Summary
Burada, enfeksiyonun kan aşamasında Plasmodium'a hücresel bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olacak yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu, sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçen in vitro bir testtir.
Abstract
Sıtma, dünya çapında yılda 200 milyondan fazla vaka sunan önemli bir halk sağlığı sorunudur. Yıllarca süren bilimsel çabalara rağmen, sıtmaya karşı koruyucu bağışıklık, özellikle Plasmodium vivax için uzun süreli Plasmodium kültürünün metodolojik sınırlamaları nedeniyle hala tam olarak anlaşılamamıştır. Çoğu çalışma, sıtmanın kontrolünde önemli bir rol oynayan antikorlar tarafından sıtmaya karşı adaptif bağışıklık korumasına odaklanmıştır. Bununla birlikte, zayıflatılmış Plasmodium sporozoitler aşıları tarafından indüklenen steril koruma, hücresel yanıtla, özellikle CD8 + ve gama delta T hücreleri (γδ T) gibi sitotoksik T lenfositlerle ilişkilidir. Bu nedenle, hücresel immün yanıtın işlevlerini daha iyi kavramak ve böylece gelecekteki tedaviyi ve aşı gelişimini desteklemek için yeni metodolojiler geliştirilmelidir. Plasmodium kan evresi enfeksiyonuna karşı bu hücre aracılı bağışıklığı analiz etmek için yeni bir strateji bulmak için, grubumuz sitotoksik lenfositler tarafından enfekte kırmızı kan hücresi (iRBC) öldürmeyi ölçen bir in vitro tahlil kurdu. Bu tahlil, kan aşamasında farklı Plasmodium spp.'ye karşı hücresel bağışıklık tepkisi mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. Doğuştan gelen ve adaptatif sitotoksik bağışıklık hücreleri, bir efektör: hedef mekanizmadaki iRBC'leri ve hücre içi paraziti doğrudan ortadan kaldırabilir. Hedef iRBC'ler hücre canlılığını değerlendirmek için etiketlenir ve efektör hücrelerle (CD8 + T, γδ T, NK hücreleri, vb.) birlikte kültürlenir. Lizis yüzdesi, akış sitometrisine dayalı bir tahlildeki spontan lizis kontrolüne kıyasla, test edilmiş koşullara dayanarak hesaplanır. Nihayetinde, bu öldürme testi metodolojisi, kan evresi sıtmasına karşı hücre aracılı bağışıklığı anlamada, yeni potansiyel terapötik hedeflerin ortaya çıkarılmasına ve sıtma aşılarının geliştirilmesinin hızlandırılmasına yardımcı olan büyük bir ilerlemedir.
Introduction
Sıtma, 2020 yılında bildirilen 240 milyondan fazla vaka ve 627.000 sıtmaya bağlı ölümle küresel bir sağlık krizi olmaya devam etmektedir1. Şu anda insanlarda sıtmaya neden olabilecek beş paraziter tür vardır, bunlardan Plasmodium falciparum ve Plasmodium vivax en yaygın iki türdür. Plasmodium enfeksiyonu sırasında, karaciğer veya eritrositik öncesi evre asemptomatiktir ve semptomlar sadece parazitin eritrositik evredeki aseksüel döngüsü sırasında ortaya çıkar. Bu enfeksiyon aşamasında, karaciğer aşamasından türetilen binlerce merozoit kan dolaşımına salınır ve kırmızı kan hücrelerini (RBC'ler) enfekte eder. RBC'de, parazitler şizogoni ile trofozoitlere ve şizontlara farklılaşır, ta ki şizontlar eritrositi parçalayana kadar, yeni oluşan merozoitleri serbest bırakarak bu kan döngüsünü tekrarlayana kadar. Tekrarlanan invazyon, replikasyon ve merozoit salınımı döngüleri, parazit popülasyonunun üstel büyümesine neden olur ve sonuçta hastalık semptomlarını tetikler2.
Sıtmaya karşı bağışıklık tepkisini incelemede önemli bir zorluk, Plasmodium spp. insanlara bulaşan laboratuvar hayvanı modellerine bulaşmaz. Bu nedenle, Plazmodyum ile enfekte olmuş hasta örnekleri taze toplanmalı ve derhal işlenmeli ve analiz edilmelidir. Bununla birlikte, sıtma endemik bölgelerinde, immünolojik ve moleküler mekanizmalara erişim kaynakları sınırlıdır. Bu sınırlamalar nedeniyle, kemirgenler Plasmodium enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için deneysel modeller olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. P. berghei ve P. chabaudi sıklıkla P. falciparum enfeksiyonu için vekil olarak kullanılırken, P. yoelii 17XNL'nin ölümcül olmayan suşu da retikülosit kısıtlı enfeksiyon 3,4 gibi P. vivax ile ortak birçok özelliğe sahiptir. İnsan veya hayvan modelinden türetilmiş örnekler için kullanılabilecek Plasmodium in vitro tahlillerinin geliştirilmesi, sıtmanın patogenezinin daha iyi anlaşılması ve parazitin farklı türlerinin ortaya çıkardığı immünolojik yanıtın karşılaştırılması açısından değerlidir.
Koruyucu antimalaryal bağışıklık, ne eritrositik öncesi aşamada ne de kan aşamasında tam olarak anlaşılamamıştır. Tekrarlayan enfeksiyonlara maruz kalmanın kısmi kazanılmış bağışıklık ile sonuçlandığı bilinmektedir, ancak steril bağışıklık nadiren gelişmektedir5. On yıllar boyunca, anti-Plasmodium koruyucu bağışıklık esas olarak, konakçı hücrelerin parazit invazyonunu önleyen veya antijen sunan hücreler tarafından fagositoza yol açan nötralize edici veya opsonize edici antikorların indüksiyonu ile ilişkiliydi,sırasıyla 6. Sonuç olarak, şimdiye kadar sıtma karşıtı aşılar üretme çabalarının çoğu, koruyucu ve uzun ömürlü antikorların indüklenmesine dayanmıştır 7,8. Bununla birlikte, zayıflatılmış bir sporozoit ile aşılama ile indüklenen steril koruma, sitotoksik T lenfositlerin aktivasyonu ve genişlemesi ile doğrudan ilişkilidir 8,9.
