されたマウス細胞の場合は、3レーザーサイトメーターセットアップで530/30(FITC)、695/40(PerCP-Cy5.5)、および780/60(APC-Cy7)フィルターを使用します。
- 停止ゲートで最低 20,000 個のイベントを取得するには、停止ゲートとしてカウント ビーズの母集団を選択します。適切なフローサイトメトリー取得/解析ソフトウェアを使用して解析と補正を行います。
- 以下の説明に従ってゲーティング戦略を設定します。
- FSCピーク高さ(H)と面積(A)の比率を使用して破片を除外した単一セル(シングレット)を選択します。赤血球を選択し、赤血球マーカー(Ter119またはCD235a)およびリンパ球特異的抗体(CD8a)の蛍光に基づく分析からリンパ球を除外します。
- 前の赤血球ゲーティングでは、CFSE陽性染色に基づいて生存可能な赤血球を選択します。フローサイトメーターのデータ解析ソフトウェアでデータを解析します。
10.計算と統計
- iRBC溶解の割合を計算するには、ステップ9で説明したゲーティング戦略に従います。生存可能な赤血球の割合は、Ter119(マウス)またはCD235a(ヒト)陽性蛍光に基づく赤血球ゲート内のCFSE陽性細胞の頻度である。
- 自然溶解制御、エフェクター細胞を有さない赤血球、RBC自発破裂を推定する対照として条件を使用する。この状態はRBC溶解(100%生存率)と見なされます。次の式を使用して、テストされた各条件での赤血球溶解の割合を計算します。
注:培養インキュベーション中に、感染した赤血球の一部が寄生虫によって自発的に溶解または破裂する可能性があります。エフェクター細胞を含まない自然溶解状態のCFSE陽性RBC頻度を、リンパ球細胞毒性のベースラインとして使用します。 - 各条件の三重配置の平均を計算し、多重比較で二元配置分散分析を使用して統計的有意性を決定します。
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Representative Results
ここでは、細胞傷害性リンパ球との共培養アッセイにおけるCFSE標識 マラリア原虫感染RBCの単離に適用される方法論について説明します。まず、 三日熱マラリア原虫 に感染したヒトサンプルを使用して、プロトコルを実行する方法の概略図を提供します(図1)。次に、 P. yoelii に感染したC57BL/6マウスを用いたマラリア実験モデルにおけるプロトコールの進め方に関する図示フローチャートである(図2)。 図3では、プロトコルのステップ6(磁気カラムを用いた P. yoelii感染赤血球の濃縮)について期待される結果(前後)が示されています。最後に、 図4は代表的なフローサイトメトリー解析を示しており、ステップ9で説明したように、赤血球溶解の割合を評価するために必要なゲーティング戦略を詳述しています。したがって、このセクションでは、ここで使用されるさまざまな手法に焦点を当て、細胞傷害性リンパ球によるiRBC殺傷を評価するための取得、組み立て、およびデータ分析の全プロセスについて説明します。
細胞傷害性細胞によるヒト マラリア原虫感染赤血球溶解
細胞傷害性細胞によるヒトマラリア原虫感染RBCの死滅を評価するためのプロトコルの概略図を図1に示す。細胞溶解を測定するために、マラリア原虫感染患者からのPBMCを分離培地を使用して精製し、続いて目的の細胞傷害性リンパ球(CTL)集団(例えば、CD8+ T、γδT、NK、iNKT、MAIT細胞など)の磁気精製を行った。PBMC単離から残った赤血球ペレットは、密度勾配分離媒体(熱帯熱マラリア原虫65%、三日熱マラリア原虫45%)を用いてマラリア原虫感染赤血球を濃縮するために使用されました。iRBCをCFSEで標識し、リンパ球の有無にかかわらず、37°C、5%CO2で4時間インキュベートしました。共培養期間の後、フローサイトメトリー分析の前に、すべてのRBC(感染しているかどうかにかかわらず)を抗ヒトCD235a抗体(RBCの場合)およびCTL特異的抗体(例えば、抗CD8、抗γδTCRなど)で標識しました。ヒトサンプルの取得と分析は、図4でマウスサンプルで実証されたものと同様でした。
細胞傷害性CD8+ T細胞によるP.ヨエリ感染赤血球溶解
実験的マラリアモデルにおける細胞傷害性エフェクター機構を評価する実験手順のフローチャートを、図3および図4に示す代表的な実験データとともに図2に示す。C57BL/6マウスに1 x 105P. yoelii (Py) iRBCを感染させ、寄生虫血症を約30%に達するまでモニターした。Py-iRBCは、寄生虫ヘム副産物であるヘモゾインが鉄に富み、磁場中で常磁性粒子として機能するため、磁気分離を使用して血液から単離されました13。濃縮サンプルの純度を、プレカラムサンプルと比較して血液塗抹標本によって分析しました(図3)。次いで、iRBCを細胞トレーサー試薬CFSEで標識した。並行して、細胞傷害性CD8+ T細胞を磁気陰性選択キットを用いて脾細胞から精製した。対照として、非感染マウスからのCD8+ T細胞精製に同じプロトコルを使用した。エフェクター(CD8+ T)および標的(CFSE標識Py−iRBC)細胞を、異なるエフェクター:標的比(E:T:0.5:1、2.5:1、および5:1)で37°C5%CO2で4時間インキュベートした。共培養の終了時に、各条件を、RBCsに対する抗マウスTer119および細胞傷害性細胞に対する抗CD8aの抗体で標識した。ゲーティング戦略とサンプル結果を図4に示します。
