Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.
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Methodenartikel
Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mit einer düsteren mittleren Überlebenszeit in realen Populationen - zwischen 6 und 15 Monaten - ist das Glioblastom (GBM) der verheerendste bösartige Hirntumor. Das Behandlungsversagen ist hauptsächlich auf die Invasivität der GBM-Zellen zurückzuführen, was für die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der beweglichen Eigenschaften von GBM spricht. Um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die GBM-Invasion unterstützt, sind neue physiologische Modelle erforderlich, die eine eingehende Charakterisierung der Proteindynamik während der Invasion ermöglichen. Diese Beobachtungen würden den Weg zur Entdeckung neuer Ziele ebnen, um die Tumorinfiltration zu blockieren und die Patientenergebnisse zu verbessern. Dieser Artikel berichtet, wie ein orthotopes Xenotransplantat von GBM-Zellen im Zebrafischgehirn subzelluläre intravitale Live-Bildgebung ermöglicht. Wir konzentrieren uns auf Mikrotubuli (MTs) und beschreiben ein Verfahren zur MT-Markierung in GBM-Zellen, zur Mikroinjektion von GBM-Zellen in das transparente Gehirn von Zebrafischlarven 3 Tage nach der Befruchtung (dpf), zur intravitalen Bildgebung von MTs in den sich ausbreitenden Xenotransplantaten, zur Veränderung der MT-Dynamik, um ihre Rolle während der GBM-Invasion zu bewerten, und zur Analyse der erfassten Daten.
Einleitung
Zellmotilität ist ein stereotyper Prozess, der die Etablierung der Polaritätsachse und krafterzeugende Umlagerungen des Zytoskeletts erfordert. Die Aktinpolymerisation und ihre Assoziation mit Myosin gelten als die Hauptursachen für protrusive und kontraktile Kräfte, die für die Zellbewegung erforderlich sind1. Mikrotubuli gelten als Hauptakteure der Zellpolarisation und der gerichteten Persistenz während der Migration2. In den letzten Jahren wurde auch gezeigt, dass MTs Vorsprünge erzeugen und stabilisieren, um mechanokompressive Kräfte während der Zellinvasion in 3D3 zu unterstützen. In jüngerer....
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Protokoll
Tierversuche wurden nach den Richtlinien der Europäischen Union für den Umgang mit Versuchstieren durchgeführt. Alle Protokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Institut Pasteur - CEEA 89 und dem französischen Ministerium für Forschung und Bildung (Genehmigung #01265.03) genehmigt. Während der Injektionen oder Live-Bildgebungssitzungen wurden die Tiere mit Tricaine.At am Ende der experimentellen Verfahren betäubt, sie wurden durch eine anästhetische Überdosierung eingeschläfert. Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien, Geräten und Software finden Sie in der Materialtabelle . Der allgemeine Workflow d....
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Ergebnisse
Um die Rolle von MTs während der in vivo GBM-Invasion zu analysieren, beschreiben wir hier die wichtigsten Schritte zur Durchführung einer stabilen MT-Markierung in GBM-Zellen durch lentivirale Infektion, orthotope Xenotransplantation von GBM-Zellen in 3 dpf Zebrafischlarven, hochauflösende intravitale Bildgebung der MT-Dynamik, MTA-Behandlung und ihre Auswirkungen auf die GBM-Invasion sowie Bildanalyse der MT-Dynamik und In-vivo-Invasion (Abbildung 1). D.......