Son zamanlarda, yeni izole edilmiş hasta örnekleri ve in vitro kültürler üzerinde yapılan bazı çalışmalar, CD8 + T 10, γδ T11 ve NK hücreleri12 gibi doğuştan gelen veya adaptatif sitotoksik bağışıklık hücrelerinin, Plasmodium ile enfekte olmuş RBC'leri ve hücre içi parazitini efektör: hedef oranlı bir şekilde doğrudan ortadan kaldırabileceğini göstermiştir. Bu seminal bulgular, sıtma bağlamında tamamen yeni bir immün efektör mekanizmayı tanımlamıştır. Bu yeni antimalaryal bağışıklığı incelemek için, doğal enfeksiyon veya aşılamada enfekte olmuş RBC'lere (iRBC'ler) karşı öldürücü hücrelerin sitotoksik efektör mekanizmalarını araştırmak önemlidir.
Burada, lenfositlerin kan aşamasında sıtmaya karşı sitotoksik aktivitesini ölçen bir in vitro tahlil sunuyoruz. Bu tahlil daha sonra Plasmodium eritrosit aşamasına karşı hücresel bağışıklık tepkisinin mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Hedef hücreler, iRBC'ler, hücre canlılığını değerlendirmek için karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) ile etiketlenir ve daha sonra sitotoksik lenfositler (CTL) gibi efektör hücrelerle birlikte kültürlenir. Bu kokültür daha sonra spesifik hücre tipleri için floresan belirteçler kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirilir. Son olarak, CTL ile iRBC lizis yüzdesi, deneysel durumun RBC'lerin spontan rüptürü ve efektör hücre olmadan inkübasyon sırasında meydana gelen spontan lizis kontrolü ile bölünmesiyle hesaplanır. Genel olarak, bu öldürme testi metodolojisi, hücre aracılı sıtma bağışıklığının daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Oswaldo Cruz Vakfı ve Ulusal Etik Konseyi (CAAE: 59902816.7.0000.5091) politikalarına uygun olarak yürütülmüştür. İnsan protokolleri, hastaları çalışmaya kaydetmekten sorumlu olan Rondônia Tropikal Tıp Araştırma Merkezi'nden (CEPEM) klinik araştırma grubu ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Tüm hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
Hayvan çalışması için, Ulusal Hayvan Deneylerinin Kontrolü Konseyi'nin (CONCEA) Bilimsel ve Didaktik Amaçlar için Hayvanların Bakımı ve Kullanımı için Brezilya Uygulama Kılavuzu'nun davranış ilkelerine uygun olarak prosedürler uygulanmıştır. Protokoller Fiocruz Hayvan Deneyleri Konseyi (CEUA protokolü LW15/20-2) tarafından onaylandı.
1. İnsan kan örneklerinin toplanması ve PBMC izolasyonu
- Sodyum heparin ile 10 mL tahliye edilmiş kan toplama tüpünde Plasmodium ile enfekte olmuş hastaların kanını toplayın. Sıtma hastalarında lenfopeni görüntülendiğinden, 10 mL'lik bir kan örneğinde 5-9 x 106 periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) aralığı vardır. CD8 + T hücreleri veya γδ T hücreleri PBMC'lerin ~% 10'unu oluşturduğundan, tercihen 50-100 mL kan / hasta toplar.
NOT: En az 1 x 105 efektör hücresi/durumu göz önünde bulundurulmalıdır. - İRBC'lerin yüzdesini aşağıda açıklandığı gibi kan yayması ile hesaplayın.
- Berrak bir slayda 5 μL toplam kan ekleyin ve bir kan yayması hazırlayın. Romanowsky tipi panoptik hızlı leke veya May-Günwald-Giemsa boyası uygulayın. Burada, üç reaktiften oluşan panoptik hızlı leke kiti kullanılır: reaktif A (fiksasyon), reaktif B (sitoplazmik boya) ve reaktif C (nükleer ve sitoplazmik diferansiyel boya).
- Slaytı yavaşça A çözeltisine 10x, daha sonra B çözeltisine 4x ve son olarak C çözeltisine 10x daldırın. C çözeltisine daldırdıktan sonra, sürgüyü akan musluk suyunda durulayın ve kurumasını bekleyin.
- 100x yağ daldırma hedefine sahip dik bir ışık mikroskobu altında, sıralı karelerde 1000 RBC sayın ve aşağıdaki denklemi kullanarak parazitemi yüzdesini hesaplayın:
- 15 mL kanı steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1:1 oranında seyreltin.
- 50 mL'lik bir tüpe 15 mL lenfosit ayırma ortamı (yoğunluğu 1.077g / mL) ekleyin. 30 mL seyreltilmiş kan örneğini santrifüjleme ortamı çözeltisi üzerine dikkatlice katmanlayın. Numuneyi katmanlarken, kan örneğinin ve lenfosit ayırma ortamının karışmasına izin vermeyin.
- Tüpleri 400 x g'de 22 °C'de 40 dakika boyunca, düşük ivmelenme ve kırılma ayarı olmadan santrifüj edin.
- Steril bir pipet kullanarak plazma içeren üst tabakayı çekin ve mononükleer hücre tabakasını rahatsız etmeden bırakın. Mononükleer hücre katmanını (PBMC'ler) steril bir pipet kullanarak steril bir tüpe aktarın.
- Kan peletini içeren tüpü atmayın, çünkü daha sonra enfekte RBC izolasyonu için kullanılacaktır. Bu adımdan itibaren, RBC'leri oda sıcaklığında (RT) tuttuğunuzdan emin olun. Asla soğumalarına izin vermeyin.
