In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.
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Methodenartikel
Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Früherkennung von Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) durch Zitrusbauern erleichtert ein frühzeitiges Eingreifen und verhindert die Ausbreitung von Krankheiten. Eine einfache Methode zur schnellen und tragbaren Huanglongbing (HLB) -Diagnose wird hier vorgestellt, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und einen Fluoreszenzreporter kombiniert, der die Nukleaseaktivität des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) -Systems nutzt. Die Sensitivität dieser Technik ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigte diese Methode ähnliche Ergebnisse wie qPCR, wenn Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen CLas-Nachweismethoden kann das hier vorgestellte Nachweisverfahren in 90 min abgeschlossen werden und arbeitet in einem isothermen Zustand, der den Einsatz von PCR-Geräten nicht erfordert. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden.
Einleitung
Huanglongbing (HLB) ist eine der problematischsten Zitruskrankheiten weltweit1. HLB wird durch die phloemkolonisierenden und anspruchsvollen Bakterien Candidatus Liberibacter spp. verursacht, einschließlich Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus und Ca. L. americanus 2. Die häufigste HLB-assoziierte Art in China und den USA ist CLas, die durch asiatische Zitruspsylliden (Diaphorina citri) oder durch Pfropfen übertragenwird 3. Nach der Infektion mit CLas zeigen Zitrusbäume einen Wachstumsrückgang bis zum Tod2. ....
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Protokoll
1. Aufbau des CLas-DETECTR
HINWEIS: Die Konstruktion von CLas-DETECTR ist ein vierstufiger Prozess: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und Ergebnisvisualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist in Abbildung 1A dargestellt.
- Lösungsvorbereitung
- Puffer A: 20 mM NaOH in 6% PEG 200 vorbereiten. Für 100 ml 113 mg NaOH und 6 g PEG 200 in 80 mlH2Oin einer Flasche geben. Die Flasche in einem Wasserbad bei 60 °C inkubieren, bis sich das gesamte PEG 200 aufgelöst hat. Dann fügen Sie H2O zu einem Volumen von 100 ml hinzu.....
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Ergebnisse
Hier haben wir eine tragbare Plattform, CLas-DETECTR, beschrieben, die die RPA- und CRISPR-Cas12a-Systeme kombiniert, um HLB im Feld zu diagnostizieren. Das Schema von CLas-DETECTR ist in Abbildung 1A dargestellt.
Wenn Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen (Abbildung 1B), für die das Vorhandensein von CLas durch PCR bestätigt wurde (Abbildung 1C), dem CLas-DETECTR-Test unterzogen wurden, wurde ein grünes Fluoreszenzsignal in der .......
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Diskussion
Diese Studie stellt eine schnelle und tragbare Methode zum Nachweis von CLas namens CLas-DETECTR vor, die die Systeme RPA und CRISPR-Cas12a kombiniert. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. CLas-DETECTR erkennt CLas mit Spezifität und Sensitivität (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus detektiert CLas-DETECTR mithilfe von Newhall-Blattproben CLas mit der gleichen Empfindlichkeit wie qPCR (
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch das National Key R & D Program of China (2021YFD1400805), das Major Science and Technology R & D Program der Provinz Jiangxi (20194ABC28007), Projects of Jiangxi Education Department (GJJ201449) und die Collaborative Innovation of Modern Agricultural Scientific Research in Jiangxi Province (JXXTCX2015002(3+2)-003).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AxyPrep DNA-Gel-Extraktionskit | Corning | 09319KE1 | China |
| Bakterielles genomisches DNA-Extraktionskit | Solarbio | D1600 | China |
| EnGen LbCas12a | TOLOBIO | 32104-01 | China |
| Ex Taq Version 2.0 plus Farbstoff | TaKaRa | RR902A | China |
| Handheld-Fluoreszenz-Detektionsgerät | LUYOR | 3415RG | China |
| Locher | Deli | 114 | China |
| Magnesiumacetat, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
| NaOH | SCR | 10019718 | China |
| NEB Puffer 3,1 | NEB | B7203 | USA |
| PCR-Streifenröhrchen | LABSELECT | PST-0208-FT-C | China |
| PEG 200 | Sigma | P3015 | USA |
| PrimeSTAR Max DNA Polymeras | TaKaRa | R045A | China |
| Quick-Load Lila 1 kb Plus DNA Leiter | New England Biolabs | N0550S | USA |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820B | China |
| TwistAmp Basic | TwistDx | TABAS03KIT | Deutschland |
Referenzen
- Ma, W. X., et al. Citrus Huanglongbing is a pathogen-triggered immune disease that can be mitigated with antioxidants and gibberellin. Nature Communications. 13 (1), 529(2022).
- Bové, J. M. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