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Diskussion
Die Bildgebung von Tumor-Xenotransplantaten mit Einzelzellauflösung wird wahrscheinlich zu einem unverzichtbaren Werkzeug, um unser Verständnis der GBM-Biologie zu verbessern. Live-Bildgebung in Maus-PDX-Modellen hat zu wertvollen Entdeckungen darüber geführt, wie GBM kollektiv in das Hirngewebe eindringt18. Bisher ist die raumzeitliche Auflösung jedoch nicht hoch genug, um die Dynamik von Proteinen aufzudecken, die die GBM-Invasion steuern. Wir argumentierten, dass durch die Kopplung der orthotop.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. P. Herbomel (Institut Pasteur, Frankreich) und seinem Labor, insbesondere Valérie Briolat, und Emma Colucci-Guyon für die Bereitstellung der Zebrafischlinien und der Kunststoffform für Mikroinjektionsplatten sowie für ihr wertvolles Know-how über experimentelle Verfahren von Zebrafischen. Wir danken dem UtechS Photonic BioImaging (C2RT, Institut Pasteur, unterstützt von der französischen National Research Agency France BioImaging, und ANR-10-INBS-04; Investitionen in die Zukunft). Diese Arbeit wurde von der Ligue contre le cancer (EL2017. LNCC), dem Centre National de la Recherche Scientific und dem Institut Pasteur sowie durch die großzügigen Spenden v....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Glioblastom-Zellkultur | |||
| Fötales Kälberserum | Eurobio | CVFSVF00-01 | Reagenz |
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | Reagenz |
| Modifiziertes Eagle's Medium | Eurobio | CM1MEM18-01 | Reagenz |
| Penicillin– Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagenz |
| U-87 MG | ECACC | 89081402-1VL | Cells |
| Lenitivirus production | |||
| BD FACSAria III | BD bioscience | Instrument | |
| BD FACSDiva software v8.0 | BD bioscience | Software | |
| HEK-293T | Merck | 12022001 | Zellen |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | Reagenz |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | Reagenz |
| Ultrazentrifuge Optima XPN-80 | Beckman Coulter | Instrument | |
| Zellpassage und Färbung | |||
| dPBS | Gibco | 14190-094 | Chemisch |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Chemikalie |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco | 25300-054 | Reagenz |
| Zebrafischzucht | |||
| Fluoreszenz-Stereomikroskop LEICA M165FC | LEICA | https://www.leica-microsystems.com/fr/produits/stereomicroscopes-et-macroscopes/informations-detaillees/leica-m165-fc/ | Instrument |
| Methylenblau-Hydrat | Sigma-Aldrich | M4159 | Chemikalie |
| N-Phenylthioharnstoff (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-25G | |
| Chemischer Transfer Pipetten feine Spitzen | Samco Scientific | 232 | |
| Gerätetransfer Pipetten Large Bulb3mL | Samco Scientific | 225 | Ausrüstung |
| Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat) | Sigma-Aldrich | Cat#: A5040 | Chemical |
| Volvic Source Water | DUTSCHER DOMINIQUE SAS | Reagenz | |
| Xenotransplantation | |||
| 24-Well-Platte | TPP | 92024 | Ausrüstung |
| Kapillaren aus Borosilikatglas (1.0 ODx0.58IDx150L mm) | Harvard Apparatur | (#30-0017 GC100-15 | Ausrüstung |
| CellTram Öl Vario Mikroinjektor | Eppendorf | 5176000.025 | Instrument |
| Microloading Pipettenspitzen (Microloader) 20µ L | Eppendorf | 5242956003 | Equipment |
| Mikromanipulator | NARISHIGE | https://products.narishige-group.com/group1/injection/english.html | Equipment |
| Mineralöl | Sigma | M8410-100ml | Equipment |
| Stereomikroskop | Olympus | KL 2500 LCD | Instrument |
| Universal Kapillarhalter | Eppendorf | 5176190002 | Equipment |
| Vertikaler Pipettenabzieher | KOPF (Roucaire) | Modell 720 | Instrument |
| Intravital Imaging3,5cm | |||
| Video-Schüssel mit Glasboden | MatTek Life Sciences, MA, USA | P35G-1,5-14-C | |
| Software zur Geräteerfassung: NIS-Elements-AR Version 5.21 | Nikon | Software | |
| Heat-Block | Techne | DRI-BLOCK DB-2D | Equipment |
| Mikroskopkopf Nikon Ti2E | Nikon | Instrument | |
| sCMOS Kamera Prime 95B | Photometrics | Instrument | |
| sCMOS Kamera Orca Flash 4 | Hammatsu | Instrument | |
| Ultrapure Low | point Agarose Invitrogen | 16520-050 | Chemical |
| Yokagawa CSU-W1 Spinning Disk Einheit | Hammatsu | Instrument | |
| Drug Treatment | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Chemikalie |
| Nocodazol | Sigma-Aldrich | M1404-2MG | Chemisch |
| Bildanalyse | |||
| Imaris 9.5.1 Software | Oxford Instruments | Software | |
| ImarisFileConverter 9.5.1 | Oxford Instruments | Software |
Referenzen
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Etienne-Manneville, S. Microtubules in cell migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 471-499 (2013).
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Nachdrucke und Genehmigungen
