Methodenartikel

Hochgeschwindigkeitsschnitt des menschlichen Temporalknochens zur Beurteilung der COVID-19-assoziierten Mittelohrpathologie

DOI:

10.3791/64012

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18. Mai 2022

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1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt eine Technik für die schnelle Durchtrennung von menschlichen Schläfenknochen, bei der eine Mikrosäge mit Zwillingsdiamantklingen verwendet wird, um dünne Scheiben für die schnelle Entkalkung und Analyse der Immunhistochemie des Schläfenbeins zu erzeugen.

Zusammenfassung

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Die histopathologische Analyse von menschlichen Schläfenbeinabschnitten ist eine grundlegende Technik zur Untersuchung der Innen- und Mittelohrpathologie. Schläfenknochenabschnitte werden durch postmortale Temporalknochenernte, Fixierung, Entkalkung, Einbettung und Färbung hergestellt. Aufgrund der Dichte des Schläfenbeins ist die Entkalkung ein zeit- und ressourcenintensiver Prozess; Die vollständige Gewebepräparation kann durchschnittlich 9-10 Monate dauern. Dies verlangsamt die otopathologische Forschung und behindert zeitkritische Studien, wie sie für die COVID-19-Pandemie relevant sind. Dieses Papier beschreibt eine Technik zur schnellen Vorbereitung und Entkalkung von Schläfenbeinabschnitten, um die Gewebeverarbeitung zu beschleunigen.

Schläfenknochen wurden postmortal mit Standardtechniken geerntet und in 10% Formalin fixiert. Eine Präzisions-Mikrosäge mit zwei Diamantklingen wurde verwendet, um jeden Abschnitt in drei dicke Abschnitte zu schneiden. Dicke Schläfenknochenabschnitte wurden dann 7-10 Tage lang in Entkalkungslösung entkalkt, bevor sie in Paraffin eingebettet, mit einem Kryotom in dünne (10 μm) Abschnitte geschnitten und auf ungeladenen Objektträgern montiert wurden. Anschließend wurden Gewebeproben deparaffinisiert und zur Antikörperfärbung rehydriert (ACE2, TMPRSS2, Furin) und abgebildet. Diese Technik reduzierte die Zeit von der Ernte bis zur Gewebeanalyse von 9-10 Monaten auf 10-14 Tage. Hochgeschwindigkeits-Schläfenbeinschnitte können die Geschwindigkeit der otopathologischen Forschung erhöhen und die für die Gewebepräparation erforderlichen Ressourcen reduzieren, während gleichzeitig zeitkritische Studien wie die im Zusammenhang mit COVID-19 erleichtert werden.

Einleitung

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Die Erforschung des menschlichen Temporalknochens bietet eine unschätzbare Ressource, um die Pathologie und Pathophysiologie des Innen- und Mittelohrs zu untersuchen. Vor dem 19. Jahrhundert war wenig über die otologische Erkrankung 1,2,3 bekannt. Um die otologische Erkrankung besser zu verstehen und "die Hörchirurgie aus den Händen von Quacksalbern zu retten", entwickelte Joseph Toynbee (1815-1866) Methoden, um histologische Abschnitte des menschlichen Schläfenbeinszu untersuchen 3. Diese Arbeit wurde von Adam Politzer (1835-1920) in Wien und anderen in ganz Europa während des restlichen 19. Jahrhunderts gefördert, der Schläfenbeinabschnitte verwendete, um die Histopathologie vieler häufiger Erkrankungen des Ohres zu beschreiben 2,3,4.

Das erste Labor für menschliche Schläfenknochen in den Vereinigten Staaten wurde 1927 am Johns Hopkins Hospital eröffnet, wo Stacy Guild (1890-1966) Methoden für die Schläfenbeinschnitte 5,6 entwickelte. Die von Guild entwickelten Methoden bestanden aus einem 9-10-monatigen Prozess, der die postmortale Ernte, Fixierung, Entkalkung in Salpetersäure, Dehydratation in Ethanol, Celloidineinbettung, Schnitt, Färbung und Montage umfasste. Modifikationen an dieser Technik wurden später von Harold Schuknecht (1917-1996)7 vorgenommen; Die Grundkomponenten dieses Prozesses bleiben jedoch im Wesentlichen unverändert.

