Freilandfähiger Candidatus liberibacter asiaticus-Nachweis mittels Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a

Summary

In dieser Arbeit wurde eine schnelle, empfindliche und tragbare Nachweismethode für Candidatus Liberibacter asiaticus entwickelt, die auf Rekombinase-Polymerase-Amplifikation in Kombination mit CRISPR-Cas12a basiert.

Abstract

Die Früherkennung von Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) durch Zitrusbauern erleichtert ein frühzeitiges Eingreifen und verhindert die Ausbreitung von Krankheiten. Eine einfache Methode zur schnellen und tragbaren Huanglongbing (HLB) -Diagnose wird hier vorgestellt, die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation und einen Fluoreszenzreporter kombiniert, der die Nukleaseaktivität des Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR-associated 12a (CRISPR-Cas12a) -Systems nutzt. Die Sensitivität dieser Technik ist viel höher als die PCR. Darüber hinaus zeigte diese Methode ähnliche Ergebnisse wie qPCR, wenn Blattproben verwendet wurden. Im Vergleich zu herkömmlichen CLas-Nachweismethoden kann das hier vorgestellte Nachweisverfahren in 90 min abgeschlossen werden und arbeitet in einem isothermen Zustand, der den Einsatz von PCR-Geräten nicht erfordert. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch ein tragbares Fluoreszenzdetektionsgerät im Feld visualisiert werden.

Introduction

Huanglongbing (HLB) ist eine der problematischsten Zitruskrankheiten weltweit¹. HLB wird durch die phloemkolonisierenden und anspruchsvollen Bakterien Candidatus Liberibacter spp. verursacht, einschließlich Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), Ca. L. africanus und Ca. L. americanus ². Die häufigste HLB-assoziierte Art in China und den USA ist CLas, die durch asiatische Zitruspsylliden (Diaphorina citri) oder durch Pfropfen übertragen^{wird 3}. Nach der Infektion mit CLas zeigen Zitrusbäume einen Wachstumsrückgang bis zum Tod². ....

Protocol

1. Aufbau des CLas-DETECTR

HINWEIS: Die Konstruktion von CLas-DETECTR ist ein vierstufiger Prozess: Lösungsvorbereitung, Gesamt-DNA-Isolierung von Zitrusfrüchten, isotherme DNA-Amplifikation und Ergebnisvisualisierung. Das Schema des CLas-DETECTR-Assays ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Lösungsvorbereitung
   1. Puffer A: 20 mM NaOH in 6% PEG 200 vorbereiten. Für 100 ml 113 mg NaOH und 6 g PEG 200 in 80 ml_H2Oin einer Flasche geben. Die Flasche in einem Wasserbad bei 60 °C inkubieren, bis sich das gesamte PEG 200 aufgelöst hat. Dann fügen Sie H₂O zu einem Volumen von 100 ml hinzu.....

Results

Hier haben wir eine tragbare Plattform, CLas-DETECTR, beschrieben, die die RPA- und CRISPR-Cas12a-Systeme kombiniert, um HLB im Feld zu diagnostizieren. Das Schema von CLas-DETECTR ist in Abbildung 1A dargestellt.

Wenn Blattproben von HLB-infizierten und HLB-nicht infizierten Newhall-Bäumen (Abbildung 1B), für die das Vorhandensein von CLas durch PCR bestätigt wurde (Abbildung 1C), dem CLas-DETECTR-Test unterzogen wurden, wurde ein grünes Fluoreszenzsignal in der .......

Discussion

Diese Studie stellt eine schnelle und tragbare Methode zum Nachweis von CLas namens CLas-DETECTR vor, die die Systeme RPA und CRISPR-Cas12a kombiniert. Der Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. CLas-DETECTR erkennt CLas mit Spezifität und Sensitivität (Abbildung 2 und Abbildung 3). Darüber hinaus detektiert CLas-DETECTR mithilfe von Newhall-Blattproben CLas mit der gleichen Empfindlichkeit wie qPCR (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AxyPrep DNA-Gel-Extraktionskit	Corning	09319KE1	China
Bakterielles genomisches DNA-Extraktionskit	Solarbio	D1600	China
EnGen LbCas12a	TOLOBIO	32104-01	China
Ex Taq Version 2.0 plus Farbstoff	TaKaRa	RR902A	China
Handheld-Fluoreszenz-Detektionsgerät	LUYOR	3415RG	China
Locher	Deli	114	China
Magnesiumacetat, MgOAc	TwistDx	TABAS03KIT	UK
NaOH	SCR	10019718	China
NEB Puffer 3,1	NEB	B7203	USA
PCR-Streifenröhrchen	LABSELECT	PST-0208-FT-C	China
PEG 200	Sigma	P3015	USA
PrimeSTAR Max DNA Polymeras	TaKaRa	R045A	China
Quick-Load Lila 1 kb Plus DNA Leiter	New England Biolabs	N0550S	USA
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	TaKaRa	RR820B	China
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT	Deutschland