図 1. インビトロ キリングアッセイの概略図。 殺傷アッセイ実験の例。 マラリア原虫に感染した血液を採取し、分離勾配培地を用いて処理する。遠心分離後、PBMC層を回収し、磁気ビーズを用いて細胞傷害性細胞(CTL)を精製した。RBC層は、密度勾配分離媒体を使用して再び処理されます。遠心分離後、 マラリア原虫-iRBC層を回収し、CFSEで標識する。その後、精製したCTLとiRBCを37°C、5%CO2で4時間共培養した後、細胞特異的標識をフローサイトメーターで解析した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.殺傷アッセイのための実験的マラリアモデル。 まず、C57BL/6マウスに10個の5 個のPyX17NL感染赤血球を感染させた。その後、寄生虫血症は、感染のピーク(30%〜40%iRBC)まで、感染後約12日(dpi)に血液塗抹標本によって監視されます。翌日、マウスを出血させ、脾臓採取のために安楽死させた。血液を処理し、感染した赤血球を磁気分離によって濃縮し、続いてCFSEで標識しました(右上)。脾臓を、磁気ビーズを用いたネガティブセレクションによって、細胞傷害性リンパ球単離のために処理した。その後、精製した細胞傷害性リンパ球とiRBCを37°C、5%CO2で4時間共培養した後、細胞特異的標識およびフローサイトメーターで分析した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.磁気カラムを用いたiRBC濃縮。 iRBCは、 LSカラムを使用してP.yoelii 感染マウスから精製されました。精製は、( A) カラム濃縮前および (B) 後に採取された血液からの血液塗抹標本によって強調されます。スケールバー = 10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.CD8+リンパ球によるP.ヨーエリ-iRBCの細胞溶解率の評価。細胞溶解率のゲーティング戦略。(A) カウント ビーズの母集団にストップ ゲートを設定します (~20,000 イベント)。 (B)自然溶解を制御する、リンパ球を含まないiRBC。FSCピーク高さ対面積比に基づいて破片を除く単一細胞を選択し、続いてAPC-Cy7 Ter119陽性およびPerCP-Cy5.5 CD8陰性の赤血球集団を選択することにより、ゲーティング戦略を開始します。次に、ライブiRBCをCFSE(FITC)高陽性として選択します。(C)異なるエフェクターを用いた実験分析の例:ターゲット比、共培養後の生赤血球の割合を表示する。(D)セクション10に記載される式に基づいて計算されたRBC溶解パーセンテージのグラフ表現。群間の有意比較(細胞傷害性CD8またはナイーブCD8)は、多重比較を伴う二元配置分散分析によって評価した。P < 0.0001 (****)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、細胞傷害性リンパ球によるマラリア原虫感染赤血球死を測定するためのin vitroアッセイについて説明します。このアッセイは、マラリア原虫の赤血球期に対する細胞防御免疫のメカニズムを解明するのに役立ちます。この方法論の主な利点は、免疫細胞がさまざまなマラリア原虫属菌とどのように相互作用するかに関する多くの質問に対処するために使用できる、iRBCの細胞媒介性死の定量的アッセイを提供することです。
重要なことに、この方法は、in vitro培養で維持されていない三日熱マラリア原虫および他のマラリア原虫の研究に使用できます14,15。さらに、このプロトコルは、ヒト、マウス、および非ヒト霊長類などの任意のマラリア原虫種および異なる宿主に適応させることができる。フローサイトメトリーベースの方法は、細胞傷害性細胞の活性化、サイトカイン産生、および脱顆粒を評価するために広く使用されています10、11、16、しかし、現在の方法は、キラー細胞との直接細胞接触による赤血球溶解を探索する唯一の方法です。
顕微鏡、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、フローサイトメトリーなど、寄生虫血症、浸潤、抗マラリア活性を測定することによってマラリアを研究するために使用される多くの方法もあります。しかしながら、赤血球の細胞媒介性細胞毒性を分析するために、Cr51またはヘモグロビン放出を使用する現在の方法は、赤血球溶解を評価するのに十分な感度ではない。LDH放出は、CD8+ T細胞のようないくつかのCTLによる赤血球殺傷を評価するためにも使用できますが、活性化された自然細胞または先天様細胞が調節メカニズムとして互いに殺し合う可能性があるため、LDHの測定は正確な方法ではありません。
CFSEは、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡で細胞を追跡したり、細胞増殖を調べたりするために広く使用されています17。赤血球は増殖しないため18、CFSE蛍光強度は細胞溶解とともに減少するはずです。フローサイトメトリーは、非常に低レベルの特異的マーカーを検出できるため、非常に正確な技術であり、マラリア感染における寄生虫血症および浸潤を追跡するために広く使用されています19,20,21,22,23。最も重要なことは、フローサイトメトリーは単一細胞内の多くのパラメーターを測定し、細胞を異なる集団に分類できることです。各サンプルに定量標準試薬(カウントビーズ)を添加することで、取得したイベントの数を正規化し、絶対細胞数24を得ることができます。この方法は、現在提案されているプロトコルにとって重要な実験条件間の信頼性の高い定量的比較を可能にします。