Die erheblichen Ressourcen, die für die Aufrechterhaltung eines Schläfenbeinlabors erforderlich sind, haben eine Herausforderung für die Schläfenknochenforschung darstellt und wahrscheinlich zu ihrer abnehmenden Popularität in den letzten 30 Jahren beigetragen 4,8. Ein erheblicher Teil der Laborressourcen für Schläfenknochen muss dem 9-10-monatigen Prozess der Schläfenknochenpräparation gewidmet werden. Einer der zeitaufwendigsten Schritte in der Vorbereitung ist die Entkalkung des Schläfenbeins, des dichtesten Knochens im menschlichen Körper. Die Entkalkung wird typischerweise in Salpetersäure oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) durchgeführt und dauert Wochen bis Monate, während ein häufiger Wechsel der Lösungenerforderlich ist 7,9. Darüber hinaus können zeitkritische Studien des menschlichen Ohrs, wie sie sich auf die COVID-19-Pandemie beziehen, durch diesen langsamen Vorbereitungsprozess behindert werden. Dieses Papier beschreibt eine Technik für Hochgeschwindigkeits-Schläfenknochenschnitte, die eine Diamant-Mikrosäge verwendet, um dicke Abschnitte zu erzeugen, die eine schnelle Entkalkung und Gewebeanalyse innerhalb von 10-14 Tagen nach der Schläfenknochenernte ermöglichen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll wurde mit der Genehmigung des IRB (IRB00250002) und in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem Gewebe und infektiösem Material entwickelt. Jeder Schläfenbeinspender gab vor dem Tod eine schriftliche Zustimmung, oder die Zustimmung wurde posthum von der Familie des Spenders eingeholt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Schläfenbeinernte

  1. Holen Sie die Genehmigung des lokalen Institutional Review Board (IRB) ein, überprüfen Sie die institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem und infektiösem Material und holen Sie die Zustimmung zur Gewebespende ein, bevor Sie dieses Protokoll verwenden.
  2. Ziehen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung (PSA) an, bevor Sie mit Gewebe von COVID-19-positiven Schläfenbeinspendern arbeiten. Stellen Sie sicher, dass die PSA aus einem N-95-Atemschutzgerät und einem Gesichtsschutz (oder alternativ einem Überdruck-Luftreinigungssystem), einem Kittel und zwei Paar Handschuhen besteht. Überprüfen Sie die Techniken zum ordnungsgemäßen An- und Ausziehen von PSA, bevor Sie mit diesem Protokoll10 beginnen.
  3. Ernten Sie Schläfenbeingewebe innerhalb von 12-24 Stunden nach dem Tod des Spenders. Wenn der Körper nicht gekühlt wird, stellen Sie sicher, dass die Ernte innerhalb von 8 Stunden nach dem Tod erfolgt.
    1. Ernten Sie Schläfenknochen während der Autopsie mit der Vier-Inzisions-Block-Methode von Osteotom7.
      1. Entfernen Sie nach der Kraniotomie das Gehirn und teilen Sie die Hirnnerven stark in den inneren Gehörgang auf.
      2. Machen Sie den ersten knöchernen Schnitt mit dem Osteotom parallel zum und nur medial zum Plattenepithelbereich des Schläfenbeins.
      3. Führen Sie den zweiten knöchernen Schnitt parallel zum ersten an der medialen Grenze des Schläfenbeins durch.
      4. Dann machen Sie den dritten Schnitt 3-4 cm vor und parallel zum Petrouskamm.
      5. Machen Sie den vierten Schnitt ungefähr parallel zum dritten, 2 cm nach dem Petrousgrat.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Einschnitte durch die Schädelbasis reichen.
      6. Entfernen Sie dann den Schläfenbein mit scharfer Dissektion, um den Weichteilansatz entlang der unteren Kante der Probe zu lösen. Wenn die Einbalsamierung nach der Schläfenknochenernte durchgeführt werden soll, binden Sie den Stumpf der Halsschlagader ab.