- PBS ekleyerek hücreleri iki kez yıkayın ve mola ayarı ile 10 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın. Hücre peletini penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS; tam ortam) ile desteklenmiş 5 mL RPMI ortamında yeniden askıya alın.
- Bir hemasitometre (Neubauer odası) veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını kontrol etmek için PBMC'leri tripan mavisi çözeltisinin varlığında sayın. Mavi lekeli hücreleri saymayın, çünkü bunlar tripan mavisini emen ölmekte olan hücreleri temsil eder.
- Tam ortam kullanarak hücre konsantrasyonunu 107 hücre / mL'ye ayarlayın. Reaktif üreticisi protokolüne göre manyetik boncuk izolasyonu kullanarak istenen sitotoksik lenfosit popülasyonlarını (CD8 + T hücreleri, NK hücreleri, γδ T hücreleri) saflaştırın.
2. İnsan RBC izolasyonu
NOT: İnsan ile enfekte RBC izolasyonu için, tercihen trofozoit / erken schizont parazit aşamasında daha fazla olmak üzere en az% 2 parazitemiye sahip kan örnekleri ile başlanması önerilir.
- PERCOLL'u (bundan böyle yoğunluk gradyanı ayırma ortamı olarak anılacaktır) aşağıda açıklandığı gibi önerilen konsantrasyonda hazırlayın.
- %90 izotonik yoğunluklu gradyan ayırma ortamı elde etmek için 90 mL %100 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı ve 10 mL 10x PBS ekleyin.
- P. vivax ile enfekte retikülosit separasyonu için,%45 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı hazırlayın. %45 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı elde etmek için 50 mL% 90 izotonik yoğunluklu gradyan ayırma ortamı ve 50 mL 1x PBS ekleyin.
- P. falciparum ile enfekte olmuş eritrosit separasyonu için,% 65 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı hazırlayın. %65 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı elde etmek için 72 mL% 90 izotonik yoğunluklu gradyan ayırma ortamı ve 28 mL 1x PBS ekleyin.
- Enfekte olmamış retikülosit separasyonu için,% 70 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı hazırlayın. %70 yoğunluklu gradyan ayırma ortamı elde etmek için 78 mL% 90 izotonik yoğunluklu gradyan ayırma ortamı ve 22 mL 1x PBS ekleyin.
- Yoğunluk gradyanı ayırma ortamını bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
- PBMC tabakasının çıkarılmasından sonra, hücrelere dokunmadan santrifüjleme ortamının üst tabakasının mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Cam Pasteur pipet ile RBC peletini rahatsız etmeden üst nötrofil tabakasını dikkatlice çıkarın ve pelet hacmini tahmin edin. RT komple ortamın RBC pelet hacminin 4 katını ekleyin ve yeniden askıya alın.
- İkinci bir 50 mL konik tüpte, izole edilecek hücre tipine bağlı olarak% 45,% 65 veya% 70 yoğunluklu gradyan ayırma ortamının pelet hacminin 5 katını ekleyin. RBC süspansiyonunu yoğunluk gradyanı ayırma ortamı katmanının üzerine dikkatlice yerleştirin.
- 850 x g'de 15 dakika boyunca düşük ivmelenme ve mola ayarı olmadan döndürün. Süpernatant ve yoğunluk gradyanı ayırma ortamı arasında kalan bulutlu kırmızı/kahverengi tabakayı 5 mL'lik bir pipetle toplayın. Steril bir 15 mL tüpe aktarın.
- 15 mL'ye kadar RT komple ortam ekleyerek hücreleri yıkayın ve 860 x g'de 10 dakika aşağı döndürün. 10 mL RT komple ortam ekleyerek yıkamayı tekrarlayın ve aşağı doğru döndürün. Süpernatantı atın ve 1.2. adımı izleyerek iRBC zenginleştirmesini kontrol etmek için peletten bir kan yayması hazırlayın.
- Peletleri 1 mL RT tam ortamda tekrar askıya alın ve hücreleri sayarken oda sıcaklığında bekletin. Bir hemositometreye (Neubauer odası) 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve merkezi alandaki RBC'leri 25 orta kareye bölünerek sayın. RT komple ortamda hücre konsantrasyonunu 1 x 107 iRBC/mL'ye ayarlayın.
3. Farede deneysel sıtma enfeksiyonu
- MR4/ATCC'den elde edilen GFP eksprese edici bir suş olan kriyokorunmuş P. yoelii 17XNL:PyGFP (MRA-817)'nin bir alikotunu çözün ve 8 haftalık dişi C57BL/6 fareye intraperitoneal olarak (yani 100 μL) enjekte edin.
- Parazitemi yükünü her 3 günde bir kuyruk damarı mızraklayarak kan toplama ile takip edin.
- İğne eğimli olarak damarı delin, damara kuyruğun distal ucundan başlayarak sığ bir açıyla girin.
- Kan örneğini 5 veya 10 mL'ye kadar bir pipet veya kılcal tüp ile toplayın, ardından kanamayı durdurmak için manuel basınç uygulayın.
- Parazitemi enfekte RBC'lerin% 10-15'ine ulaşana kadar bir kan yayması (adım 1.2'de açıklandığı gibi) hazırlayın.
- Kuyruk damarı mızrağı ile 10 μL kan toplayın ve ikinci donör fareye enjekte etmek için 100 μL PBS'ye seyreltin.
NOT: Kriyokorunmuş parazitler, deneysel enfeksiyonlar için kullanılmadan önce farelerde iki kez çözülmeli ve geçirilmelidir. - İkinci pasaj parazitemin% 15'ine ulaştığında, kuyruk kırpma yöntemiyle beş damla kan toplayın ve 1 mL PBS ile seyreltin. Steril PBS'de konsantrasyonu 1 x 106 iRBC/mL'ye ayarlayarak bir enfeksiyon çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin i.p. 100 μL'sini (1 x 105 iRBC) deney için gereken her fareye enjekte edin.
