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Methodenartikel

Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Gehirnschnitten

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DOI:

10.3791/64013

⸱

22. Juli 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology, Oklahoma State University, 2Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Colorado Anschutz

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Visualisierung der Myelinisierung ist ein wichtiges Ziel für viele Forscher, die das Nervensystem untersuchen. CARS ist eine Technik, die mit der Immunfluoreszenz kompatibel ist und nativ Lipide in Geweben wie dem Gehirn abbilden kann, die spezialisierte Strukturen wie Myelin beleuchten.

Zusammenfassung

Die kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) ist eine Technik, die klassischerweise von Chemikern und Physikern eingesetzt wird, um ein kohärentes Signal von Signaturschwingungen von Molekülen zu erzeugen. Diese Schwingungssignaturen sind jedoch auch charakteristisch für Moleküle in anatomischem Gewebe wie dem Gehirn, was sie zunehmend nützlich und anwendbar für neurowissenschaftliche Anwendungen macht. Zum Beispiel kann CARS Lipide messen, indem es chemische Bindungen innerhalb dieser Moleküle spezifisch anregt, was die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Gewebes ermöglicht, wie Myelin, das an der Neurotransmission beteiligt ist. Darüber hinaus kann CARS im Vergleich zu anderen Techniken, die typischerweise zur Quantifizierung von Myelin verwendet werden, auch so eingerichtet werden, dass sie mit immunfluoreszierenden Techniken kompatibel sind, was eine Co-Markierung mit anderen Markern wie Natriumkanälen oder anderen Komponenten der synaptischen Übertragung ermöglicht. Myelinisierungsveränderungen sind ein inhärent wichtiger Mechanismus bei demyelinisierenden Krankheiten wie Multipler Sklerose oder anderen neurologischen Erkrankungen wie dem Fragile-X-Syndrom oder Autismus-Spektrum-Störungen ist ein aufstrebendes Forschungsgebiet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CARS auf innovative Weise eingesetzt werden kann, um drängende Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten und Beweise für die zugrunde liegenden Mechanismen im Zusammenhang mit vielen verschiedenen neurologischen Erkrankungen zu liefern.

Einleitung

Aktionspotentiale sind die grundlegende Informationseinheit im Gehirn, und die Ausbreitung des Aktionspotentials durch Axone bildet eine Säule der Informationsverarbeitung 1,2,3. Neuronen erhalten typischerweise afferente Eingaben von mehreren anderen Neuronen und integrieren diese Eingaben innerhalb eines bestimmten engen Zeitfensters 4,5. Daher haben die Mechanismen der potenziellen Ausbreitung von Axonen eine signifikante Aufmerksamkeit von Forschern erhalten.

Bei der Ausbreitung durch ein Axon wird ein Aktionspotential wiederholt entlang des Axons regeneriert, um eine zuverlässige Ausbreitungzu gewährleisten 6. In den meisten Neuronen von Kieferwirbeltieren (Gnathostomen) sind die Axone von einer Hülle aus Myelin umgeben, einer lipidreichen Substanz, die von nahe gelegenen Oligodendrozyten oder Schwann-Zellen produziert wird, die Arten von Gliazellen sind (überprüft in 7,8). Diese Myelinhülle isoliert das Axon elektrisch, reduziert seine Kapazität und ermöglicht eine effiziente, schnelle und mit geringerem Energieverbrauch ausbreitende Ausbreitung des Aktionspotentials. Myelin bedeckt das Axon nicht gleichmäßig, aber es umhüllt das Axon in Segmente, die kurze Lücken zwischen ihnen haben, die sogenannten Knoten von Ranvier (überprüft in 9,10). Sowohl die Myelinisierungsdicke, die das Niveau der elektrischen Isolierung eines Axons steuert, als auch der Abstand der Knoten von Ranvier, die die Frequenz steuern, mit der Aktionspotentiale entlang eines Axons regeneriert werden, beeinflussen die Geschwindigkeit der Ausbreitung des Aktionspotentials (überprüft in11).

