Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

Miao Huang; Heyang Wang; Alfredo A. Delgado; Tyler A. Reid; Julian Long; Shu Wang; Hayley Sussman; Juan Guan; Hitomi Yamaguchi; Xin Tang

doi:10.3791/64098

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Methodenartikel

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

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DOI:

10.3791/64098

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5. Juli 2022

Miao Huang¹^,⁵ , Heyang Wang¹^,⁵ , Alfredo A. Delgado¹ , Tyler A. Reid¹ , Julian Long² , Shu Wang³^,⁵ , Hayley Sussman⁴ , Juan Guan⁵^,⁶^,⁷ , Hitomi Yamaguchi¹ , Xin Tang¹^,⁵^,⁸^,⁹

¹Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Herbert Wertheim College of Engineering, University of Florida, ²Department of Materials Science and Engineering, University of Florida, ³Department of Biostatistics, University of Florida, ⁴Department of Biomedical Engineering, College of Engineering (COE), University of Delaware (UD), ⁵UF Health Cancer Center, University of Florida, ⁶Department of Physics, College of Liberal Arts and Sciences, University of Florida, ⁷Department of Anatomy and Cell Biology, College of Medicine, University of Florida, ⁸J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida, ⁹Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Zusammenfassung

Eine grundlegende Frage in der Mechanobiologie ist, wie lebende Zellen extrazelluläre mechanische Reize im Kontext der Zellphysiologie und -pathologie wahrnehmen. Es wird angenommen, dass die zelluläre Mechano-Empfindung extrazellulärer mechanischer Reize durch die Membranrezeptoren, den zugehörigen Proteinkomplex und das Zytoskelett erfolgt. Jüngste Fortschritte in der Mechanobiologie zeigen, dass der Zellkern im Zytoplasma selbst selbstständig mechanische Reize gleichzeitig wahrnehmen kann. Ein mechanistisches Verständnis darüber, wie der Zellkern mechanische Reize wahrnimmt, umleitet und darauf reagiert, fehlt jedoch, hauptsächlich aufgrund der technischen Herausforderungen beim Zugriff auf und der Quantifizierung der Kernmechanik mit herkömmlichen Werkzeugen. Dieses Papier beschreibt das Design, die Herstellung und die Implementierung eines neuen magnetischen Kraftaktors, der präzise und nicht-invasive mechanische 3D-Reize anwendet, um den Zellkern direkt zu verformen. Unter Verwendung von CRISPR/Cas9-Zellen zeigt diese Studie, dass dieses Werkzeug in Kombination mit hochauflösender konfokaler fluoreszierender Bildgebung die Aufdeckung der Echtzeitdynamik eines mechanosensitiven yes-assoziierten Proteins (YAP) in einzelnen Zellen als Funktion der Kernverformung ermöglicht. Diese einfache Methode hat das Potenzial, die derzeitige Technologielücke in der Mechanobiologie zu schließen und Antworten auf die Wissenslücke zu geben, die in der Beziehung zwischen Kernmechanotransduktion und Zellfunktion besteht.

Einleitung

Diese Studie zielt darauf ab, eine neue Technik zur Aufklärung der Kernmechanobiologie zu entwickeln und anzuwenden, indem die magnetischen Aktoren, die mechanische Kraft direkt auf den Zellkern ausüben, und die konfokale Fluoreszenzmikroskopie, die gleichzeitig die strukturellen und funktionellen subzellulären Veränderungen abbildet, kombiniert werden. Zellen erfassen extrazelluläre biophysikalische Signale einschließlich Gewebesteifigkeit ^1,2,3,4, interstitiellen Flüssigkeitsdruck und Scherspannung