Methodenartikel

Beschaffung und Dezellularisierung von Rattenhinterbeinen mit einem Ex-vivo-Perfusions-basierten Bioreaktor für die vaskularisierte Komposit-Allotransplantation

DOI:

10.3791/64069

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9. Juni 2022

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1Latner Thoracic Research Surgical Laboratories, University Health Network, Toronto General Hospital, 2Institute of Medical Science, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 4Division of Plastic & Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben die Operationstechnik und den Dezellularisierungsprozess für zusammengesetzte Rattenhinterbeine. Die Dezellularisierung erfolgt unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat mit niedriger Konzentration durch ein Ex-vivo-Maschinenperfusionssystem.

Zusammenfassung

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Patienten mit schweren traumatischen Verletzungen und Gewebeverlust benötigen eine komplexe chirurgische Rekonstruktion. Vaskularisierte Komposit-Allotransplantation (VCA) ist ein sich entwickelnder rekonstruktiver Weg zum Transfer mehrerer Gewebe als zusammengesetzte Untereinheit. Trotz der vielversprechenden Natur von VCA sind die langfristigen immunsuppressiven Anforderungen aufgrund des erhöhten Risikos von Malignomen, Endorgantoxizität und opportunistischen Infektionen eine signifikante Einschränkung. Das Tissue Engineering von azellulären Kompositgerüsten ist eine mögliche Alternative zur Verringerung des Bedarfs an Immunsuppression. Hierin wird die Beschaffung eines Rattenhinterbeins und dessen anschließende Dezellularisierung unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat (SDS) beschrieben. Die vorgestellte Beschaffungsstrategie basiert auf der Arteria femoralis. Ein maschinelles perfusionsbasiertes Bioreaktorsystem wurde konstruiert und zur ex vivo Dezellularisierung der Hinterbeine eingesetzt. Eine erfolgreiche Perfusionsdezellularisierung wurde durchgeführt, was zu einem weißen, durchscheinenden Aussehen der Hinterbeine führte. Ein intaktes, perfusierbares, vaskuläres Netzwerk in der gesamten Hinterbeine wurde beobachtet. Histologische Analysen zeigten die Entfernung von Kerninhalten und die Erhaltung der Gewebearchitektur über alle Gewebekompartimente hinweg.

Einleitung

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VCA ist eine neue Option für Patienten, die eine komplexe chirurgische Rekonstruktion benötigen. Traumatische Verletzungen oder Tumorresektionen führen zu einem volumetrischen Gewebeverlust, der schwer zu rekonstruieren ist. VCA bietet die Transplantation mehrerer Gewebe wie Haut, Knochen, Muskeln, Nerven und Gefäße als zusammengesetztes Transplantat von einem Spender an einen Empfängeran 1. Trotz seiner vielversprechenden Natur ist VCA aufgrund langfristiger immunsuppressiver Therapien begrenzt. Der lebenslange Gebrauch solcher Medikamente führt zu einem erhöhten Risiko für opportunistische Infektionen, Malignome und Endorgantoxizität

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Protokoll

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Leichenförmige männliche Lewis-Ratten (300-430 g), die vom Toronto General Hospital Research Institute erhalten wurden, wurden für alle Experimente verwendet. Für alle chirurgischen Eingriffe wurden sterile Instrumente und Verbrauchsmaterialien verwendet, um die aseptische Technik aufrechtzuerhalten (siehe Materialtabelle). Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care Committee am Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network (Toronto, ON, Kanada) durchgeführt. Insgesamt vier Hinterbeine waren dezellularisiert.

1. Präoperative Vorbereitung

  1. B....

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Ergebnisse

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Das Beschaffungsprotokoll war erfolgreich bei der Isolierung und Kanülierung der gemeinsamen Oberschenkelarterien für nachfolgende Perfusionsschritte. Die repräsentativen Dissektionsbilder in Abbildung 1A,B zeigen die Inzisionslage und Exposition der Femurgefäße mit ausreichendem Abstand zu den Bifurkationspunkten. Abbildung 2 zeigt die Apparatur, die für die Vorbereitung des Bioreaktors und des Perfusionskreislaufs erforderlich ist. Der Endpunk.......

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Diskussion

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Rattenhinterbeine sind als experimentelle Modelle in VCA5 nützlich. Das Tissue Engineering von azellulären Gerüsten stellt den ersten Schritt dar, um die Mängel langfristiger Immunsuppressionsregime im Zusammenhang mit VCA zu beheben. Die Verwendung von Komposittransplantaten stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, da mehrere Gewebe vorhanden sind, von denen jedes einzigartige funktionelle, immunogene und strukturelle Eigenschaften aufweist. Das vorliegende Protokoll zeigt eine erfolgreiche M.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Abbildung 3A wurde BioRender.com erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9 % Natriumchlorid-Injektion USP 50 mLBaxter CorporationJB1308M
1 mL serologische EinwegpipettenVWR75816-102
10 cc Einwegspritzenvon der Forschungseinrichtung
erhalten 3-Wege-Absperrhahnvon der Forschungseinrichtung
5cc EinwegspritzenGewonnen von der Forschungseinrichtung
70% IsopropylalkoholGewonnen von der Forschungseinrichtung
Acrodisc Spritzenfilter 0,2 & Mikro; mVWRCA28143-310
Adson-Pinzette, geradeFine Science Tools11006-12
Angiokatheter 24 G 19 mm (¾ ”) VWR38112
Antibiotisch-antimykotische Lösung (100x) 100 mLMulticell450-115-EL
KnochenschneiderFine Science Tools12029-12
Anschlüsse für 1/16" auf 1/8" RöhrchenMcMasterCarr5117K52
Luer-auf-Widerhaken-Adapter (PVDF) - 1/8" IDMcMasterCarr51525K328
Feine PinzetteFine Science Tools11254-20
Feine Pinzette mit mikrostumpfen SpitzenFine Science Tools11253-20
Heparin-Natrium-Injektion 10.000 IE/10 mLLEO Pharma Inc.006174-09
Luer-auf-Widerhaken-Adapter (PVDF) - 1/8" IDMcMasterCarr51525K322
MikronadelhalterWLorenz04-4125
MikroschereWLorenzSP-4506
PeressigsäureSigma Aldrich269336-100ML
Schlauchpumpe, 3-KanalCole ParmerRK-78001-68
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x 500 mLWisent311-425-CL
Povidon Chirurgische Peeling-Lösungder Forschungseinrichtung
, 3-Stopp, Tygon E-LFLCole ParmerRK-96450-40
Pumpenschlauch, platingehärtetes SilikonCole ParmerRK-96410-16
Skalpellklinge - #10Fine Science Tools10010-00
Skalpellgriff - #3 Fine Science Tools10003-12
Natriumdodecylsulfat Reagenz Qualität: Reinheit: >99%, 1 kgBioshopSDS003.1
Chirurgisches Nahtmaterial #6-0CovidienVS889
, gewonnen aus Pumpenschläuchen

Referenzen

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  1. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  2. Duisit, J., et al.

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Schlagwörter

Vascularized Composite AllotransplantationRat Hindlimb DecellularizationPerfusion BioreactorEx Vivo PerfusionComposite Tissue EngineeringSodium Dodecyl SulfateMachine PerfusionExtracellular MatrixFemoral Artery CannulationHistological Analysis

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