Es gibt eine große Menge an Literatur, die darauf hindeutet, dass die Myelinisierungsdicke die Geschwindigkeit der Aktionspotentialausbreitung in den Axonenbeeinflusst 12,13,14. Darüber hinaus können Veränderungen in der Axonmyelinisierung zu einer Reihe von ZNS-Defizitenführen 15,16,17,18,19,20,21. Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Schwerpunkt vieler Forschungsbemühungen auf der Messung und Charakterisierung der Axonmyelinisierung liegt. Messungen der Myelindicke wurden am häufigsten mit Elektronenmikroskopie durchgeführt, einer Technik, die eine erhebliche Menge an Gewebevorbereitung erfordert und in Kombination mit Immunhistochemie schwierig zu verwenden ist. Es gibt jedoch auch eine schnellere und einfachere Technik zur Messung der Axonmyelinisierung, die auf der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) basiert. Ein CARS-Laser kann auf verschiedene Frequenzen abgestimmt werden, und wenn er auf Frequenzen abgestimmt ist, die geeignet sind, Lipide anzuregen, kann Myelin ohne zusätzliche Markierungen abgebildet werden22. Die Lipidbildgebung kann mit der Standard-Immunhistochemie kombiniert werden, so dass Lipide zusammen mit mehreren Fluoreszenzkanälen abgebildet werden können23. Die Bildgebung der Myelinisierung mit CARS ist signifikant schneller als die Elektronenmikroskopie und hat eine Auflösung, die, wenn auch niedriger als EM, ausreicht, um selbst kleine Unterschiede in der Myelinisierung in der gleichen Art von Axonen zu erkennen.

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Protokoll

Alle Experimente entsprachen allen geltenden Gesetzen, den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden vom University of Colorado Anschutz Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Tiere

  1. Verwenden Sie C57BL / 6J (Stock # 000664) Mäuse (Mus musculus), die vom Jackson Laboratory stammen, oder mongolische Rennmäuse (Meriones unguiculatus), die ursprünglich aus Charles River stammen.

2. Gewebevorbereitung

  1. Für die transkardiale Perfusion wird eine Überdosierung von Nagetierarten mit Pentobarbital (120 mg/kg Körpergewicht) und eine transkardiale Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) gefolgt von4% Paraformaldehyd (PFA)24 durchgeführt.
    1. Öffnen Sie insbesondere den Bauch und den Brustkorb mit einer Schere und halten Sie den Brustkorb mit einer blutstillenden Kelly-Pinzette fest, um das Herz freizulegen.
    2. Führen Sie eine 23 GA-Nadel, die mit einer Perfusionspumpe verbunden ist, in den linken Ventrikel ein und schneiden Sie schnell den rechten Vorhof mit einer feinen Schere.
    3. Verabreichen Sie PBS durch die Perfusionspumpe und die Nadel im Herzen für 10 Minuten, um das Gehirn und den Körper von Blut zu befreien.
    4. Schalten Sie die Perfusionspumpe für 10 Minuten auf 4% PFA und überprüfen Sie die Steifigkeit der Gliedmaßen und des Schwanzes, um eine erfolgreiche Perfusion zu bestätigen.
  2. Enthaupten Sie die Tiere nach der Durchblutung und entfernen Sie ihr Gehirn aus dem Schädel. Halten Sie das Gehirn über Nacht in 4% PFA, bevor Sie auf PBS übertragen. Hirnstängel in 4% Agarose (in PBS) einbetten und koronal mit einem Vibratom in 200 μm Dicke schneiden.