2. Gewebefixierung, Entkalkung und Schnitt

  1. Legen Sie das Gewebe sofort in 200-300 ml 10% gepuffertes Formalin (Formaldehyd), so dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist. Lassen Sie das Gewebe mindestens 72 h bei Raumtemperatur in Formaldehyd und wechseln Sie die Lösungen täglich. Lagern Sie das Gewebe in einem luftdichten Behälter und führen Sie Lösungswechsel unter einem Abzug durch, während Sie geeignete PSA tragen, um eine Ausbreitung des Virus zu verhindern.
    HINWEIS: Nach der 72-stündigen Fixierungszeit müssen die Proben nicht mehr als infektiös angesehen werden.
  2. Verwenden Sie eine Präzisionsmikrosäge mit zwei Diamantklingen, um jede Probe in drei "dicke" Abschnitte zu schneiden, um eine schnellere Gewebeentkalkung zu ermöglichen. Stellen Sie die Zwillingsdiamantklingen auf einen Abstand von 5 mm ein, so dass der mittlere Abschnitt des Schläfenbeins 5 mm dick ist. Stellen Sie sicher, dass die Gewebeabschnitte an beiden Enden 3-5 mm dick sind.
  3. Die dicken Abschnitte in 200-300 ml 23% ohne Ameisensäureentkalkungslösung für 7-10 Tage bei Raumtemperatur geben, bis das Gewebe weich genug für die Paraffineinbettung ist. Ändern Sie die Lösungen täglich. Überprüfen Sie auf eine ausreichende Gewebeentkalkung, indem Sie die Probe abtasten, die sich weich anfühlen sollte.
    HINWEIS: Die Entkalkung kann auch durch Röntgenstrahlen verifiziert werden.
  4. Spülen Sie die Proben 24 h lang in fließendem Leitungswasser ab, indem Sie sie in ein großes Becherglas unter einem laufenden Wasserhahn legen.
  5. Dehydrieren Sie das Gewebe in einer Reihe von Alkoholen mit zunehmender Konzentration7. Tauchen Sie das Gewebe in 100-200 ml 70% Ethanol für 1,5 h ein, gefolgt von drei Wäschen in 95% bzw. 100% Ethanol für jeweils 1,5 h. Als nächstes waschen Sie das Gewebe 3 x 1,5 h in Xylol.
  6. Betten Sie die dicken Abschnitte in Paraffin ein, mit vier Behandlungen von jeweils 45 Minuten.
  7. Verwenden Sie ein Kryotom, um dünne (10 μm) Schnitte zu schneiden. Positionieren Sie das Gewebe so, dass das Gewebe in der axialen Ebene geschnitten wird. Schneiden Sie auf Wunsch dickere (20 μm) Abschnitte.

3. Immunhistochemie und Bildgebung

  1. Wenn eine herkömmliche Hämatoxylin- und Eosinfärbung gewünscht ist (hier nicht beschrieben), führen Sie eine Färbung durch, bevor Sie die Abschnitte auf Glasobjektträgern7 montieren.
  2. Montieren Sie die Abschnitte auf positiv geladenen Glasobjektträgern.
  3. Backen Sie die Dias auf einer heißen Platte bei 60 °C für 20 min.
  4. Legen Sie die Objektträger in einen Halter und tauchen Sie sie in eine kommerzielle Vorbehandlungslösung, die ein organisches Lösungsmittel (in diesem Fall Diethanolamin) und Ethanol enthält, um das Gewebe zu entparaffinisieren, zu rehydrieren und zu entlarven.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um zufriedenstellende Ergebnisse mit der Immunhistochemie für formalinfixiertes und paraffineingebettetes Gewebe zu erzielen.
  5. Erhitzen Sie die Objektträger in einem Schnellkochtopf auf Hochdruck für 20 min.
  6. Legen Sie die Objektträger in eine befeuchtete Kammer und blockieren Sie das Gewebe mit einer kommerziellen Blockierlösung.
  7. Sondieren Sie die Gewebeabschnitte mit dem primären Antikörper gegen das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2; 1:50), Transmembran-Protease-Serin 2 (TMPRSS2, 1:1.000) und die Furin-Protease (1:250).
    HINWEIS: Die ACE2-, TMPRSS2- und Furin-Antikörper werden verwendet, weil angenommen wird, dass diese Proteine eine Rolle bei der SARS-CoV-2-Infektiosität 11,12 spielen, und dieses Protokoll versuchte, die möglichen Mechanismen zu untersuchen, durch die SARS-CoV-2 das Mittelohrinfizieren kann13.
  8. Behandlung mit HRP-konjugiertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (ACE2, Furin; 1:100-Verdünnung) oder Anti-Ziegen-Antikörper (TMPRSS2, 1:100-Verdünnung).
  9. Den Objektträgern mit 70% Hämatoxylin in Wasser entgegenwirken.
  10. Erfassen Sie Bilder auf einem Lichtmikroskop mit einer montierten Digitalkamera. Erhalten Sie Bilder der Mittelohrschleimhaut und der Eustachischen Röhre mit 20-facher bzw. 10-facher Vergrößerung.