- Parazitemiyi, enfeksiyondan yaklaşık 12 gün sonra ortaya çıkan ~% 30 iRBC'lere ulaşana kadar her 2-3 günde bir izleyin. Fareler istenen parazitemiye ulaştığında, aşağıda tarif edildiği gibi kardiyak ponksiyonla kan toplayın.
- 100 μL heparin çözeltisini (30 U/mL) 26 G iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya aspire edin.
- Fareyi% 5 izofluran ile soluyarak uyuşturun ve reflekslerin yokluğunu onaylayın. Fareyi yan tarafına yerleştirin ve iğneyi dirseğin hemen altına, kaburgaların içinden ve kalbe dik olarak yerleştirin. Şırınga pistonunu yavaşça dışarı çekin ve iğneyi 0.5-1 mL kan elde edilene kadar döndürün.
- Anestezi altında servikal çıkık ile insancıl ötenazi uygulayın. Farenin sol tarafını %70 etanol ile aseptik olarak temizleyin. Cerrahi makas ile, farenin sol tarafında deriden ve peritondan geçen bir kesim yapın. Dalağı bulun ve çıkarın.
- İstenilen efektör hücre popülasyonunu (örneğin, CD8 + T hücreleri) saflaştırmak için fare dalağını 5 mL tam ortama sahip bir Petri kabına yerleştirin.
4. Taze bütün fare splenositlerinin elde edilmesi
- Petri kabında, dalağı makas veya tıraş bıçağı kullanarak dikkatlice küçük parçalara ayırın.
- 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 100 μM'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve eksize edilen dalağı bir pipetle hücre süzgecine aktarın. Dalağı süzgeçten bir şırınga pistonuyla ezin.
- Hücreleri süzgeçten 10 mL tam ortam ile yıkayın. Hücreleri 300 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, ardından süpernatanı atın.
- Hücre peletini 2 mL soğuk 1x RBC lizis tamponunda tekrar askıya alın. Süspansiyonu buz üzerinde 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücre süspansiyonunu 10 mL 4 °C komple ortam ile yıkayın. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın ve Plasmodium ile enfekte olmuş farelerden gelen dalaklar için yıkamalar arasındaki hücre pıhtılarını çıkarın.
- Hücreleri 400 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, ardından süpernatanı atın.
NOT: Plazmodyum ile enfekte olmuş dalaklar büyütülür ve bozulmuş hemoglobin ve hemozoin içeren fagositik hücrelerle doldurulur. - Efektör hücrelerin manyetik boncuk izolasyonu sırasında herhangi bir sorunu önlemek için, hemozoin ile zenginleştirilmiş fagositik hücreleri ve hemozoini çıkarmak için aşağıdaki adımları kullanın. Dalak hücrelerini MACS tamponu ile yeniden askıya alın ve konsantrasyonu 1 x 108 hücre / mL'ye ayarlayın. Manyetik alana bir LS veya LD sütunu yerleştirin. Kolonu 3 mL MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın.
- Sütuna hücre süspansiyonu uygulayın. Kolonu 3 mL MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Dalak hücrelerini içeren akış boyunca toplayın.
- Bir tripan mavisi çözeltisindeki splenositleri sayın ve bir hemasitometrede (Neubauer odası) veya otomatik hücre sayacında hücre canlılığını kontrol edin. RT komple ortamda hücre konsantrasyonunu 1 x 107 hücre/mL'ye ayarlayın.
5. Sitotoksik efektör hücre saflaştırma (CD8a + T hücre negatif seçimi)
NOT: Sitotoksik efektör hücreleri (CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, MAIT hücreleri) saflaştırabilen birçok pozitif ve negatif seleksiyon reaktifi vardır. Bu protokolde, dalak CD8a + T hücrelerinin negatif bir seçimini kullanıyoruz ve üretici talimatlarını takip ediyoruz.
- Tüm splenositleri 400 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 40 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın.
- 10 μL biyotin-antikor kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
- 30 μL MACS arabelleği ekleyin. 20 μL anti-biyotin mikro boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
- 400 μL MACS tamponu ekleyin ve manyetik hücre ayrımına devam edin. MACS LS sütununu manyetik alan desteğine yerleştirin. Kolonu 3 mL MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın.
- Sütuna hücre süspansiyonu uygulayın. Kolonu 3 mL MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Zenginleştirilmiş CD8a + T hücreleri olan tüm etiketlenmemiş hücreleri içeren akışı toplayın.
- CD8a + T hücrelerini tripan mavisi bir çözeltide sayın ve bir hemasitometrede (Neubauer odası) veya otomatik hücre sayacında hücre canlılığını kontrol edin. RT komple ortamında hücre konsantrasyonunu 1 x 107 hücre/mL olarak ayarlayın.
6. P. yoelii ile enfekte RBC izolasyonu
- Toplanan kanı 1.5 mL'lik bir tüpte 850 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin. Serumu atın ve kanı FBS olmadan 1 mL 1x RPMI'de yeniden askıya alın.
- LS sütununu manyetik alan desteğine yerleştirin ve 3 mL 1x RPMI ile durulayın. RBC süspansiyonunu sütundan geçirin. Daha fazla iRBC'yi izole etmek için, akışı (3 mL RPMI ve 1 mL seyreltilmiş kan) sütuna yeniden uygulayın.
- 5 mL 1x RPMI ile iki kez yıkayın. Kolon haznesi boşalır boşalmaz tampon alikotları ekleyerek yıkama adımlarını gerçekleştirin. Herhangi bir sütunun kurumasına izin vermeyin.
- 5 mL RPMI ekleyin, sütunu çıkarın ve iRBC'leri yeni bir 15 mL tüpe boşaltın. iRBC'leri sayın ve konsantrasyonu 1 x 107 RBC / mL olarak ayarlayın.