3. Färbung

  1. Fleckenfrei schwimmende Abschnitte für Nissl, zur Visualisierung von Zellkörpern (1:100), in Antikörpermedien (AB-Medien: 0,1 M Phosphatpuffer (PB: 50 mM KH 2PO 4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% Rinderserumalbumin (BSA)) für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Standard-Laborschüttler25.
    1. Schützen Sie Abschnitte mit Aluminiumfolie und/oder einer Abdeckung vor Licht. Wellenlängen von 550 nm oder darunter sind mit der CARS-Bildgebung kompatibel (Abbildung 1).
      HINWEIS: Obwohl wir nicht erwarten, dass Triton-X oder andere Reagenzien einen Einfluss auf die CARS-Bildgebung von Lipiden haben, können zusätzliche Kontrollen mit spezifischen Antikörpermedien gerechtfertigt sein.
  2. PAUSENPUNKT: Speichern Sie frei schwebende Abschnitte (während sie vor Licht geschützt sind) in PBS bis zur Bildgebung. Nach dem Schneiden Bildhirnschnitte innerhalb von 2 Wochen.

figure-protocol-1
Abbildung 1: CARS-Bildgebung kann mit Immunfluoreszenzbildgebung kombiniert werden. Die Grafiken zeigen, dass die CARS-Bildgebung bei 660/640 nm rotem Signalspektrum26 erfolgt. Diese Wellenlänge ist ausreichend weit vom grünen, blauen oder UV-Bereich entfernt, so dass das CARS-Signal mit Immunfluoreszenz in diesen Bereichen kombiniert werden kann. Insbesondere zeigt die Grafik auch die Anregung und Emission für Nissl, das mit blauem Fluorophor markiert ist, das mit CARS während der Sammlung repräsentativer Ergebnisse für diese Publikation kombiniert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Bildgebung

HINWEIS: Der CARS-Laseraufbau enthält einen Faserlaser, der den 80-MHz-Takt liefert, und einen OPO-Laser (Optical Parametric Oscillator) mit einem abstimmbaren Bereich von 770-990 nm, wobei der Stokes-Strahl auf 1031 nm festgelegt ist, die zum Erfassen des CARS-Signals benötigt werden. Es gibt eine Blende für beide Strahlen.

  1. Bevor Sie Proben zum Mikroskop bringen, schalten Sie den CARS-Laser ein und erwärmen Sie ihn für mindestens 1 Stunde, richten Sie den CARS-Laser und Koehler die Kondensatoroptik und die Membran des Mikroskops für die CARS-Bildgebung aus.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion der CARS-Mikroskopie.
    1. Für die räumliche Ausrichtung der beiden Laserstrahlen (Pump und Stokes) greifen Sie über die CARS-Laser-GUI auf die beiden internen PSDs (positionsempfindliche Detektoren) zu.
    2. Erreichen Sie eine zeitliche Ausrichtung mithilfe der Verzögerungsfunktion in der CARS-Laser-GUI, die dazu beitragen kann, die Pulse der beiden Laser (Pump und Stokes) zu überlappen, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Wellenlängen unterschiedliche Dispersionen aufweisen. Daher erfolgt sowohl die zeitliche als auch die räumliche Überlappung der Pumpen- und Stokes-Strahlen mit der Benutzereingabe über die GUI.
    3. Stellen Sie das externe Periskop (die letzten beiden Spiegel des Aufbaus) so ein, dass die räumlich überlappenden zwei Laser auf die Rasterkopfspiegel des Mikroskops zentriert werden.
    4. Stellen Sie sicher, dass der Kondensator Koehler-ed ist (d. h. der Kondensator ist zentriert und auf die Membran fokussiert, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erzielen).
  2. Für die konfokale Immunfluoreszenz- und CARS-Bildgebung ist der CARS-Laser mit nicht descannten Vorwärts- und epi-CARS-Detektoren (NDDs) ausgestattet, indem ein konfokales Mikroskop mit sichtbaren Lasern für die Fluoreszenzbildgebung integriert wird (Abbildung 2).
  3. Legen Sie Abschnitte in eine Kulturschale mit Deckglas (für invertierte Mikroskopie), PBS, um das Austrocknen des Gewebes zu vermeiden, und einem Glasgewicht, um Gewebe in der Nähe von Deckglas zu halten.
  4. Nehmen Sie Z-Stacks oder Einzelbilder mit einem 60X, 1,2 NA infrarotkorrigierten Wasserobjektiv auf, das zur Erfassung des CARS-Signals in epi-Richtung und durch einen 0,55 NA-Kondensator in Vorwärtsrichtung zur Abbildung von Gehirnbereichen wie dem medialen Kern des Trapezkörpers (MNTB) dient.
    1. Nehmen Sie die CARS-Bilder mit ca. 600 mW Pumpe/Sonde und 300 mW Stokes mit der CARS-Laser-GUI auf. Diese Laserleistungswerte werden systemintern gemessen. Die Leistungen beider Laser am Probenort betragen weniger als 25 mW und sind sicher für die Gewebeprobe.
    2. Überlappen Sie die Pumpen- und Stokes-Strahlen räumlich und zeitlich. Stellen Sie das OPO auf 797,2 nm ein. Dies ergibt eine CARS-Wellenlänge von 650 nm. Aufgrund des höheren Energieniveaus ist die resultierende Rückkehr in den Grundzustand Anti-Stokes (blau verschoben) zur Anregung.
    3. Erfassung des CARS-Signals in epi- oder vorwärts nicht descannten Detektoren mit Bandpassfiltern (640-680 nm), gefolgt von sequentieller Detektion der Immunfluoreszenzmarkierung (in diesem Fall fluoreszenzmarkiert Nissl).
      HINWEIS: Der neuronale Nissl-Soma-Marker wird nicht im Bandpassfilter CARS 640-680 nm erfasst, was die Kombination von Fluoreszenz und CARS-Bildgebung in den unten dargestellten Bildern ermöglicht.
    4. Die CARS und die Fluoreszenz teilen sich keine PMTs. Verwenden Sie diese Einstellungen für ein optimales Lipidsignal, um die Myelinisierung im Gehirnbereich selektiv abzubilden.
      ACHTUNG: Schützen Sie den Benutzer vor dem Laserstrahl
  5. Speichern Sie die Bilder als OIB-Dateien, die zur weiteren Quantifizierung in ein Bildanalyseprogramm importiert werden können (Abbildung 3).