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Ergebnisse

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Hämatoxylin- und Eosinfärbungen der Mittelohrschleimhaut und der Eustachischen Röhre zeigten nach der Verarbeitung eine Erhaltung der Mittelohrschleimhaut und des submukösen Mittelohrgewebes (Abbildung 1). Immunhistochemische Bilder zeigten die Expression der Proteine ACE2, TMPRSS2 und Furin in der Mittelohrschleimhaut und der Eustachischen Röhre (Abbildung 1). Das Vorhandensein dieser Proteine im Mittelohr bietet einen möglichen Weg, auf dem SARS-CoV...

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Diskussion

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Die Erforschung des menschlichen Schläfenbeins ist für die Untersuchung der Innen- und Mittelohrpathologie von entscheidender Bedeutung, bleibt aber ein zeit- und ressourcenintensives Unterfangen. Dieses Papier beschreibt eine Technik, die eine Diamant-Mikrosäge verwendet, um dicke Schläfenknochenabschnitte zu erzeugen, die vor dem weiteren Schneiden schnell entkalkt werden können, so dass die Zeit von der Gewebeernte bis zur Untersuchung von 9-10 Monaten auf 10-14 Tage verkürzt werden kann. Diese Technik kann die für di...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Wir danken Mohamed Lehar für seine Unterstützung bei diesem Projekt. Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (T32DC000027, NSA) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-ACE-2 Antikörper (1:50 Verdünnung)Novus BiologicalsSN0754
Anti-Furin Antikörper (1:250 Verdünnung)AbcamEPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antikörper (1:1.000 Verdünnung)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 Manuelles SystemmikroskopOlympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering BladePace TechnologiesWB-007GP
Collin Mallet - 8''Surgical MartSM1517
DS-Fi3 Mikroskop KameraNikon
Dual Endogenous Enzyme Block (kommerzielle Blockierungslösung)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
Formalinlösung, neutral gepuffert 10%Sigma-AldrichHT501128
Formical-4 Entkalker (Ameisensäure-Entkalkungslösung)StatLab1214-1 GAL
Hämatoxylin-FärbungSigma-AldrichH9627
HRP-konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:100 Verdünnung)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP Pferd Anti-Ziegen-igG-Nachweiskit, Peroxidase (1:100 Verdünnung)Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte OsteotomeSurgical MartSM1553
Metallographische PICO 155P PräzisionssägePace TechnologiesPICO 155PMikrosäge
NIS Elements Software Version 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683Paraffin
Positiv geladene Objektträger mit weißem, mattiertem EndeWalter Products1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Kryostat MikrotomNew Life Scientific Inc.A78900104
(kommerzielle Vorbehandlungslösung)Sigma-Aldrich920P-05
XylolSigma-Aldrich920P-05
Kryotom-Triologie-Vorbehandlungslösung

Referenzen

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  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
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Schlagwörter

COVID 19 Pathologieschnelle Dekalzifizierungotopathologische ForschungImmunhistochemiePr zisionsmikros geGewebeeinbettungH matoxylin Eosin F rbungACE2 Protein

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