このプロトコルの重要なステップには、サンプル品質の確保、適切な細胞染色の確保、計算を正規化するためのコントロールの組み込みなどがあります。感染した赤血球を精製するには、大量の新鮮な血液サンプルが必要です。密度勾配分離培地の精製は、その濃度が目的の マラリア原虫 iRBCを得るために重要であるため、慎重にアプローチする必要があります。 密度勾配分離媒体への血液オーバーレイもできるだけゆっくりと行う必要があり、リング赤層採取はiRBCの損失を避けるために慎重に行う必要があります。精製プロセスを容易にするために、iRBCの量が多くなるため、寄生虫血症の高い血液サンプルを使用する必要があります。磁場を用いたRBC分離プロトコルでは、かなりの量のヘモゾインを産生する寄生虫成熟期(中期後期のトロホゾイトまたはシゾント)のみが精製されることに注意すべきである。その結果、リングステージは収集されず、最終結果に影響を与える可能性があります。
細胞染色は、細胞の損失や溶解を避けるために慎重に行う必要があります。染色する前に、長期間の保存または固定を避ける必要があります。実験条件は、シリアルエフェクター:ターゲット比と、ラベルのない自然溶解条件や仮説コントロールなどの適切なコントロールを使用して、3回に分けて実行する必要があることに注意することが重要です。細胞計数ビーズの添加は、各サンプルの細胞濃度または絶対細胞数を簡単に決定する方法を提供するため、非常に重要です。フローサイトメーターの取得中は、共培養後の各サンプルの細胞数を正規化するために、カウントビーズゲートで収集するイベント数を必ず設定してください。
共培養アッセイで一貫した結果を得るには少なくとも1 x 105 エフェクター細胞が必要であるため、記載された方法論の考えられる制限の1つは、精製後の細胞数が限られていることであり、これは特に希少細胞集団を扱う場合に懸念される可能性があります。実際、これはiRBC精製に当てはまり、特に風土病地域でヒトサンプルを扱う場合、それほど簡単には得られない非常に高い寄生虫血症を有する必要がある。
1つのプロトコール改善は、共培養インキュベーション時間であり得る。以前は12時間のインキュベーション時間10,11を使用していましたが、最近、実験条件を区別するには4時間で十分であり、潜在的な自然溶解の時間が短縮され、結果の再現性が向上することがわかりました。
マラリア原虫に感染した赤血球の直接殺傷に関与するメカニズムは徐々に明らかになりつつあります。私たちのグループは、CD8+ T細胞が感染細胞によるHLA-I提示を介して三日熱マラリア原虫に感染した網状赤血球を認識して殺すことができることを最初に示しました11。最近、別の研究では、γδ T細胞がiRBCの表面に存在する分子であるブチロフィリンによるリン酸抗原認識を介して熱帯熱マラリア原虫に感染したRBCを認識することが実証されました10。両方の研究において、赤血球溶解は顆粒化およびグランザイムB依存性であり、細胞内寄生虫死滅をもたらす。
寄生虫血症、浸潤、抗マラリア活性、および画像細胞相互作用を測定するために長年にわたって多くの方法が開発されてきましたが、定量的フローサイトメトリーベースのアッセイで細胞傷害性細胞によるi赤血球の直接死滅を分析できるものはありませんでした19、20、21。マラリア原虫感染赤血球のCFSE標識によるマラリアの細胞溶解能力の評価と、リンパ球との共培養の特定の期間におけるiRBC溶解の評価に革新的なアプローチを使用しました。したがって、このin vitro殺傷アッセイは、血液期のマラリアに対する細胞性免疫のメカニズムを明らかにするための新しい戦略を提示し、新しい治療標的の研究とマラリアワクチンの開発を進めるのに役立ちます。
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Disclosures
著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
Dhelio Pereira博士とロンドニア熱帯医学研究センター(CEPEM)のマラリア患者の登録と採血、および原稿の改訂を支援してくれたFelicia Hoに感謝します。以下の試薬は、BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL:PyGFP, MRA- 817, Ana Rodriguezによって提供された。この研究は、Lemann Brazil Research Fund、Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4、フェローシップ(CJ、GC、CG)、およびFundação de Amparo do Estado de Minas Gerais(FAPEMIG)-APQ-00653-16、APQ-02962-18の支援を受けました。Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Fellowship (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
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