figure-protocol-2
Abbildung 2: CARS-Instrumentendiagramm mit CARS-Lasern (rote Pfeile) und nicht gescannter (NDD) Epi- und Vorwärtsdetektion, die in ein Laserscanning-Konfokal integriert sind. In Forward NDD erwerben wir CARS für C-H-Bindungen (dunkelrote Pfeile) und SHG (zweite harmonische Generatioin) bei 515 nm (oranger Pfeil). In epi NDD erwerben wir CARS für C-H-Bindungen (dunkelrote Pfeile) und 2PE (Zwei-Photonen-Emission) Autofluoreszenz (hellblauer Pfeil). Sequentiell können konfokale Fluoreszenzbilder aufgenommen werden (grüne Pfeile für sichtbaren Laser, blaue Pfeile für konfokale Detektion). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-protocol-3
Abbildung 3: CARS kann Myelin (Magenta) im Hirngewebe (Hirnstamm) beleuchten und gleichzeitig Nissl (Cyan) oder fluoreszierende Marker abbilden. Die beiden Panels zeigen repräsentative Ergebnisse einer mongolischen Rennmaus (Einzelbild M. unguiculatus, Abbildung 3A,C,E) und Maus (z-stack max projection M. musculus, Abbildung 2B,D,F), was darauf hindeutet, dass diese Technik artübergreifend angewendet werden kann. Abbildung 3A,B zeigt Nissl in Cyan, C,D zeigt das CARS-Signal in Magenta, E,F kombiniert die Nissl- und CARS-Signale mit jedem Panel für Rennmaus bzw. Maus. Beide Bildsätze zeigen einen Ausschnitt des medialen Kerns des Trapezkörpers (MNTB) im Hirnstamm. Neuronen im MNTB erhalten Eingaben von stark myelinisierten Axonen, die im Kelch von Held, einer Art Riesensynapse27, enden. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Ergebnisse

Einer der größten Vorteile der CARS-Mikroskopie gegenüber anderen Techniken ist die Kompatibilität mit der Fluoreszenzbildgebung23. Abbildung 1 zeigt die CARS-Spektren im Vergleich zu Nissl, markiert mit Immunfluoreszenzmarker, die eine geringe / keine Überlappung der Spektren aufweisen. Abbildung 2 zeigt den Laseraufbau für CARS in Kombination mit konfokaler Mikroskopie. Abbildung 3 zeigt zwei repräsentative...