7. RBC'lerin CFSE etiketlemesi ve akış sitometrisi için hazırlık
NOT: RBC etiketleme protokolünü, CFSE etiketleme adımını izleyen yıkama adımlarında hücrelerin ~%50'si tipik olarak kaybolduğundan, deney için kullanılacak hücre sayısının iki katı ile başlatın. RBC'lerin/iRBC'lerin otofloresansını belirlemek için, etiketlenmemiş hücrelerin bir kontrol örneğini ekleyin.
- CFSE'yi FBS olmadan 1x RPMI'da 10 mM'lik son konsantrasyona seyreltin. Hücreleri bir kez FBS'siz 1x RPMI ile 15 mL'lik bir tüpte yıkayın.
- RBC'leri FBS olmadan 500 μL 1x RPMI'de yeniden askıya alın ve seyreltilmiş CFSE'den 500 μL ekleyin. RT'de ışıktan korunan 8 dakika boyunca inkübe edin.
- 14 mL tam ortam (% 10 FBS RPMI) ekleyerek üç kez yıkayın, ardından 10 dakika boyunca 850 x g'de santrifüjleme yapın. Hücreleri tam ortamda 1-5 x 106 / mL'lik bir konsantrasyona kadar tekrar askıya alın. RT'de 1 saat inkübe edin.
8. Sitotoksik lenfosit/RBC kokültürü ve akım sitometrisi için hazırlık
NOT: Spesifik reseptörlerin veya moleküllerin katılımı ölçülecekse, kokültürden önce 30 dakika boyunca efektör hücrelerle spesifik blokaj ve izotip kontrol antikorlarını (10 mg / mL) inkübe edin.
- Hücreleri 96 delikli yuvarlak tabanlı bir plakada plakalayın. Saflaştırılmış lenfositleri ve CFSE etiketli iRBC'leri istenen efektör-hedef hücre oranında 200 μL'lik son bir hacme ekleyin ve homojenize edin. Her koşulu üçlü olarak hazırlayın.
NOT: iRBC konsantrasyonunu 1-5 x 104 hücre/mL olarak ayarlamanızı ve saflaştırılmış hücre sayısına göre oranı seçmenizi öneririz (örneğin, 0.5: 1, 2.5: 1 ve 5: 1). - Herhangi bir spontan lizisi değerlendirmek için efektörsüz hedef iRBC'ler olan spontan lizis kontrolünü dahil edin, çünkü bu% 100 hücre canlılığı durumunu temsil etmek için kullanılacaktır.
- Hücre temasını en üst düzeye çıkarmak için plakayı 360 x g'de 1 dakika aşağı çevirin. 4 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
NOT: P. falciparum kültürü için sistematik olarak kullanılan hipoksi koşulları (düşükO2), efektör hücreler bu ortamda hayatta kalamayacağından kullanılmamalıdır. Buna karşılık, Plasmodium parazitleri ortam havasında% 5 CO2'de 12 saate kadar yaşayabilir. - 850 x g'de 5 dakika döndürün ve süpernatanı çıkarmak için plakayı çevirin.
NOT: İstenirse, süpernatant kokültürde salınan çözünür faktörleri ölçmek için kullanılabilir. - RBC'leri fare karşıtı Ter119 1:200 (veya insan örnekleri için insan karşıtı CD235 1:100) ve CD8+ T hücreleri ile anti-CD8 1:200 veya anti-CD3 1:200 antikorları (fare veya insan) ile %3 FBS (FACS tamponu) içeren 1x PBS'de 4 °C'de 30 dakika boyunca etiketleyin.
NOT: Antikor floroforu, hücre izleyici/hücre proliferasyon reaktifine (örneğin, CFSE etiketli iRBC, APC-Cy7 anti-Ter119 ve PerCP-Cy5.5 anti-CD8a) göre seçilmelidir. - Hücreleri FACS tamponu ile yıkayın ve 850 x g'de 5 dakika boyunca aşağı doğru döndürün. Numuneleri FACS tüplerine aktarın ve tek tek tüplere 30 μL sayma boncuğu ekleyin. Sayım boncuklarını 30 sn boyunca vorteks yaparak homojenize edin.
9. Akış sitometrisi
- 405/488/561/640 lazer cihazı kullanarak numuneleri analiz edin.
- CFSE (FITC), PE insan karşıtı γδ TCR ve PE-Cy7 anti-insan CD235a antikoru ile etiketlenmiş insan hücreleri için, üç lazerli (Mavi, Kırmızı, Sarı-Yeşil) konfigürasyonlu bir sitometrede 530/30 (FITC), 575/25 (PE) ve 780/60 (PE-Cy7) filtreleri kullanın.
- CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 fare karşıtı CD8a ve APC-Cy7 fare karşıtı Ter119 ile etiketlenmiş fare hücreleri için, üç lazer sitometre kurulumunda 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) ve 780/60 (APC-Cy7) filtreleri kullanın.
- Durdurma kapısında tüm koşullar için aynı olması gereken en az 20.000 olay elde etmek için durma kapısı olarak sayma boncuk popülasyonunu seçin. Uygun akış sitometrisi edinimi/analiz yazılımını kullanarak analiz ve kompanzasyon gerçekleştirin.
- Geçit stratejisini aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
- FSC tepe yüksekliği (H) - alan (A) oranını kullanarak enkaz hariç tek hücreleri (tekli) seçin. RBC'leri seçin ve lenfositleri, RBC belirtecinin (Ter119 veya CD235a) ve lenfosit spesifik antikorun (CD8a) floresansına dayanarak analizden hariç tutun.
- Önceki RBC geçişinde, CFSE pozitif boyamaya dayalı uygulanabilir RBC'leri seçin. Akış sitometresi veri analiz yazılımı ile verileri analiz edin.
