Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Brandy N. Curtis; Ellysa J. D. Vogt; Kevin S. Cannon; Amy S. Gladfelter

doi:10.3791/64090

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Methodenartikel

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

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DOI:

10.3791/64090

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28. Juli 2022

Brandy N. Curtis^*¹ , Ellysa J. D. Vogt^*² , Kevin S. Cannon¹^,³ , Amy S. Gladfelter¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill, ²Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, ³Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Zusammenfassung

Die meisten Zellen können ihre Form wahrnehmen und verändern, um grundlegende Zellprozesse durchzuführen. Bei vielen Eukaryoten ist das Septin-Zytoskelett ein integraler Bestandteil bei der Koordination von Formveränderungen wie Zytokinese, polarisiertem Wachstum und Migration. Septine sind filamentbildende Proteine, die sich zu verschiedenen Strukturen höherer Ordnung zusammensetzen und in vielen Fällen in verschiedenen Bereichen der Plasmamembran vorkommen, insbesondere in Regionen mit positiver Krümmung im Mikrometerbereich. Die Überwachung des Prozesses der Septinmontage in vivo wird durch die Einschränkungen der Lichtmikroskopie in Zellen sowie durch die Komplexität der Wechselwirkungen mit Membranen und Zytoskelettelementen behindert, was es schwierig macht, die Septindynamik in lebenden Systemen zu quantifizieren. Glücklicherweise gab es in den letzten zehn Jahren erhebliche Fortschritte bei der Rekonstitution des Septin-Zytoskeletts in einem zellfreien System, um die Mechanismen zu sezieren, die die Septin-Assemblierung bei hohen räumlichen und zeitlichen Auflösungen steuern. Die Kernschritte der Septin-Assemblierung umfassen die Septin-Heterooligomer-Assoziation und Dissoziation mit der Membran, die Polymerisation in Filamente und die Bildung von Strukturen höherer Ordnung durch Wechselwirkungen zwischen Filamenten. Hier stellen wir drei Methoden vor, um die Septinmontage in verschiedenen Kontexten zu beobachten: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen. Diese Methoden können verwendet werden, um die biophysikalischen Parameter von Septinen in verschiedenen Stadien der Montage zu bestimmen: als einzelne Oktamere, die die Membran binden, als Filamente und als Anordnungen von Filamenten. Wir verwenden diese Parameter gepaart mit Messungen der Krümmungsprobenahme und der bevorzugten Adsorption, um zu verstehen, wie die Krümmungsmessung auf einer Vielzahl von Längen- und Zeitskalen funktioniert.

Einleitung

Die Formen der Zellen und viele ihrer inneren Kompartimente hängen von den Lipidmembranen ab, die sie umgeben. Membranen sind viskoelastische Strukturen, die durch Wechselwirkungen mit Proteinen, Lipidsortierung und wirkende innere und äußere Kräfte verformt werden können, um eine Vielzahl von Formen^{zu erzeugen} 1,2,3,4. Diese Formen werden oft in Form von Membrankrümmung beschrieben. Zellen verwenden eine Vielzahl von Proteinen, die in der Lage sind, sich bevorzugt auf bestimmte Membrankrümmungen zu setzen oder diese zu "erfassen", um eine d....