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Diskussion

Eine wachsende Anzahl von Literatur betont die Rolle von Myelin in der Gehirnfunktion 13,16,21,28. Darüber hinaus wissen wir, dass sich die Myelinisierungsdicke und das Myelinisierungsmuster bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (überprüft in29), Alterung (überprüft in 30), Autismus20, 31...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Unterstützt von NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) und NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 und FRAXA (McCullagh). Die CARS-Bildgebung wurde im Advanced Light Microscopy Core-Teil des NeuroTechnology Center am Anschutz Medical Campus der University of Colorado durchgeführt, der teilweise von NIH P30 NS048154 und NIH P30 DK116073 unterstützt wurde.

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anästhesie:
1 mL Einwegspritze mit Nadel 27 GA x 0,5"Exel int260040
Tödlich +Vortech
Chirurgie:
Federschere - 8mm Cutting EdgeFine Science Tools15024-10
Standard-PinzetteFine Science Tools11027-12
Perfusion:
4% ParaformaldehydFisher ChemicalSF994 (CS)
Feine Schere - SharpFine Science Tools14063-11
Kelly HämostateFine Science Tools13019-14
Millipore H2O
Nadelspitze, 23 GA x 1"BD Präzisionsgleiter305193
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS):
KaliumchloridSigmaP9333
Kaliumphosphat-MonobaseSigmaP5655
Pumpe mit variablem Durchfluss oder gleichwertig
NatriumchloridFisher Chemicals271-1
Natriumphosphat zweibasischSigmaS7907
Dissektion:
50 mL Fläschchen mit 4% PFA
Bochem Chemical Spoon 180mmBochem230331000
Feinschere - SharpFine Science Tools14063-11
Noyes FederschereFine Science Tools15011-12
Paar feine (Graefe) PinzettenFine Science Tools11050-10
Flache Glas- oder Kunststoffschale, ca. 10" x 10"
StandardpinzetteFine Science Tools11027-12
Chirurgische Schere - BluntFine Science Werkzeuge14000-20
Schneiden:
Agar, PflanzeRPI9002-18-0
VibratomeLeicaVT1000s
Well-PlatteAlkali Sci.TPN1048-NT
strong>Färbung:
AB Medien:1n 1.000 ml Millipore H2
O Phosphat gepuffert (PB):
Kaliumphosphat MonobaseSigmaP5655
Natriumphosohat DibasischSigmaS7907
BSA (Rinderserumalbumin)Sigma life scienceA2153-100g
NatriumchloridFisher Chemicals271-1
Triton X-100Sigma - Aldrichx100-500ml
Nissl 435/455InvitrogenN21479
CARS:
APE  picoemererd laserAngewandte Physik & Elektronik  GmbH
Bandpassfilter (420-520 nm)Chroma TechnologyHQ470/100m-2P
Bandpassfilter (500-530 nm)Chroma TechnologyHQ515/30m-2P
Bandpassfilter (640-680 nm)Chroma TechnologyHQ660/40m-2P
KonfokalmikroskopOlympusFV1000
Cut Transfer PipetteFisher13-711-7M
dichroitischer Langpass 565 nmChroma Technology565dcxr
dichroitischer Langpass 585 nmChroma Technology585dcxr
dichroitischer Kurzpass 750 nmChroma TechnologyT750spxrxt
Kulturschale mit GlasbodenMatTekP35G-0-10-C
Glasgewicht (10 mm x 10 mm Borstab)Allen Scientific Glass Inc
Multiphotonen-Kurzpass-Emissionsfilter 680 nmChroma TechnologyET680sp-2p8
PBS

Referenzen

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