10. Hesaplama ve istatistikler
- iRBC lizis yüzdesini hesaplamak için, adım 9'da açıklanan geçit stratejisini izleyin. Canlı RBC'lerin yüzdesi, Ter119 (fare) veya CD235a (insan) pozitif floresansına dayanan RBC kapısı içindeki CFSE-pozitif hücrelerin frekansıdır.
- Spontan lizis kontrolünü, efektör hücreleri olmayan RBC'leri, RBC spontan rüptürünü tahmin etmek için bir kontrol olarak kullanın. Bu durum RBC lizisi (% 100 canlılık) olarak kabul edilecektir. Test edilen her koşulda RBC lizis yüzdesini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
NOT: Kültür inkübasyonu sırasında, bazı enfekte RBC'ler kendiliğinden lize olabilir veya parazit tarafından yırtılabilir. Lenfosit sitotoksisitesinin temeli olarak, efektör hücre içermeyen spontan lizis durumunun CFSE-pozitif RBC frekansını kullanın. - Her koşul için üçlülerin ortalamasını hesaplayın ve çoklu karşılaştırmalarda iki yönlü ANOVA kullanarak istatistiksel anlamlılığı belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, CFSE etiketli Plasmodium ile enfekte RBC'lerin sitotoksik lenfositlerle bir kokültür testinde izolasyonu için uygulanan metodoloji açıklanmaktadır. İlk olarak, P. vivax ile enfekte olmuş insan örneklerini kullanarak protokolün nasıl gerçekleştirileceğine dair şematik bir temsil sunuyoruz (Şekil 1). Daha sonra, P. yoelii ile enfekte olmuş bir C57BL / 6 fare kullanarak sıtma deneysel modelinde protokole nasıl devam edileceğine dair resimli bir akış şeması (Şekil 2). Şekil 3'te, protokolün 6. adımı için beklenen sonuçlar (öncesi ve sonrası) (manyetik sütunlar kullanılarak P. yoelii ile enfekte RBC'lerin zenginleştirilmesi) gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 4, adım 9'da açıklandığı gibi, RBC lizis yüzdesini değerlendirmek için gereken geçit stratejisini detaylandıran temsili bir akış sitometri analizini göstermektedir. Bu nedenle, bu bölüm, sitotoksik lenfositler tarafından iRBC öldürmeyi değerlendirmek için edinim, montaj ve veri analizinin tüm sürecini açıklayan burada kullanılan farklı teknikleri vurgulamaktadır.
İnsan Plazmodyumu ile enfekte RBC'ler sitotoksik hücreler tarafından lizis
İnsan Plasmodium ile enfekte RBC'lerin sitotoksik hücreler tarafından öldürülmesini değerlendirmek için protokolün şematik bir temsili Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücre lizizini ölçmek için, Plasmodium ile enfekte olmuş hastalardan PBMC, ayırma ortamı kullanılarak saflaştırıldı, ardından ilgilenilen sitotoksik lenfosit (CTL) popülasyonunun manyetik saflaştırılması izledi (örneğin, CD8 + T, γδ T, NK, iNKT, MAIT hücreleri, vb.). RBC'lerin PBMC izolasyonundan kalan peletleri, yoğunluk gradyanı ayırma ortamı (% 65 P. falciparum; % 45 P. vivax) kullanarak Plasmodium ile enfekte RBC'leri zenginleştirmek için kullanıldı. iRBC'ler CFSE ile etiketlendi ve 37 ° C'de 4 saat boyunca lenfositlerle veya lenfositler olmadan inkübe edildi,% 5 CO2. Kokültür periyodundan sonra, tüm RBC'ler (enfekte olsun veya olmasın), akış sitometri analizinden önce anti-insan CD235a antikoru (RBC'ler için) ve CTL'ye özgü antikorlar (örneğin, anti-CD8, anti-γδTCR, vb.) ile etiketlendi. İnsan örneklerinin elde edilmesi ve analizi, Şekil 4'teki fare örnekleri için gösterilenlere benzerdi.
Sitotoksik CD8 + T hücreleri ile P. yoelii ile enfekte RBC lizisi
Deneysel sıtma modelinde sitotoksik efektör mekanizmasını değerlendirmek için deneysel prosedürün akış şeması, Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterilen temsili deneysel verilerle birlikte Şekil 2'de gösterilmiştir. C57BL/6 farelere 1 x 105P. yoelii (Py) iRBC'ler ile enfekte edildi ve parazitemi yaklaşık %30'a ulaşana kadar izlendi. Py-iRBC'ler manyetik ayırma kullanılarak kandan izole edildi, çünkü parazit heme alt ürünü hemozoin, demir bakımından zengindir ve manyetik alanda paramanyetik parçacıklar olarak işlev görür13. Zenginleştirilmiş numunenin saflığı, kolon öncesi numuneye kıyasla kan yayması ile analiz edildi (Şekil 3). iRBC'ler daha sonra hücre izleyici reaktifi CFSE ile etiketlendi. Buna paralel olarak, sitotoksik CD8 + T hücreleri, manyetik negatif seleksiyon kiti kullanılarak splenositlerden saflaştırıldı. Bir kontrol olarak, aynı protokol enfekte olmamış farelerden CD8 + T hücre saflaştırması için kullanıldı. Efektör (CD8 + T) ve hedef (CFSE etiketli Py-iRBC) hücreler, 37 ° C'de% 5 CO 2'de 4 saat boyunca farklı efektör: hedef oranlarında (E: T: 0.5: 1,2.5: 1 ve 5: 1) inkübe edildi. Kokültürün sonunda, her durum RBC'ler için anti-fare Ter119 ve sitotoksik hücreler için anti-CD8a antikorları ile etiketlendi. Geçit stratejisi ve örnek sonuçlar Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 1. İn vitro öldürme testinin şeması. Öldürme testi deneyi örneği. Plazmodyum ile enfekte olmuş kan, bir ayırma gradyanı ortamı kullanılarak toplanır ve işlenir. Santrifüjlemeden sonra, PBMC tabakası toplanır ve sitotoksik hücreler (CTL'ler) manyetik boncuklar kullanılarak saflaştırılır. RBC katmanı, yoğunluk gradyanı ayırma ortamı kullanılarak bir kez daha işlenir. Santrifüjlemeden sonra, Plasmodium-iRBC tabakası toplanır ve CFSE ile etiketlenir. Bundan sonra, saflaştırılmış CTL ve iRBC'ler 37 ° C'de,% 5 CO2'de 4 saat boyunca kokültüre alındı, ardından bir akış sitometresinde hücreye özgü etiketleme ve analiz yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Öldürme testi için deneysel sıtma modeli. İlk olarak, C57BL / 6 fareleri 105 PyX17NL ile enfekte kırmızı kan hücresi ile enfekte edildi. Daha sonra, parazitemi, enfeksiyonun zirvesine kadar (% 30-40 iRBC'ler), enfeksiyondan yaklaşık 12 gün sonra (dpi) kan yayması ile izlenir. Ertesi gün, fareler dalak toplanması için kanlandı ve ötenazi yapıldı. Kan işlendi ve enfekte RBC'ler manyetik ayırma ile zenginleştirildi, ardından CFSE (sağ üst) ile etiketlendi. Dalak, manyetik boncuklar kullanılarak negatif seleksiyon yoluyla sitotoksik lenfosit izolasyonu için işlendi. Daha sonra, saflaştırılmış sitotoksik lenfositler ve iRBC'ler, 37 ° C'de,% 5 CO2'de 4 saat boyunca kokültüre alındı, ardından bir akış sitometresinde hücreye özgü etiketleme ve analiz yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Manyetik sütunlar kullanarak iRBC zenginleştirme. İRBC'ler, LS sütunları kullanılarak P. yoelii ile enfekte olmuş farelerden saflaştırıldı. Saflaştırma, (A) sütun zenginleştirmeden önce ve sonra (B) toplanan kandan kan yaymaları ile vurgulanır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. P. yoelii-iRBC'lerin hücre lizis yüzdesinin CD8+ lenfositlerle değerlendirilmesi. Hücre lizis yüzdesi için geçit stratejisi. (A) Durdurma kapısını sayım boncuk popülasyonuna (~20.000 olay) ayarlayın. (B) Spontan lizis, lenfositsiz iRBC'leri kontrol edin. FSC tepe yüksekliği/alan oranına göre enkaz hariç tek hücreleri seçerek geçit stratejisine başlayın, ardından APC-Cy7 Ter119 pozitif ve PerCP-Cy5.5 CD8 negatif RBC popülasyonunun seçilmesiyle devam edin. Ardından, CFSE (FITC) yüksek pozitif olarak canlı iRBC'leri seçin. (C) Farklı efektör kullanan örnek deney analizi: kokültürden sonra canlı RBC yüzdesini gösteren hedef oranlar. (D) Bölüm 10'da açıklanan formüle göre hesaplanan RBC lizis yüzdesinin grafiksel gösterimi. Gruplar arasındaki anlamlılık karşılaştırması (sitotoksik CD8 veya naif CD8) çoklu karşılaştırmalarla iki yönlü ANOVA ile değerlendirildi. P < 0.0001 (****). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, sitotoksik lenfositler tarafından Plasmodium ile enfekte kırmızı kan hücresi öldürmeyi ölçmek için in vitro bir tahlil tarif ediyoruz. Bu tahlil, sıtma parazitinin eritrositik evresine hücresel koruyucu bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmaya yardımcı olabilir. Bu metodolojinin en büyük avantajı, bağışıklık hücrelerinin farklı Plasmodium spp ile nasıl etkileşime girdiği hakkında birçok soruyu ele almak için kullanılabilecek iRBC'lerin hücre aracılı öldürülmesinin nicel bir tahlilini sağlamasıdır.
Önemli olarak, bu yöntem P. vivax ve in vitro kültür14,15'te korunmayan diğer Plasmodium parazitlerini incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu protokol herhangi bir Plasmodium türüne ve insanlar, fareler ve insan olmayan primatlar gibi farklı konakçılara uyarlanabilir. Akım sitometrisine dayalı yöntemler, sitotoksik hücre aktivasyonunu, sitokin üretimini ve degranülasyonu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır10,11,16, ancak mevcut yöntem, RBC lizizini öldürücü hücrelerle doğrudan hücre teması yoluyla araştıran tek yöntemdir.
Parazitemi, invazyon ve sıtma önleyici aktiviteyi ölçerek sıtmayı incelemek için kullanılan mikroskopi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve akış sitometrisi gibi birçok yöntem de vardır. Bununla birlikte, RBC'lerin hücre aracılı sitotoksisitesini analiz etmek için, Cr51 veya hemoglobin salınımını kullanan mevcut yöntemler, RBC lizizini değerlendirmek için yeterince hassas değildir. LDH salınımı, CD8 + T hücreleri gibi bazı CTL'ler tarafından RBC öldürmeyi değerlendirmek için de kullanılabilir, ancak LDH'yi ölçmek, aktive edilmiş doğuştan gelen veya doğuştan gelen benzeri hücreler düzenleyici bir mekanizma olarak birbirlerini öldürebileceğinden doğru bir yöntem değildir.
CFSE, akış sitometrisinde veya floresan mikroskobunda hücreleri izlemek veya hücre proliferasyonunu keşfetmek için yaygın olarak kullanılır17. RBC'ler18 proliferasyon yapmadığından, CFSE floresan yoğunluğu hücre lizisi ile azalmalıdır. Akım sitometrisi, çok düşük spesifik belirteç seviyelerini tespit edebildiği için çok doğru bir tekniktir ve bu nedenle sıtma enfeksiyonunda parazitemi ve invazyonu izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır 19,20,21,22,23. En önemlisi, akış sitometrisi tek bir hücredeki birçok parametreyi ölçebilir ve hücreleri farklı popülasyonlara ayırabilir. Her numuneye kantitatif standart reaktifler (boncuk sayma) ekleyerek, elde edilen olayların sayısını normalleştirebilir ve mutlak hücre sayıları24 elde edilebilir. Bu yöntem, şu anda önerilen protokol için kritik olan deneysel koşullar arasında güvenilir bir nicel karşılaştırmaya izin verir.
Bu protokol için bazı kritik adımlar arasında numune kalitesinin sağlanması, uygun hücre boyanmasının sağlanması ve hesaplamaların normalleştirilmesi için kontrollerin dahil edilmesi yer almaktadır. Enfekte RBC'leri saflaştırmak için çok miktarda taze kan örneği gereklidir. Yoğunluk gradyanı ayırma ortamı saflaştırmasına, konsantrasyonu istenen Plasmodium iRBC'leri elde etmek için kritik öneme sahip olduğundan dikkatli bir şekilde yaklaşılmalıdır. Yoğunluk gradyanı ayırma ortamına kan bindirmesi de mümkün olduğunca yavaş yapılmalı ve halka kırmızı tabaka hasadı, iRBC'leri kaybetmemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Saflaştırma işlemini kolaylaştırmak için, iRBC'lerin miktarı daha yüksek olacağından yüksek parazitemi kan örneği kullanılmalıdır. Manyetik alanları kullanan RBC izolasyon protokolünde, sadece önemli miktarda hemozoin üreten parazit olgun aşamalarının (orta-geç evre trofozoitler veya şizontlar) saflaştırılacağı belirtilmelidir. Sonuç olarak, herhangi bir halka aşaması toplanmaz ve bu nihai sonucu etkileyebilir.
Hücre boyaması, hücrelerin kaybını veya parçalanmasını önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Lekelenmeden önce uzun süreli depolama veya fiksasyondan kaçınılmalıdır. Deneysel koşulların, seri efektör: hedef oranlar ve etiketlenmemiş, spontan lizis durumu ve hipotez kontrolü gibi uygun kontroller kullanılarak üçlü olarak gerçekleştirilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Hücre sayım boncuklarının eklenmesi, her numune için hücre konsantrasyonunu veya mutlak hücre sayımlarını belirlemenin kolay bir yolunu sağladığı için çok önemlidir. Akış sitometresi alımı sırasında, kokültürden sonra her numunedeki hücre sayısını normalleştirmek için sayma boncukları kapısında toplanacak olay sayısını ayarladığınızdan emin olun.
Bir kokültür testinde tutarlı sonuçlar için en az 1 x 105 efektör hücreye ihtiyaç duyulduğundan, tarif edilen metodolojinin olası bir sınırlaması, özellikle nadir hücre popülasyonlarıyla çalışırken endişe verici olabilen saflaştırmadan sonra sınırlı sayıda hücredir. Aslında, bu, iRBC saflaştırması için geçerlidir, çünkü özellikle endemik bölgelerde insan örnekleriyle çalışırken, kolayca elde edilemeyen çok yüksek bir parazitemiye sahip olmayı gerektirir.
Bir protokol iyileştirmesi, kokültür kuluçka süresi olabilir. Daha önce 12 saatlik bir inkübasyon süresi10,11 kullanmamıza rağmen, son zamanlarda deneysel koşulları ayırt etmek için 4 saatin yeterli olduğunu, böylece potansiyel spontan lizis süresini azalttığını ve sonuçların tekrarlanabilirliğini artırdığını gözlemledik.
Plasmodium ile enfekte RBC'lerin doğrudan öldürülmesinde rol oynayan mekanizmalar yavaş yavaş ortaya çıkarılmaktadır. Grubumuz, CD8 + T hücrelerinin, enfekte hücre11 tarafından HLA-I sunumu yoluyla P.vivax ile enfekte retikülositleri tanıyabildiğini ve öldürebildiğini gösteren ilk gruptur. Son zamanlarda, başka bir çalışma, γδ T hücrelerinin, iRBC'lerin yüzeyinde bulunan bir molekül olan bütirofilin tarafından fosfoantijen tanıma yoluyla P. falciparum ile enfekte olmuş RBC'leri tanıdığını göstermiştir10. Her iki çalışmada da RBC lizisi granülizin ve granzim B'ye bağımlıdır ve hücre içi parazit öldürmeye yol açar.
Parazitemi, invazyon, sıtma önleyici aktivite ve görüntü hücresi etkileşimini ölçmek için yıllar içinde birçok yöntem geliştirilmiş olmasına rağmen, hiçbiri kantitatif akış sitometrisine dayalı bir tahlil 19,20,21'de iRBC'lerin sitotoksik hücreler tarafından doğrudan öldürülmesini analiz edememiştir. Plazmodyum ile enfekte RBC'lerin CFSE etiketlemesi ve lenfositlerle belirli bir kokültür döneminde iRBC lizizinin değerlendirilmesi ile sıtmada hücre lizis kapasitesini değerlendirmek için yenilikçi bir yaklaşım kullandık. Bu nedenle, bu in vitro öldürme testi, kan evresi sıtmasına karşı hücre aracılı bağışıklık mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için yeni bir strateji sunar; bu, yeni terapötik hedeflerin araştırılmasına ve sıtma aşılarının geliştirilmesine yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Dr. Dhelio Pereira'ya ve Rondônia Tropikal Tıp Araştırma Merkezi (CEPEM) üyelerine sıtma hastası kaydı ve kan toplama için ve Felicia Ho'ya el yazması revizyonuna yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Aşağıdaki reaktif, Ana Rodriguez'in katkıda bulunduğu BEI Resources, NIAID, NIH ile elde edildi: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Strain 17XNL: PyGFP, MRA- 817. Bu araştırma Lemann Brezilya Araştırma Fonu, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, burslar (CJ, GC, CG) ve Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - burs (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R.
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
